系統(tǒng)性紅斑狼瘡的分子標(biāo)志物研究進(jìn)展

楊再興，梁艷

(1.臺州市第一人民醫(yī)院、溫州醫(yī)科大學(xué)附屬黃巖醫(yī)院檢驗(yàn)科，浙江臺州 318020； 2.上海長征醫(yī)院實(shí)驗(yàn)診斷科，上海 200003)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡的分子標(biāo)志物研究進(jìn)展

楊再興1，梁艷2

(1.臺州市第一人民醫(yī)院、溫州醫(yī)科大學(xué)附屬黃巖醫(yī)院檢驗(yàn)科，浙江臺州 318020； 2.上海長征醫(yī)院實(shí)驗(yàn)診斷科，上海 200003)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)的實(shí)驗(yàn)室診斷和病情判斷主要依賴于抗核抗體、抗雙鏈DNA(dsDNA)、抗Sm、抗磷脂抗體等自身抗體。但這些自身抗體存在敏感性或特異性差的缺陷，大大限制其臨床價(jià)值。因此，迫切需要研發(fā)一些新技術(shù)及新標(biāo)志物來解決這些問題。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，大量新的分子標(biāo)志物被發(fā)現(xiàn)并鑒定，有望為提升SLE臨床診療水平提供新契機(jī)。該文概括性綜述了近年來在SLE中新發(fā)現(xiàn)的各種分子標(biāo)志物，包括基因轉(zhuǎn)錄、變異譜、表觀遺傳譜、游離基因分子譜、胞外顆粒表達(dá)譜等，并對這些分子標(biāo)志物的應(yīng)用前景和存在的問題進(jìn)行討論。

系統(tǒng)性紅斑狼瘡；分子生物學(xué)；標(biāo)志物

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)是一種典型的系統(tǒng)性自身免疫性疾病，常表現(xiàn)為慢性進(jìn)行性炎癥損傷，可累及全身多個(gè)組織器官。血清中特異性自身抗體陽性是SLE的一個(gè)重要特征。SLE患者血清中可以出現(xiàn)多種自身抗體，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，在SLE患者血清中已經(jīng)檢測出的自身抗體達(dá)200余種。目前臨床上最為常用，對SLE具有重要臨床意義的自身抗體包括抗核抗體(ANA)、抗雙鏈DNA(dsDNA)、抗Sm、抗核小體、抗核糖體P蛋白、抗組蛋白、抗磷脂抗體等抗體。其中ANA、抗dsDNA、抗Sm、抗磷脂(包括心磷脂和β2糖蛋白1)抗體已被納入SLE的國際診斷指南，抗dsDNA和抗核小體抗體還可以監(jiān)測病情和判斷療效。但這些自身抗體在臨床診斷應(yīng)用過程中都存在明顯缺陷，有的敏感性高，但特異性差，如ANA；有的則相反，如抗dsDNA、抗Sm等抗體。SLE具有明顯的個(gè)體異質(zhì)性，臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，依靠這些自身抗體進(jìn)行輔助診斷、病情判斷、療效觀察和預(yù)后推測很難達(dá)到預(yù)期效果，迫切需要建立新技術(shù)和發(fā)現(xiàn)新的標(biāo)志物來解決這些問題。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，大量新技術(shù)應(yīng)用于臨床研究和診斷，也為發(fā)現(xiàn)和鑒定SLE的分子標(biāo)志物，提高SLE的臨床診療水平提供了新的契機(jī)。

1 最新分子生物學(xué)技術(shù)助力SLE核酸分子標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)和深入研究

自從發(fā)現(xiàn)DNA分子雙螺旋結(jié)構(gòu)以來，分子生物學(xué)技術(shù)及其相關(guān)技術(shù)如生物信息學(xué)、微電子材料學(xué)、大數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)等取得了突飛猛進(jìn)的發(fā)展。這些技術(shù)在疾病分子標(biāo)志物的挖掘和功能探討中發(fā)揮巨大作用，已逐漸成為臨床和實(shí)驗(yàn)室診斷研究中的重要熱點(diǎn)和最新趨勢。其中最為突出的是PCR、基因測序和基因雜交技術(shù)的發(fā)明和不斷的演化、進(jìn)步以及相互融合。PCR技術(shù)已實(shí)現(xiàn)了從一代(PCR與電泳技術(shù)相結(jié)合)到二代(熒光定量PCR技術(shù))再到三代PCR(數(shù)字PCR)的迅速更新和發(fā)展，分析更加微量化、高通量和準(zhǔn)確化。測序技術(shù)也迅速從一代(Sanger測序及其衍生的熒光自動(dòng)測序技術(shù))發(fā)展為二、三代(深度測序、單分子測序)，也實(shí)現(xiàn)了更加微量化和高通量，大大縮短了反應(yīng)時(shí)間，顯著節(jié)約成本。而且，二、三代測序技術(shù)以意想不到的速度迅速成為臨床研究和診斷重要工具，即將成為臨床常規(guī)分子檢驗(yàn)的新技術(shù)?；螂s交技術(shù)從單基因雜交(如Southern blot、northern blot、原位雜交等)快速發(fā)展成為以基因芯片為核心，融合其他多種技術(shù)方法的高通量、快速分子檢測技術(shù)。這些技術(shù)的快速發(fā)展和不斷融合，催生和加速了全新研究方法的出現(xiàn)和發(fā)展，如基因表達(dá)譜和變異譜研究、全基因組關(guān)聯(lián)研究(genome-wide association studies, GWAS)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究、表觀遺傳組學(xué)研究、微生態(tài)組學(xué)研究和蛋白質(zhì)組學(xué)研究(包括蛋白質(zhì)芯片和氣-質(zhì)聯(lián)檢技術(shù)的應(yīng)用)等。這些方法在SLE的病因、遺傳、發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)、致病機(jī)制、精準(zhǔn)診療等多個(gè)方面研究中得到了廣泛的應(yīng)用，對于SLE相關(guān)分子標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)和深入研究具有極為重要的意義[1]。

2 SLE相關(guān)分子標(biāo)志物的研究現(xiàn)狀

盡管已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在SLE中存在大量表達(dá)或結(jié)構(gòu)異常的核酸分子，但目前尚無確定的SLE相關(guān)核酸分子標(biāo)志物。本文所提的SLE相關(guān)分子標(biāo)志物即是指在SLE中表達(dá)異常、存在基因變異、表觀遺傳變化、胞外游離或顆粒中異常增加的基因分子。

2.1 SLE相關(guān)的基因表達(dá)譜 對 SLE相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA的研究經(jīng)歷了一個(gè)從對單個(gè)基因表達(dá)水平的探討到同時(shí)高通量檢測多個(gè)基因表達(dá)水平的發(fā)展過程。在這一過程中，發(fā)現(xiàn)了多種在SLE中表達(dá)異常的基因。其中，最重要、與SLE關(guān)系最密切、幾乎已經(jīng)肯定參與SLE發(fā)病的基因是Ⅰ型干擾素(包括IFN-α、β、δ、ε、κ、τ、ω)轉(zhuǎn)錄標(biāo)簽，現(xiàn)已明確，包括Ⅰ型干擾素及其上下游通路的重要調(diào)節(jié)分子的基因表達(dá)水平在SLE中均存在明顯異常變化[如多種干擾素調(diào)節(jié)因子(interferon regulatory factors，IRF)等多達(dá)350種左右的信號分子]，而且能夠在不同程度上反映病情和監(jiān)測療效[2]。Munroe等[3]發(fā)現(xiàn)，IFN-α活性升高出現(xiàn)在SLE發(fā)病前，可以預(yù)測SLE的發(fā)生，并與SLE特異性自身抗體如抗dsDNA、抗Sm等自身抗體的出現(xiàn)密切相關(guān)。該研究還發(fā)現(xiàn)，IFN-γ水平升高比IFN-α活性升高和SLE特異性自身抗體出現(xiàn)的時(shí)間還要早，提示檢測IFN-α活性和IFN-γ水平對于預(yù)測和及早發(fā)現(xiàn)和診治SLE具有重要意義。除了干擾素轉(zhuǎn)錄標(biāo)簽外，與SLE關(guān)系密切的分子還包括B淋巴細(xì)胞刺激因子(B lymphocyte stimulator，Blys)、IL-6、IL-17、IL-18、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、CD20、Wnt/β-catenin通路相關(guān)分子等[4]。在SLE中表達(dá)變化的分子多達(dá)幾百種，但每一種分子對SLE的臨床應(yīng)用價(jià)值并不理想，如何能夠聯(lián)合這些分子標(biāo)簽，充分發(fā)揮每種分子的最大效能，更好地鑒定癥狀復(fù)雜、診斷困難、病情多變的SLE，成為了相關(guān)研究者新的努力方向。一項(xiàng)最新研究在對SLE患者基因轉(zhuǎn)錄譜分析時(shí)，進(jìn)行了復(fù)雜的模塊化組合，結(jié)果發(fā)現(xiàn)干擾素標(biāo)簽和漿母細(xì)胞標(biāo)簽是反映SLE活動(dòng)度的較好標(biāo)志物；中性粒細(xì)胞相關(guān)成分轉(zhuǎn)錄譜主要富集于可能發(fā)展為活動(dòng)性狼瘡性腎炎(LN)的患者中，而且不同成分組合能夠反映不同亞型LN的治療效果。利用這種模塊化組合，有助于對異質(zhì)性復(fù)雜的SLE進(jìn)行精準(zhǔn)診療[5]。總之，深入探討這些分子作為SLE標(biāo)志物的重要意義體現(xiàn)在，一方面有助于SLE的輔助診斷和病情及療效判斷，另一方面，有助于指導(dǎo)建立以這些分子為靶向的SLE生物治療方法，如IL-6單抗Tocilizumab、Blys單抗Belimumab、TNF-α抑制物Infliximab和Etanercept、Ⅰ型干擾素抑制物Sifalimumab和Rontalizumab等都已成功用于SLE的臨床治療，而且取得了明顯的效果[6]。

2.2 SLE相關(guān)的基因變異譜 第一個(gè)鑒定的與SLE密切相關(guān)的遺傳位點(diǎn)位于主要組織相容性復(fù)合體(MHC)，至今，在所鑒定的所有遺傳變異中，MHC基因變異仍與SLE相關(guān)性最強(qiáng)[7]。隨著檢測技術(shù)不斷發(fā)展，特別是GWAS的廣泛應(yīng)用，已鑒定出大量SLE相關(guān)基因變異。除了MHC基因變異外，其他SLE相關(guān)變異按功能分，大體可分為4個(gè)方面：(1)淋巴細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)基因變異，包括T細(xì)胞和B細(xì)胞；(2)干擾素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)基因變異，主要是與核酸識別、干擾素誘導(dǎo)及對干擾素應(yīng)答的基因變異；(3)凋亡細(xì)胞及其細(xì)胞垃圾以及免疫復(fù)合物清除相關(guān)的基因變異；(4)其他功能尚無法歸類的基因變異[8-9]。每一個(gè)方面都包括多種基因變異，這些變異單獨(dú)或聯(lián)合影響著SLE的遺傳風(fēng)險(xiǎn)。但是，目前為止，尚未確定哪一種或幾種變異可以決定SLE發(fā)病。而且，很多變異都是SLE和其他疾病如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、糖尿病等的共同風(fēng)險(xiǎn)因素。這說明SLE是一個(gè)復(fù)雜性疾病，并非絕對遺傳病，非檢測一種或幾種基因變異就能解決。

2.3 SLE相關(guān)的表觀遺傳譜

2.3.1 組織及細(xì)胞基因分子譜 表觀遺傳修飾包括DNA甲基化、組蛋白修飾和非編碼RNA的調(diào)節(jié)作用。目前研究最多的非編碼RNA是微小RNA(microRNA，miRNA)、長鏈非編碼RNA(long no-coding RNA，lncRNA)和新近的熱點(diǎn)環(huán)狀RNA。關(guān)于DNA甲基化研究也經(jīng)歷了從單個(gè)基因甲基化，到覆蓋全基因組的甲基化研究，而且研究樣本的選擇也從籠統(tǒng)的外周血白細(xì)胞轉(zhuǎn)為精細(xì)研究外周血各種細(xì)胞群和亞群(如CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、B細(xì)胞、單核細(xì)胞等)。大量研究表明，在SLE中存在很多異常DNA甲基化，如外周血白細(xì)胞中Ⅰ型干擾素為代表的大量炎癥相關(guān)分子甲基化降低，與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞密切相關(guān)的插頭蛋白3基因調(diào)節(jié)性T細(xì)胞特異性去甲基化區(qū)(FOXP3 TSDR)甲基化增高，單核細(xì)胞、B細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞中干擾素調(diào)節(jié)因子(interferon regulatory factor, IRF)甲基化降低，CD4+T細(xì)胞中IL-4、IL-6、IL-10、IL-13、CD40L、CD70等多種與炎癥和免疫相關(guān)的分子甲基化降低等[10]。這些甲基化形式有利于促炎因素的過度活化，參與SLE發(fā)生發(fā)展。當(dāng)然，一些外周血細(xì)胞中的分子甲基化水平也可以作為分子標(biāo)志物有助于SLE的輔助診斷和病情判斷。我國學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，外周血細(xì)胞中干擾素誘導(dǎo)蛋白44(IFI44L)基因啟動(dòng)子區(qū)兩個(gè)位點(diǎn)低甲基化水平對SLE具有極好的診斷準(zhǔn)確性，兩個(gè)位點(diǎn)的敏感性可以分別達(dá)到93.6%和94.1%，特異性分別達(dá)到96.8%和98.2%[11]。此外，另有研究表明，CD11a、CD70、CD40L和穿孔素等分子基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平也有助于快速診斷和鑒別SLE[12]。此外，基因甲基化還具有潛在反映病情和預(yù)測器官損傷的功能,如調(diào)節(jié)性T細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子FOXP3基因甲基化水平增高提示SLE活動(dòng)性增加[13]，而IFI44L基因啟動(dòng)子去甲基化水平增高則提示SLE病情處于恢復(fù)期[11]。

組蛋白修飾包括乙?；?、甲基化、磷酸化和泛素化等。在SLE中已發(fā)現(xiàn)存在大量組蛋白修飾異常情況，如SLE患者CD4+T細(xì)胞中組蛋白H3、H4總乙酰化水平降低，影響近180個(gè)相關(guān)基因表達(dá)，而且H3乙?；脚cSLE活動(dòng)度密切相關(guān)[14]。目前關(guān)于組蛋白修飾異常在SLE中的作用機(jī)制研究較多，而探討其對SLE臨床價(jià)值的較少。miRNA是長度為20～30個(gè)核苷酸的單鏈小分子非編碼RNA，是表觀遺傳學(xué)調(diào)控中的重要成員。在SLE患者外周血細(xì)胞中存在大量miRNA異常表達(dá)，而且多數(shù)都與疾病活動(dòng)程度密切相關(guān)，如miR-148a、-126、-21和-155表達(dá)明顯升高，miR-31、-142s、-142-3p、-142-5p、-146a和-125a表達(dá)明顯降低[15]。血細(xì)胞中miRNA水平的影響因素較多，包括血細(xì)胞數(shù)量、組成比例(如T、B、單核細(xì)胞等)、活化狀態(tài)等，因此，不宜用作SLE的臨床標(biāo)志物。lncRNA是長度大于200個(gè)核苷酸的非編碼RNA，與miRNA一樣，lncRNA是重要的表觀遺傳學(xué)調(diào)控因子。目前關(guān)于lncRNA與SLE關(guān)系的研究還較少，僅發(fā)現(xiàn)linc0949和linc0597在SLE患者外周血細(xì)胞中表達(dá)降低，其中l(wèi)inc0949的降低水平與疾病活動(dòng)度、腎損傷等情況有關(guān)，并可以反映治療效果，核paraspeckle 小體裝配轉(zhuǎn)錄子1(nuclear paraspeckle assembly transcript，NEAT1)在單核細(xì)胞中表達(dá)升高[10,16]。關(guān)于環(huán)狀RNA在SLE中的情況，目前尚未見相關(guān)報(bào)道。

2.3.2 游離基因分子譜 此處所提到的“游離基因分子譜”指的是血漿或血清(所謂的循環(huán)中)及其他體液(如尿液、腦脊液等)中游離的DNA、miRNA和lncRNA。早在50年前，就有研究報(bào)道在SLE患者血清中檢測到DNA及抗DNA抗體。之后，又發(fā)現(xiàn)SLE血清或血漿中也存在異常升高的DNA或甲基化DNA分子，而且部分增高的游離DNA可以反映SLE疾病活動(dòng)度。特別是Chan等應(yīng)用基因組和甲基化組學(xué)測序方法在全基因組范圍對SLE患者血漿進(jìn)行了高分辨分析，發(fā)現(xiàn)SLE中檢測基因組代表(measured genomic representations，MGRs)異常，而且異常程度與抗dsDNA抗體水平密切相關(guān)，同時(shí)證實(shí)游離DNA片段長度越短，甲基化程度越低，患者病情活動(dòng)越強(qiáng)[17]。

SLE患者血漿中miR-21、-181a、-196a、-30e-5p、-92a-3p和miR-223-3p明顯上調(diào)，其中miR-196a對SLE輔助診斷價(jià)值較大，miR-21與疾病嚴(yán)重程度密切相關(guān)，miR-223-3p與SLE發(fā)生口腔潰瘍及出現(xiàn)狼瘡抗凝物有關(guān)[18-19]。SLE患者血清中miR-146a水平降低，與疾病活動(dòng)度及蛋白尿呈負(fù)相關(guān)，但尿液中的miR-146a明顯增加，并與腎小球?yàn)V過功能損傷相關(guān)[15]。兒童狼瘡性腎炎患者尿液中的miR-125a、-127、-146a、-150和155明顯升高，且與腎炎活動(dòng)度有關(guān)[20]。

游離DNA及其甲基化產(chǎn)物和miRNA相對比較穩(wěn)定，抽提、檢測方便，影響因素相對較少，可能是SLE臨床應(yīng)用最有前景的分子標(biāo)志物之一。

2.3.3 SLE相關(guān)的胞外顆粒表達(dá)譜 胞外顆粒是指外泌體、循環(huán)微粒、中性粒細(xì)胞胞外陷阱(NET)等。胞外顆粒作為載體，攜帶大量信息分子(包括miRNA)在細(xì)胞間進(jìn)行交流傳遞。這些胞外顆粒的數(shù)量變化和表達(dá)分子可能會(huì)成為SLE輔助診斷和病情監(jiān)測的潛在標(biāo)志。研究表明，LN患者尿液外泌體中miR-125a、-150、-155和-146升高，而miR-141、-192、-200a、-200c、-221、-222和-429明顯降低[21]。尿外泌體中的miR-29c對LN發(fā)生早期腎纖維化有較好預(yù)測價(jià)值，其預(yù)測敏感性和特異性分別為94%和82%[22]。循環(huán)微粒是另一種直徑為100～1 000 nm的胞外顆粒，SLE患者中循環(huán)微粒數(shù)量明顯增多，約為正常人2～10倍[23]。而且，循環(huán)微粒中的DNA膜滲透性更好，不易被DNA酶消化降解，因此更易誘發(fā)抗dsDNA抗體產(chǎn)生[24]。循環(huán)微粒及其含有的分子有望成為SLE新的分子標(biāo)志物。NET是中性粒細(xì)胞在一定刺激條件下釋放至胞外的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，內(nèi)含大量DNA、組蛋白及蛋白酶等物質(zhì)。在SLE中，NET明顯增多，推測其含有的DNA是SLE自身抗原的重要來源，而且NET在SLE發(fā)病中具有重要作用[25]，但NET及其含有的DNA是否能夠成為SLE的重要分子標(biāo)志，尚待進(jìn)一步探討。

2.4 其他 質(zhì)譜也是一項(xiàng)發(fā)展迅速而且在臨床應(yīng)用越來越廣泛的重要技術(shù)。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于SLE相關(guān)標(biāo)志物的挖掘研究，并且鑒定出至少200余種與SLE密切相關(guān)的蛋白質(zhì)標(biāo)志物[26]。這些標(biāo)志物對于SLE的輔助診斷、病情及組織器官損傷情況的判斷等可能具有重要的潛在應(yīng)用價(jià)值。因?yàn)楸疚闹赜懻揝LE相關(guān)的基因標(biāo)志物，對于此部分內(nèi)容并未展開。

3 問題與展望

已發(fā)現(xiàn)的SLE相關(guān)分子標(biāo)志物真正應(yīng)用到臨床常規(guī)檢驗(yàn)尚需時(shí)日。主要原因包括以下幾點(diǎn)。(1)分子標(biāo)志物本身對SLE的臨床價(jià)值仍然有限。盡管這些分子與SLE發(fā)病密切相關(guān)，有些也是SLE的重要風(fēng)險(xiǎn)因子，很多分子也成為SLE的重要治療靶點(diǎn)，但這些分子普遍對SLE特異性偏低，無法實(shí)現(xiàn)較好的輔助診斷作用。(2)關(guān)于基因變異的研究，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的陽性結(jié)果眾多，但有臨床意義的結(jié)果寥寥。而且，對于結(jié)果的分析和總結(jié)千頭萬緒，錯(cuò)綜復(fù)雜，絕大多數(shù)基因變異是多種自身免疫病共有的，難以找到最為關(guān)鍵的致病基因。(3)分子標(biāo)志物的檢測方法有待進(jìn)一步性能驗(yàn)證。如上所述的各種分子標(biāo)志物檢測方法都處于科研階段，其靈敏度、特異性、準(zhǔn)確度、精密度等很多性能指標(biāo)都沒有經(jīng)受過嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)。當(dāng)然，隨著重要的、臨床所必需的分子標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)，其檢測方法性能驗(yàn)證問題也將很快解決。

盡管還存在很多問題，但分子檢測已成為不可阻擋的潮流，必然會(huì)廣泛應(yīng)用到臨床。關(guān)于其在SLE中的發(fā)展趨勢，筆者認(rèn)為可能主要在以下幾個(gè)方面：(1)鑒定出具有重要診斷價(jià)值的分子標(biāo)志物，與自身抗體等目前常規(guī)檢測指標(biāo)相聯(lián)合，提高對SLE的診斷水平；(2)鑒定出大量分子標(biāo)志物，并通過模塊化組合，實(shí)現(xiàn)對SLE的精準(zhǔn)預(yù)測(包括發(fā)病的癥狀前預(yù)測、病情發(fā)展預(yù)測及療效預(yù)測)，從而實(shí)現(xiàn)對SLE患者的個(gè)體化健康管理，有效預(yù)防，精準(zhǔn)干預(yù)和治療；(3)針對SLE密切相關(guān)的分子標(biāo)志物，研發(fā)靶向藥物，有助于提高對SLE的治療水平。當(dāng)然，實(shí)現(xiàn)美好愿景的過程充滿機(jī)遇和挑戰(zhàn)。

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(本文編輯：劉群)

10.13602/j.cnki.jcls.2017.01.03

楊再興，1978年生，男，研究員，博士，從事自身免疫性疾病臨床和實(shí)驗(yàn)室診斷研究，E-mail：yangzaixingdiyi@163.com。

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