松屬素和木犀草素抗腫瘤活性比較

王月華黃明珠玄紅專尹旭升

（1聊城大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，聊城252059；2山東省蜂業(yè)與蜂產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)所，泰安271000）

松屬素和木犀草素抗腫瘤活性比較

王月華1黃明珠1玄紅專1尹旭升2

（1聊城大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，聊城252059；2山東省蜂業(yè)與蜂產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)所，泰安271000）

為比較松屬素和木犀草素兩種黃酮類化合物的抗腫瘤功效，將正常培養(yǎng)的肺腺癌細(xì)胞（A549）、乳腺癌細(xì)胞（MCF-7,MDA-MB-231）及神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞（U87、U1172）經(jīng)不同濃度的松屬素和木犀草素（40,80,160μm）分別處理24和48 h，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，SRB法檢測細(xì)胞存活率；吖啶橙染色觀察細(xì)胞核凝集和片段化；Hoechst 33258檢測細(xì)胞凋亡；Western blot檢測膜聯(lián)蛋白A7（ANXA7）、procaspase3和LC3B的表達(dá)。結(jié)果表明，松屬素和木犀草素以劑量依賴的方式抑制A549、MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞增殖，而對(duì)U87和U172細(xì)胞的抑制功效較弱。Western blot結(jié)果表明，在MDA-MB-231細(xì)胞中，松屬素和木犀草素上調(diào)LC3-Ⅱ的水平，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。這說明松屬素和木犀草素對(duì)肺腺癌和乳腺癌細(xì)胞具有抗腫瘤功效。

松屬素；木犀草素；抗腫瘤；細(xì)胞凋亡

松屬素又名喬松素（5,7-二羥基黃烷酮，C15H12O4），在蜂膠中大量存在，是蜂膠中的一種主要功效成分，具有多種生物學(xué)功效，近年來松屬素對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)功效[1]受到越來越多的重視。木犀草素（3',4',5,7-四羥黃酮，C15H10O6）是一種在各種蔬菜及水果中廣泛分布的天然黃酮類化合物，具有多種藥理活性，如消炎、抗過敏、抗腫瘤、抗菌、抗病毒等[2-6]，臨床主要用于止咳、祛痰、消炎、治療心血管疾病[7]等。

大量研究表明，松屬素和木犀草素具有多種藥理學(xué)活性，如抗炎、抗菌、保護(hù)心血管、免疫調(diào)節(jié)以及抗腫瘤[8-14]等，但其抗腫瘤的活性比較及其作用機(jī)理還不完全清楚。本研究通過SRB法檢測了松屬素和木犀草素對(duì)不同腫瘤細(xì)胞（A549、MCF-7、MDA-MB-231、U87和U172）的影響，通過檢測細(xì)胞內(nèi)procaspase 3、膜聯(lián)蛋白A7（ANXA7）和LC3的水平對(duì)其抗腫瘤機(jī)理進(jìn)行了初步研究，以期為松屬素和木犀草素抗腫瘤應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司）、胎牛血清（美國Hyclone公司）；胰酶、磺基若丹明B（SRB）、Hoechst 33258、吖啶橙（AO）（美國Sigma公司）；細(xì)胞培養(yǎng)皿、96孔板（美國Falcon公司）；Tris（上海生工），一抗procaspase3,ANXA7,β-actin和辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（Santa Cruz Biotechnology）；LC3B（Cell Signaling Technology）。其它試劑均為分析純。MDA-MB-231、MCF-7、A549、U87和U172細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)保存。

1.2 主要儀器

Heal Force生物安全柜、Heal Force CO2培養(yǎng)箱（力康生物醫(yī)療科技控股有限公司）；TE2000S倒置熒光顯微鏡（日本Nikon公司）；MK3酶標(biāo)儀（芬蘭雷勃公司）；AR2140電子分析天平（美國奧豪斯公司）；Milli-Q Synthesis超純水（美國密理博公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞的培養(yǎng)

MDA-MB-231、MCF-7、A549、U87和U172細(xì)胞培養(yǎng)在添加10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中。孵育條件為：5%CO2、37℃、飽和濕度CO2培養(yǎng)箱中。倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.3.2 細(xì)胞存活率的測定

將處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞按4000個(gè)/孔種植到96孔板，37℃，5%CO2孵育，待腫瘤細(xì)胞長到60%以上，除正常組外所有處理組分別經(jīng)不同濃度的松屬素和木犀草素（40,80,160μm）分別處理細(xì)胞24和48 h后，棄細(xì)胞培養(yǎng)液，用10%三氯乙酸4℃固定1 h，然后用SRB染色10min，晾干，100 mM Tris堿溶解，在492 nm處測吸光值。細(xì)胞存活率（%）=（處理組OD值/對(duì)照組OD值）×100%

1.3.3 細(xì)胞核凝集和片段化測定

將處于對(duì)數(shù)生長期的MCF-7細(xì)胞按4×104個(gè)/孔種植到24孔板中，37℃，5%CO2孵育，待腫瘤細(xì)胞長到60%以上，加藥處理24 h，棄培養(yǎng)液，用1×PBS沖洗細(xì)胞，加入吖啶橙染液1min，棄吖啶橙染液，用1×PBS沖洗兩次，倒置相差顯微鏡觀察、分析結(jié)果。

1.3.4 細(xì)胞凋亡檢測

將處于對(duì)數(shù)生長期的MCF-7細(xì)胞按4×104個(gè)/孔種植到24孔板中，37℃，5%CO2孵育，待腫瘤細(xì)胞長到60%以上，加藥處理24 h，棄培養(yǎng)液，用1×PBS沖洗細(xì)胞，將Hoechst 33258應(yīng)用液代替細(xì)胞培養(yǎng)液，37℃孵育15min；棄Hoechst 33258染液，加入PBS倒置相差顯微鏡觀察、分析結(jié)果。

1.3.5 蛋白水平的檢測

將乳腺癌MCF-7細(xì)胞經(jīng)80μm待處理結(jié)束后，用蛋白裂解液收集不同處理組細(xì)胞，BCA法測定蛋白濃度。每組細(xì)胞分別經(jīng)12%SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)印、雜交、ECL顯色，得到procaspase3、ANXA7、LC3、β-actin蛋白雜交帶。蛋白相對(duì)量通過Quantity One軟件分析。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用SPSS v11.5軟件包統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±S）表示，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度的松屬素和木犀草素抗腫瘤活性

經(jīng)不同濃度的松屬素和木犀草素（40,80,160μm）分別處理細(xì)胞24和48 h后，通過SRB測定細(xì)胞存活率，結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同濃度的松屬素和木犀草素對(duì)不同細(xì)胞存活率的影響

由圖1可知，不同濃度的松屬素和木犀草素能顯著抑制乳腺癌（MCF-7、MDA-MB-231）、肺癌A549細(xì)胞的增殖，且同濃度的木犀草素抑制效果更強(qiáng)，并呈現(xiàn)時(shí)間和劑量依賴性（★P＜0.05，★★P＜0.01）。松屬素和木犀草素對(duì)U87和U172細(xì)胞的增殖抑制功效較弱。

2.2 松屬素和木犀草素對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響

通過倒置相差顯微鏡、AO染色和Hoechst 33258染色，分別觀察了松屬素和木犀草素（80μm）對(duì)MCF-7細(xì)胞核和凋亡的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 松屬素和木犀草素對(duì)細(xì)胞核凋亡的影響

由圖2可知，80μm松屬素和木犀草素處理MCF-7細(xì)胞后，經(jīng)AO染色可以看出，松屬素和木犀草素顯著促進(jìn)酸性膜泡的增多；經(jīng)Hoechst33258染色后可以看出，經(jīng)松屬素和木犀草素處理后，細(xì)胞核斷裂數(shù)目明顯增加，且同濃度的木犀草素較松屬素效果更顯著。

2.3 松屬素和木犀草素對(duì)LC3B和procaspase3蛋白水平的影響

松屬素和木犀草素（80μm）處理MCF-7細(xì)胞24 h后，western blotting檢測了細(xì)胞內(nèi)LC3和procaspase3的水平，結(jié)果如圖3所示。

圖3 松屬素和木犀草素對(duì)LC3和procaspase3的影響

由圖3可知，80μm松屬素和木犀草素處理MCF-7細(xì)胞后，顯著上調(diào)LC3-Ⅱ表達(dá)水平，活化caspase3表達(dá)，同時(shí)上調(diào)ANXA7的水平。（★P＜0.05，★★P＜0.01）。

3 討論

本文首次比較了松屬素和木犀草素的抗腫瘤功效。松屬素和木犀草素是兩種重要的黃酮類化合物，結(jié)構(gòu)類似，但松屬素屬于黃烷酮類，只有兩個(gè)羥基取代基；木犀草素屬于黃酮類化合物，有4個(gè)羥基。通過對(duì)不同腫瘤細(xì)胞存活率的影響可以看出，松屬素和木犀草素對(duì)肺腺癌細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制功效，且同濃度的木犀草素較松屬素對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制更強(qiáng)，說明由于結(jié)構(gòu)的不同，松屬素和木犀草素其抗腫瘤功效是不同的。此外，松屬素和木犀草素對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的存活率均無顯著影響，這也說明松屬素和木犀草素對(duì)腫瘤細(xì)胞的毒性具有選擇性。

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Different biological activities of pinocembrin and luteolin

Wang Yuehua,Huang Mingzhu,Xuan Hongzhuan,Yin Xusheng
(1 School of Life Science,Liaocheng University,Liaocheng 252059,China;2 Apidology and bee product quality inspection institute of Shandong Province,Tai’an 271000,China)

To study the antitumor activities of pinocembrin and luteolin,the normal cultured human lung carcinoma (A549),human breast cancer(MCF-7,MDA-MB-231)and glioma cells(U87、U1172)were treated with different concentrations of pinocembrin and luteolin(40,80,160μm)for 24 and 48 h,respectively.The cell viability was measured by SRB method.Hoechst 33258 staining and acridine orange staining were used to observe nuclear fragmentation,respectively.The levels of procaspase3,ANXA7 and LC3B were tested by western blotting.Pinocembrin and luteolin significantly inhibited proliferation of A549,MCF-7 and MDA-MB-231 cells in a time-and dose dependent manner.However,the inhibitory effects on U87 and U172 was not significantly.Pinocembrin and luteolin also induced apoptosis and autophagy by upregulating the levels of caspase 3 and LC3-Ⅱin MDA-MB-231 cells. Pinocembrin and luteolin are potential antitumor agents especially to human lung carcinoma and breast cancer cells.

pinocembrin;luteolin;antitumor;apoptosis

國家自然科學(xué)基金（31672499），山東省高等學(xué)?？萍加?jì)劃項(xiàng)目（J16LE21）、山東省農(nóng)業(yè)創(chuàng)新體系（SDAIT-24-05）

王月華（1990-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)榧?xì)胞生物學(xué)

尹旭升，研究員，E-mail:xushengyin@163.com