濕法消化法測定蜂花粉中鉛的研究

周萍邵巧云趙煥徐權(quán)華陳佳瑋胡福良

（1杭州蜂之語蜂業(yè)股份有限公司，桐廬311500；2浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，杭州310058）

濕法消化法測定蜂花粉中鉛的研究

周萍1邵巧云1趙煥1徐權(quán)華1陳佳瑋2胡福良2

（1杭州蜂之語蜂業(yè)股份有限公司，桐廬311500；2浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，杭州310058）

本文建立了濕法消化-原子吸收光譜法測定蜂花粉中鉛的方法。實(shí)驗(yàn)優(yōu)化表明，最佳消化程序?yàn)椋?0℃0.5 h→140℃1 h→180℃6~10 h（至溶液變淺黃）；石墨爐最佳溫升：干燥溫度120℃，灰化溫度500℃，原子化溫度1900℃，清殘余溫度2200℃；最佳稱樣量0.25 g～0.30 g。該方法條件下，線性范圍在5~80 ng/ml之間，線性方程為y= 0.0024x-0.0009，R2=0.9988，線性關(guān)系良好。方法回收率在95.2~100.1%之間，n=3。精密度RSD為3.05%，n=6。結(jié)合實(shí)際檢測結(jié)果，為GB 2762蜂花粉中鉛的指標(biāo)限量提出了合理指標(biāo)建議。

蜂花粉；鉛；測定方法；限量要求

蜂花粉是工蜂采集花粉，用唾液和花蜜混合后形成的物質(zhì)[1]，廣泛用于醫(yī)藥、食品和日化用品行業(yè)。由于重金屬鉛是蓄積性毒物，其污染可以通過食物鏈傳遞、富集和放大，長期攝入可導(dǎo)致人體慢性中毒[2，3]。為了加強(qiáng)蜂花粉作為食品、藥品使用的安全性和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制，我國規(guī)定蜂花粉中鉛的限量要求是0.5 mg/kg[4]。自2013年以來，我國政府監(jiān)管機(jī)構(gòu)通過市場抽查的方式，對蜂花粉產(chǎn)品進(jìn)行鉛的檢測，已經(jīng)有多家企業(yè)的產(chǎn)品被檢測到鉛的含量超過了限量要求。

目前蜂花粉中鉛的檢測方法主要有：電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法[5-8]，電感耦合等離子體質(zhì)譜法[9，10]，原子吸收分光光度法[11-14]。其中，電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法和電感耦合等離子體質(zhì)譜法能夠同時(shí)進(jìn)行多種元素分析，但是儀器昂貴。原子吸收分光光度法作為經(jīng)典的鉛檢測方法，具有靈敏度高、準(zhǔn)確性好等特點(diǎn)。檢測蜂花粉中的鉛時(shí)，文獻(xiàn)多采用微波消解、干法消化等樣品前處理技術(shù)，微波消解儀雖然有消解時(shí)間短、鉛損失小的優(yōu)點(diǎn)，但是儀器的價(jià)格不菲，而干法消化需要高溫馬弗爐，大多不能一次消化完全，操作繁瑣又不方便，鉛也有不同程度損失。濕法消化步驟雖稍繁瑣，卻操作簡單，成本低廉，準(zhǔn)確度高，儀器簡單，適合大多數(shù)企業(yè)使用。由于現(xiàn)有檢測標(biāo)準(zhǔn)方法未細(xì)化濕法消化條件、最佳稱樣量和最佳石墨爐加熱程序，故沒有得到很好的應(yīng)用。本文依據(jù)GB 5009.12食品中鉛的測定標(biāo)準(zhǔn)方法，研究了蜂花粉樣品的濕法消化升溫程序、最佳稱樣量、消化總時(shí)間、基體改進(jìn)劑添加量對檢測結(jié)果的影響，確定了簡單實(shí)用的濕法消化前處理方法和石墨爐升溫程序，同時(shí)對蜂花粉中鉛進(jìn)行測定，結(jié)果顯示該方法效果良好。

由于蜂花粉中鉛超過GB 2762規(guī)定的限量要求而被通報(bào)和處理的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，為此，本文還對蜂花粉中鉛的現(xiàn)狀進(jìn)行了綜合分析，并提出合理的蜂花粉中鉛的限量建議，供今后修訂GB 2762時(shí)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鉛標(biāo)準(zhǔn)品（1 mg/ml，中國藥品生物制品檢定所）；磷酸二氫銨為分析純；硝酸、高氯酸均為優(yōu)級(jí)純；雙重蒸餾水。

0.5 mol/L硝酸溶液：取3.2ml硝酸加入50ml水中，稀釋至100ml。

磷酸二氫銨溶液（80 g/L）：稱取8.0 g磷酸二氫銨，以水溶解稀釋至100ml。

混合酸：硝酸+高氯酸（9+1），取9份硝酸與1份高氯酸混合。

實(shí)驗(yàn)樣品：油菜蜂花粉、茶花花粉、荷花花粉（杭州蜂之語蜂業(yè)合作社、江山健康食品有限公司提供），精制花粉顆粒，批號(hào)：20150113（杭州蜂之語蜂業(yè)股份有限公司提供）。

1.2 儀器與設(shè)備

北京普析通用儀器有限責(zé)任公司TAS-990石墨爐原子吸收分光光度計(jì)；Sartorius BS224S分析天平；LICHEN邦西儀器科技（上海）有限公司DB-1EFS智能石墨電熱恒溫加熱板。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

稱取經(jīng)過研磨的試樣0.25~0.30 g（精確到0.0001 g）于高型石英燒杯中，放數(shù)粒玻璃珠，加8ml混合酸，加蓋浸泡過夜，上加一無柄小漏斗（下部孔徑0.5cm），置于電熱板上加熱消解，加熱程序：70℃0.5 h→140℃1 h→180℃6～10 h（至溶液變淺黃色），控制消化溫度不超過180℃，液體呈微沸狀態(tài)。當(dāng)樣液體積減少至1~ 2ml時(shí)，消化液應(yīng)呈透明的無色或淺黃色，即是消化完全狀態(tài)。當(dāng)液體少于2ml且消化尚未完全時(shí)，則需補(bǔ)加混合酸2ml，繼續(xù)至消化完全。取下放冷，用塑料滴管將消化液洗入10ml容量瓶中，用水少量多次洗滌高型石英燒杯，定容混勻備用；同時(shí)做試劑空白及添加回收。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液及標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

鉛標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：1 mg/ml，4℃下保存，36個(gè)月有效。

鉛標(biāo)準(zhǔn)中間液：每次吸取鉛標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1.0ml于 10ml容量瓶中，加硝酸（0.5 mol/L）或硝酸（1 mol/L）至刻度，配制成0.1 mg/ml中間標(biāo)準(zhǔn)液（1ml分裝于1.5ml塑料離心管中，4℃下保存，12個(gè)月有效）。

鉛標(biāo)準(zhǔn)臨時(shí)標(biāo)準(zhǔn)液：分別吸取鉛標(biāo)準(zhǔn)中間液100μl于1.5ml塑料離心管中，加硝酸（0.5 mol/L）或硝酸（1 mol/L）900μl，搖勻，配制成0.01 mg/ml臨時(shí)標(biāo)準(zhǔn)1液。

吸臨時(shí)標(biāo)準(zhǔn)1液100μl于1.5ml塑料離心管中，加入硝酸（0.5 mol/L）或硝酸（1 mol/L）900μl，用移液槍沖勻，配制成0.001 mg/ml臨時(shí)標(biāo)準(zhǔn)2液，做添加之用。

吸臨時(shí)標(biāo)準(zhǔn)1液100μl于10ml塑料離心管中，加硝酸（0.5 mol/L）或硝酸（1 mol/L）900μl，重復(fù)1次，搖勻，配制成2ml 0.0001 mg/ml臨時(shí)標(biāo)準(zhǔn)3液。

鉛標(biāo)準(zhǔn)使用液：分別吸臨時(shí)標(biāo)準(zhǔn)3液100μl、200μl、400μl、800μl于1.5ml塑料離心管中，加硝酸（0.5 mol/L）或硝酸（1 mol/L）900μl、800μl、600μl、200μl，分別搖勻，再用移液槍沖勻，配制成每ml含10.0，20.0，40.0，80.0 ng鉛的標(biāo)準(zhǔn)使用液（可根據(jù)樣品所含濃度調(diào)整配制），取20.0 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)液250μl，加硝酸（0.5 mol/L）或硝酸（1 mol/L）750μl，搖勻，成為每毫升含5.0 ng鉛的標(biāo)準(zhǔn)使用液，從而配制成5.0，10.0，20.0，40.0，80.0 ng鉛的系列標(biāo)準(zhǔn)使用液。同1.3.3樣品測定方法，測定鉛的系列標(biāo)準(zhǔn)使用液的吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，鉛標(biāo)準(zhǔn)液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 樣品測定

1.3.3.1 原子吸收分光光度計(jì)參數(shù)設(shè)定

通過對管理理念進(jìn)行創(chuàng)新，能夠有效的提升公路工程施工效率。在競爭激烈的工程行業(yè)當(dāng)中，面對日新月異的變化，過去傳統(tǒng)的施工管理理念與施工技術(shù)已經(jīng)很難適應(yīng)時(shí)代的發(fā)展要求，因此，要想讓企業(yè)在競爭中能夠繼續(xù)生存和發(fā)展，就要轉(zhuǎn)變觀念，根據(jù)當(dāng)前公路工程施工管理與施工技術(shù)中面臨的問題，結(jié)合企業(yè)自身發(fā)展，創(chuàng)新和完善管理理念，進(jìn)而推動(dòng)企業(yè)的健康發(fā)展。

根據(jù)儀器性能及說明書調(diào)至最佳狀態(tài)，見表1。

表1 原子吸收分光光度計(jì)鉛測定儀器條件

1.3.3.2 樣品測定

含基體改進(jìn)劑：分別吸取樣液和試劑空白液各800μl，加入200μl基體改進(jìn)劑-磷酸二氫銨溶液（80 g/L），混合30 s，移液槍沖勻，吸取12.5μl注入石墨爐，測得其吸光度。

不含基體改進(jìn)劑：分別吸取樣液和試劑空白液10.0μl注入石墨爐，測得其吸光度。

以上結(jié)果，代入標(biāo)準(zhǔn)系列的一元線性回歸方程（1.3.2）中求得樣液中鉛含量，計(jì)算結(jié)果保留兩位有效數(shù)字。

2 結(jié)果與分析

2.1 消化條件的優(yōu)化

2.1.1 消化程序的選擇

在濕法消化過程中，鉛離子與其他溶液中的陰離子結(jié)合形成鉛鹽，在一定溫度下，仍然存在鉛損失的風(fēng)險(xiǎn)，為了確定消化最高溫度，特選取140℃、160℃、180℃、200℃、220℃對樣品進(jìn)行消化，均消化至溶液呈透明淺黃色或者無色，并冒白煙，總消化時(shí)間不超過11.5 h，用蒸餾水定容至10ml，測定樣液吸光度，結(jié)果見圖1。

圖1 不同最高消化溫度對吸光度的影響

市售濃硝酸的沸點(diǎn)約為121℃，純高氯酸的沸點(diǎn)是130℃，故不能快速升溫消化，將消化程序設(shè)定電熱板初始溫度為70℃。經(jīng)過試驗(yàn)觀察，隨著溫度升高，樣品開始冒棕色煙霧，70℃0.5 h后，樣液反應(yīng)趨于平緩，再設(shè)定加熱板溫度為140℃，隨著溫度升高，樣品又開始冒棕色煙霧，0.5 h后，樣液反應(yīng)趨于平緩，為保證該溫度下的反應(yīng)完全，繼續(xù)加熱0.5 h后將加熱板溫度調(diào)至最高的消化溫度，保持至反應(yīng)結(jié)束。從圖1可以看到，當(dāng)最高消化溫度為180℃時(shí)，吸光度最高。故選擇最佳消化程序?yàn)椋?0℃0.5 h→140℃1 h→180℃6~10 h。

消化時(shí)間與稱樣量關(guān)系非常大，由于蜂花粉中鉛的限量要求為0.5 mg/kg，故設(shè)定稱樣量為0.25 g，0.30 g,0.40 g，0.45 g和0.50 g，分別按確定的消化程序進(jìn)行消化，發(fā)現(xiàn)當(dāng)稱樣量為0.25 g，0.30 g時(shí)，能夠在規(guī)定的時(shí)間內(nèi)消化完全，而0.40 g，0.45 g和0.50 g的樣液仍然是棕色的，表示消化沒有完全。故選擇最佳稱樣量為0.25～0.30 g。當(dāng)稱量為0.25 g時(shí)，按本文的檢測方法，蜂花粉中鉛的定量限為0.2 mg/kg，可以滿足日常生產(chǎn)的監(jiān)控要求。

2.1.3 消化時(shí)間的選擇

不同的蜂花粉樣品，由于成分相對存在差異，所以消化時(shí)間也不盡相同。特別地，對油菜花粉進(jìn)行消化總時(shí)間的考察，發(fā)現(xiàn)消化8 h后，反應(yīng)已經(jīng)完全，180℃下繼續(xù)消化1，2，3，4小時(shí)后，用蒸餾水定容至10ml，測定樣液吸光度，結(jié)果見圖2。

圖2 不同消化總時(shí)間對吸光度的影響

由圖2可知，在本消化程序條件下，消化總時(shí)間在12 h內(nèi)，對吸光度無顯著影響。

2.2 灰化溫度的選擇

2.2.1 無基體改進(jìn)劑時(shí)的灰化溫度

石墨爐加熱程序直接影響檢測結(jié)果，由于鉛容易揮發(fā)，故灰化階段的溫度為關(guān)鍵控制點(diǎn)，干燥溫度直接關(guān)系到灰化是否徹底，灰化溫度則關(guān)系到試樣是否灰化完全及鉛的損失大小。為保證樣液干燥徹底，干燥溫度為120℃/15 s，保持15 s。設(shè)定10 s內(nèi)達(dá)到灰化溫度400℃、500℃、600℃、700℃、800℃，保持15 s，其他條件參考儀器使用說明書，測定吸光度。結(jié)果：500℃時(shí)，吸光度最大，故選擇灰化溫度為500℃。

2.2.2 有基體改進(jìn)劑時(shí)的灰化溫度

基體改進(jìn)劑可提高鉛的灰化溫度，排除其他元素的干擾，樣品中當(dāng)某種元素含量特別高時(shí)，尤其適用。本文以GB 5009.12中提到的基體改進(jìn)劑磷酸二氫銨，配制成80 g/L濃度，如2.2.1研究了樣品最佳灰化溫度為800℃。

2.3 方法穩(wěn)定性

精密稱取樣品（精制蜂花粉顆粒，杭州蜂之語蜂業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：20150113）0.25 g，添加2 μg/ml鉛標(biāo)準(zhǔn)溶液125μl，按1.3.1要求對樣品進(jìn)行操作處理，在室溫下，分別在0，1，2，4，6，8 h按1.3.3方法測定，記錄其吸光度，RSD=3.77%（n=6），符合GB/T 27404對檢測結(jié)果精密度的要求，表明處理后的樣液在6 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4 方法的線性范圍、回收率和精密度

按本方法進(jìn)行測定，線性范圍：5.0 ng/ml～80.0 ng/ml，線性方程：y=0.0024x-0.0009，R2=0.9988，線性關(guān)系良好。取批號(hào)為20150113的精制蜂花粉顆粒樣品，進(jìn)行6次平行試驗(yàn)，RSD=3.05%，表明本方法精密度良好，符合GB/T 27404關(guān)于精密度的要求。稱取0.25 g批號(hào)為20150113的精制蜂花粉顆粒樣品，添加2 μg/ml鉛標(biāo)準(zhǔn)溶液125μl（添加濃度1 mg/kg），進(jìn)行添加回收試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果：樣品回收率95.2～100.1%（n=3），表明本方法準(zhǔn)確度良好，符合GB/T 27404關(guān)于準(zhǔn)確度的要求。

2.5 蜂花粉中鉛的測定

檢測了市場上常見的蜂花粉：油菜蜂花粉、茶花花粉、荷花花粉和精制花粉顆粒中的鉛含量，蜂花粉樣品隨機(jī)采購，未考慮地域、時(shí)間的限制，檢測結(jié)果如表2。

表2 蜂花粉中鉛的測定結(jié)果

總共檢測了7個(gè)樣品，合格率43%，與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果基本一致。

3 蜂花粉中鉛的限定建議

據(jù)中國蜂產(chǎn)品協(xié)會(huì)蜂花粉專業(yè)委員會(huì)的業(yè)內(nèi)專家說，我國蜂花粉中鉛含量有40%～60%大于GB 2762中關(guān)于蜂花粉鉛限量的值。何燕等[5]調(diào)查了14種來自于不同產(chǎn)地的71個(gè)花粉樣品，結(jié)果鉛含量大于0.5 mg/kg的樣品有43個(gè)，占總數(shù)的61%。浙江大學(xué)楊開等[7]對12種花粉中的鉛進(jìn)行了測定，結(jié)果大于0.5 mg/kg的占50%，最大值為4.77 mg/kg。曾志將等[8]檢測了除常規(guī)蜂花粉外的14種其他粉源植物蜂花粉中的鉛含量，結(jié)果大于0.5 mg/kg的樣品有9個(gè)，占總數(shù)的64%。這些文獻(xiàn)的報(bào)道與業(yè)內(nèi)專家的說法一致。

我們又調(diào)查了蜂蜜中關(guān)于鉛的限量，GB 2762中規(guī)定鉛限量為1 mg/kg。2013年，安徽國家農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化與監(jiān)測中心的夏春、高柱、臧愛香，用微波消解-電感耦合等離子體質(zhì)譜法（ICP-MS）測定了4種常見蜂蜜中的多種元素[15]，結(jié)果鉛含量為0.005～0.03 mg/kg，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院陳蘭珍等[16]測定了6種蜂蜜中的微量元素和重金屬，結(jié)果鉛含量為0.014～0.031 mg/kg，遠(yuǎn)低于GB 2762中規(guī)定的鉛限量1 mg/kg。因此，我們對GB 2762中規(guī)定鉛限量的依據(jù)存在疑問。

曾志將等[11]對花粉和蜂蜜兩者中礦物質(zhì)含量進(jìn)行了相關(guān)性分析，結(jié)論是蜂花粉是蜂蜜中鉛的重要來源，而GB2762中關(guān)于蜂花粉、蜂蜜鉛限量卻是倒置的，規(guī)定了蜂花粉中鉛限量為0.5 mg/kg，蜂蜜卻是1 mg/kg，與實(shí)際檢測結(jié)果明顯不符。蜂花粉可作為保健食品原料，在GB 16740保健食品中，保健食品中鉛的限量是2.0 mg/kg。故目前GB2762關(guān)于蜂花粉的鉛限量的設(shè)定與實(shí)際情況脫離，也無科學(xué)性，一定程度上制約著行業(yè)的發(fā)展。

以上分析意味著，如果不對蜂花粉原料進(jìn)行鉛限量的控制，那么蜂花粉中鉛超標(biāo)的可能性高達(dá)60%，這對于蜂花粉行業(yè)的發(fā)展是極其不利的，有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)制訂部門、政府監(jiān)管部門應(yīng)該對此事加以重視。

綜上所述，建議相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)起草單位和起草人，參考GB 16740確定蜂花粉中的鉛限量要求為2 mg/kg。

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Determination of lead in bee pollen by wet digestion method

Zhou Ping,Shao Qiaoyun,Zhao Huan,Xu Quanhua,Chen Jiawei,Hu Fuliang
(1 Hangzhou Beewords Apiculture Co.Ltd.,Tonglu 311500,China;2 Animal Science College of Zhejiang University,Hangzhou 310058,China)

A wet digestion atomic absorption spectrometry method was established for the determination of lead in bee pollen.The results showed that the optimal extracting technological conditions were as follows:the best digestion procedures used for 70℃→0.5 h,140℃→1 h,180℃→6~10 h(until solution became pale yellow).The optimal temperature rise of graphite furnace was that dried at 120℃,ashed at 500℃,atomized at 1900℃,and clear residual temperature was 2200℃.The best sample weight was 0.25 to 0.30 g.Under the condition of the method,the linear range was range from 5 ng/ml to 80 ng/ml,the linear equation was y=0.0024x-0.0009,R2=0.9988,showed a good linear correlation.The recovery of the method was 95.2~100.1%,n=3.The precision of the results showed that RSD was 3.05%,n=6.Based on the actual test results,the reasonable index of the lead in the GB 2762 bee pollen was put forward.

bee pollen;lead;determination method;limit requirement

周萍（1969-），男，高級(jí)工程師，主要從事蜂產(chǎn)品品質(zhì)管理與檢測、食品技術(shù)與新產(chǎn)品開發(fā)工作，E-mail:tdbjhn@126.com

胡福良（1964-），男，教授，博導(dǎo)，主要從事蜜蜂科學(xué)研究，E-mail:flhu@zju.edu.cn