外泌體與病毒感染及HBV相關(guān)肝病的關(guān)系

賈小芳， 褚巧芳， 袁正宏，

(1 上海市公共衛(wèi)生臨床中心， 復(fù)旦大學(xué)， 上海 201508； 2 醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)教育部/衛(wèi)生部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系， 上海醫(yī)學(xué)院， 復(fù)旦大學(xué)， 上海 200032)

外泌體與病毒感染及HBV相關(guān)肝病的關(guān)系

賈小芳1， 褚巧芳2， 袁正宏1，2

(1 上海市公共衛(wèi)生臨床中心， 復(fù)旦大學(xué)， 上海 201508； 2 醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)教育部/衛(wèi)生部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系， 上海醫(yī)學(xué)院， 復(fù)旦大學(xué)， 上海 200032)

HBV感染后可導(dǎo)致肝臟組織炎癥和肝細(xì)胞壞死，甚至發(fā)生肝纖維化等病理變化，驅(qū)動(dòng)著“慢性肝炎-肝硬化-肝癌”的進(jìn)展，但其機(jī)制尚不完全明了。被HBV感染的肝細(xì)胞與其他未感染細(xì)胞及宿主免疫系統(tǒng)之間發(fā)生相互作用的可能機(jī)制即通過肝臟微環(huán)境中由外泌體介導(dǎo)的細(xì)胞與細(xì)胞間的相互溝通。多項(xiàng)研究表明病毒感染可以調(diào)節(jié)外泌體的生成并影響其組成，病毒microRNA、蛋白質(zhì)甚至整個(gè)病毒都可能被包裹進(jìn)入外泌體，從而影響病毒的免疫識別或調(diào)節(jié)鄰近細(xì)胞的功能。闡述了外泌體的產(chǎn)生和組成，及其在病毒感染過程中的作用，并進(jìn)一步對外泌體與HBV感染等方面的研究進(jìn)展進(jìn)行了討論。

外泌體； 肝炎病毒， 乙型； 肝疾病

肝臟是HBV復(fù)制的主要器官，但HBV并不具備細(xì)胞毒性，不直接引起肝細(xì)胞病變，肝臟損傷和病毒控制及抑制疾病的轉(zhuǎn)歸都決定于病毒復(fù)制和宿主免疫反應(yīng)之間復(fù)雜的相互作用。肝臟特有的組織微環(huán)境由肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞、各類肝非實(shí)質(zhì)細(xì)胞、肝血竇、竇周隙及各種細(xì)胞所表達(dá)產(chǎn)生的各類因子和產(chǎn)物等構(gòu)成，被HBV感染的肝細(xì)胞與其他未感染細(xì)胞及宿主免疫系統(tǒng)之間發(fā)生相互作用的一個(gè)可能機(jī)制，即通過肝臟微環(huán)境中由外泌體介導(dǎo)的細(xì)胞與細(xì)胞間相互溝通。

外泌體是一種可由多種細(xì)胞分泌到胞外的直徑為納米級別(40～150 nm)的膜性囊泡。多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞可以分泌外泌體，其可被鄰近的細(xì)胞吸收、降解或者進(jìn)入體液，隨體液在全身流通。外泌體內(nèi)含有獨(dú)特的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸等物質(zhì)，大量研究發(fā)現(xiàn)外泌體介導(dǎo)的脂類、蛋白質(zhì)及編碼和非編碼RNA等的運(yùn)輸廣泛參與了細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間的生理過程，如抗原遞呈、先天免疫、腫瘤的發(fā)生發(fā)展等。近年來，越來越多的研究開始關(guān)注外泌體作為細(xì)胞間物質(zhì)和信息的傳遞工具在病原體感染中的生理功能和意義。不斷有證據(jù)表明宿主外泌體通路可被病毒利用，受病毒影響和改造的外泌體有助于病毒的擴(kuò)散和免疫逃逸。本文將對外泌體的來源，外泌體的結(jié)構(gòu)和分子組成，外泌體的生成、分泌和攝取途徑，外泌體的功能及其在病毒感染特別是HBV感染及致病中的作用進(jìn)行闡述。

1 胞外囊泡的分類及外泌體的來源

受體和配體相互作用，以及直接的細(xì)胞和細(xì)胞相互作用，長期以來被認(rèn)為是細(xì)胞間相互溝通的主要方式。最近幾十年來，一種新的介導(dǎo)細(xì)胞和細(xì)胞間信息和物質(zhì)交換的具有包膜的細(xì)胞外囊泡越來越受到研究人員的關(guān)注。細(xì)胞會(huì)分泌大量囊泡到胞外空間，細(xì)胞的類型、起源以及它們目前所處的狀態(tài)(如在分化狀態(tài)下、被刺激或處在壓力情況下)決定了其分泌囊泡的種類。胞外囊泡是可由多種細(xì)胞分泌的信號細(xì)胞器，它在原核和真核生物中都高度保守。根據(jù)它們的起源機(jī)制，這些膜狀囊泡可以分為外泌體、微泡和凋亡小泡[1-2]。外泌體是直徑最小的囊泡 (直徑約40～150 nm)，在電子顯微鏡下觀察呈杯狀。在生理或病理狀態(tài)下，多囊泡體與細(xì)胞質(zhì)膜融合后，成為外泌體從細(xì)胞中釋放出來[3-5]。脫落微泡是直徑約為50～1000 nm的大囊泡，直接由細(xì)胞質(zhì)膜產(chǎn)生，而凋亡大泡由處于凋亡狀態(tài)的細(xì)胞所產(chǎn)生[4,6]。目前有很多研究關(guān)注外泌體在細(xì)胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面發(fā)揮的重要作用，而針對脫落微泡和凋亡小泡的研究較少。自1987年Johnstone等[7]首次對外泌體進(jìn)行了描述之后，其一直是研究人員關(guān)注的焦點(diǎn)。目前對于外泌體的定義為：外泌體是起源于胞漿內(nèi)吞體來源的多囊泡體，并由細(xì)胞分泌至胞外的直徑40～150 nm，包含脂質(zhì)、核酸和蛋白質(zhì)的囊泡結(jié)構(gòu)，其大量存在于血液、尿液、唾液和母乳中。

2 外泌體的結(jié)構(gòu)和分子組成

外泌體由脂質(zhì)雙層膜組成，與細(xì)胞質(zhì)膜相似。內(nèi)層膜和外層膜在磷脂組成上差別不大。外泌體膜富含鞘磷脂、磷脂酰絲氨酸、糖脂GM3和磷酸乙醇胺，同時(shí)富含一些以糖基磷脂酰肌醇為靶點(diǎn)的蛋白質(zhì)，如乙酰膽堿脂酶、淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原3、裂解促進(jìn)因子和膜反應(yīng)性溶解抑制物等[8-9]。

外泌體中的蛋白質(zhì)分為兩類，即所有不同細(xì)胞來源的外泌體都具有的蛋白質(zhì)，和不同類型細(xì)胞分泌的外泌體所特有的蛋白質(zhì)。第一類蛋白質(zhì)只是外泌體生成和行使功能所必需的保守蛋白質(zhì)，包括細(xì)胞骨架蛋白質(zhì)、吸附蛋白、參與膜融合的蛋白質(zhì)、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子、代謝酶、伴侶蛋白、四皂苷家族和多泡體形成蛋白質(zhì)[8,10]。外泌體腔中也包含很多種生物分子，如骨架相關(guān)的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，初級和次級內(nèi)吞體中的部分蛋白質(zhì)，如Rabs、TSG101和Alix。外泌體中還含有很多熱刺激蛋白和伴侶蛋白，如HSP70和HSP90等。許多跨膜蛋白也被整合到外泌體的脂質(zhì)雙層膜中，如四旋蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體和乙酰膽堿酯酶等。四旋蛋白是一個(gè)4次跨膜的蛋白質(zhì)，它在外泌體的脂質(zhì)雙層膜中形成了一個(gè)特殊的平臺(tái)，能與其他細(xì)胞表面受體、細(xì)胞內(nèi)的信號蛋白和骨架蛋白質(zhì)相互作用，而且它可以介導(dǎo)外泌體膜與受體細(xì)胞的質(zhì)膜相融合。外泌體也包含來自內(nèi)吞體的一些蛋白質(zhì)，如LAMP1、LAMP2和ESCRTs等[11]。第二類蛋白質(zhì)包括外泌體來源細(xì)胞所特有的蛋白質(zhì)，負(fù)責(zé)行使其來源細(xì)胞所特有的功能[3]。如被感染的細(xì)胞分泌的外泌體中包含病原體抗原，能夠誘導(dǎo)激活天然免疫細(xì)胞如樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。起源于免疫細(xì)胞的外泌體通常包含免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的蛋白質(zhì)，如TNFα、IL-1和IL-18等。來源于T淋巴細(xì)胞的外泌體中會(huì)表達(dá)T淋巴細(xì)胞受體以及T淋巴細(xì)胞共刺激和黏附受體。而起源于B淋巴細(xì)胞的外泌體則表達(dá)B淋巴細(xì)胞受體、Fc受體、MHCⅡ等。起源于成熟樹突狀細(xì)胞的外泌體則表達(dá)NFGE8、FasL和TRAIL等。近期的研究表明，來源于腫瘤細(xì)胞的外泌體通常表達(dá)免疫抑制配體，如NKG2D等，它的表達(dá)有利于腫瘤細(xì)胞逃避T淋巴細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)的殺傷作用。外泌體中大部分蛋白質(zhì)都是被泛素化修飾的，這表明外泌體中的蛋白質(zhì)如果沒有通過這種方式分泌到細(xì)胞外，均會(huì)進(jìn)入溶酶體中被降解，因此外泌體的分泌出胞是細(xì)胞排出胞內(nèi)不需要的蛋白質(zhì)的一種方式。

除了蛋白質(zhì)以外，外泌體還可以攜帶RNA[12]。只有特定的mRNA才會(huì)被分泌到外泌體中，所以細(xì)胞內(nèi)和外泌體中的mRNA是截然不同的。而且，外泌體中的mRNA是有功能的，可以在受體細(xì)胞中被翻譯成完整的蛋白質(zhì)而發(fā)揮作用。外泌體同時(shí)也包含microRNA(miRNA)，其在轉(zhuǎn)錄后可調(diào)節(jié)基因的表達(dá)和功能。同樣，只有特定的miRNA才會(huì)被包裹進(jìn)入外泌體內(nèi)，因此外泌體中的miRNA和細(xì)胞內(nèi)的miRNA譜也是不相同的。外泌體中的miRNA具有特定的功能，在成功被受體細(xì)胞吸收之后，它們可以修飾目標(biāo)mRNA發(fā)揮相應(yīng)的功能。miRNA能被特異的包裝進(jìn)入外泌體，這種包裝讓miRNA在體內(nèi)保持穩(wěn)定，使其在體液循環(huán)中能夠被檢測到。由于外泌體中攜帶的miRNA的特殊性，在不同的病理狀態(tài)下外泌體中包裹的miRNA及其水平變化，可以作為預(yù)測疾病進(jìn)展的潛在分子標(biāo)志物[12-13]。

3 外泌體的分泌途徑及攝取

外泌體是納米級別的囊泡結(jié)構(gòu)，通過細(xì)胞內(nèi)胞吞作用通路形成，最終釋放到細(xì)胞外[3,5,14]。內(nèi)吞體根據(jù)在細(xì)胞內(nèi)吞作用的不同時(shí)間階段可分為初級內(nèi)吞體、次級內(nèi)吞體和再循環(huán)內(nèi)吞體，它們可以通過GTP結(jié)合Rabs等蛋白質(zhì)標(biāo)志物進(jìn)行區(qū)分，這3種內(nèi)吞體形態(tài)上也有所不同。一旦在內(nèi)吞作用中的囊泡被釋放，它們首先與初級內(nèi)吞體融合，然后再成長為次級內(nèi)吞體，次級內(nèi)吞體以多囊泡體的形式呈現(xiàn)。轉(zhuǎn)運(yùn)必需內(nèi)吞體分選復(fù)合物在外泌體的形成過程中起著非常重要的作用[15-16]。一些信號蛋白質(zhì)如Rab、小GTP綁定蛋白及它們的信號蛋白GEFs和GAPs也參加到外泌體的形成及分泌過程。次級內(nèi)吞體通過微管網(wǎng)絡(luò)移動(dòng)，驅(qū)動(dòng)蛋白和動(dòng)力蛋白提供移動(dòng)的動(dòng)力，Rab家族的蛋白質(zhì)如Rab7，通過與下游效應(yīng)蛋白質(zhì)如Alix、TSG101決定次級內(nèi)吞體運(yùn)動(dòng)的方向。外泌體即成熟于多囊泡體，通過多囊泡體與質(zhì)膜融合，外泌體被排出胞外。此外，外泌體的產(chǎn)生可以受多種因素的影響，包括細(xì)胞外刺激，如微生物攻擊和其他壓力條件影響等。

分泌到胞外的外泌體可以被相同或不同類型的細(xì)胞吸收，外泌體表面或包裹在外泌體里面的物質(zhì)就被傳遞到受體細(xì)胞中。關(guān)于外泌體被吸收的機(jī)制目前主要有3種假說：第一，外泌體可以通過吞噬作用和胞飲作用被吸收；第二，磷脂酰絲氨酸表達(dá)于外泌體的外層膜上，有助于外泌體與激活的T淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞表面的TIM1和TIM4結(jié)合，或者磷脂酰絲氨酸與乳凝集素相互作用形成復(fù)合體，進(jìn)而結(jié)合到受體細(xì)胞的αvβ3或者αvβ5整合素上；第三，外泌體膜上特異表達(dá)的整合素與受體細(xì)胞上的同源配體相互作用，進(jìn)而促進(jìn)由外泌體膜上的四旋蛋白介導(dǎo)的外泌體膜與受體細(xì)胞膜的相互融合[17-20]。

4 外泌體的生物學(xué)功能

外泌體的功能非常多樣化，且決定于它的供體和受體細(xì)胞的類型。供體細(xì)胞的生理狀態(tài)不同，分泌出的外泌體所含組分也會(huì)有所不同，會(huì)影響外泌體在受體細(xì)胞中的功能。如前文所述，外泌體的分泌出胞是細(xì)胞排出胞內(nèi)不需要的蛋白質(zhì)的一種方式。另外，外泌體作為一種細(xì)胞間物質(zhì)和信息傳遞的載體，是一種獨(dú)特的細(xì)胞間溝通的工具，可從多個(gè)方面發(fā)揮作用[18-19]。首先，不同于細(xì)胞因子信號，外泌體不僅可以運(yùn)輸?shù)鞍踪|(zhì)，還能運(yùn)輸核酸類，如mRNA和miRNA。其次，外泌體能夠轉(zhuǎn)運(yùn)包括受體在內(nèi)的膜成分，如上皮生長因子受體等。此外，外泌體能夠保護(hù)其包裹的組分不被胞外環(huán)境中的酶所降解，這使得包裹的成分可以實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)距離運(yùn)輸，如不同器官間的運(yùn)輸，外泌體的這一功能使腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體可能在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[21-22]，也可以被多種病毒利用，從而有利于病毒的擴(kuò)散[23]。

5 外泌體與病毒感染

外泌體作為細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)排出和細(xì)胞間物質(zhì)和信息交換的一種途徑，在病毒感染過程中發(fā)揮著非常重要的作用，感染細(xì)胞分泌的外泌體負(fù)責(zé)傳遞致病的信息，且可能參與決定病毒感染的最終結(jié)局。很多研究證實(shí)，病毒來源的成分如miRNA、蛋白質(zhì)甚至整個(gè)病毒都能被感染細(xì)胞分泌的外泌體攜帶，從而影響病毒的免疫識別或調(diào)節(jié)鄰近的細(xì)胞功能[23]。由于外泌體的分泌及其組成受病毒感染的影響，因此，在病毒感染過程中，外泌體能夠促進(jìn)細(xì)胞間的交流和對宿主免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)，可能幫助或限制感染過程，對宿主免疫系統(tǒng)的作用也會(huì)根據(jù)病毒種類和靶細(xì)胞的不同而不同[24]。感染病毒后細(xì)胞分泌的外泌體可能具有2種不同的作用：第一種可能是擴(kuò)大病原體的感染性。一方面，如被EB病毒(EBV)[25]、巨細(xì)胞病毒[26]和HCV[27]感染的細(xì)胞分泌的外泌體，可以在血液中循環(huán)，進(jìn)入受體細(xì)胞后，可在其中復(fù)制，將病毒的組分引入其中，進(jìn)而來抵抗宿主免疫反應(yīng)；另一方面，通過外泌體排出一些細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)可能是細(xì)胞調(diào)節(jié)自身蛋白質(zhì)更新速率的一種方式，而病毒感染可能利用這一過程，通過外泌體分泌的途徑改變胞內(nèi)蛋白質(zhì)組分的變化，從而創(chuàng)造了一種更有助于病毒生活周期的微環(huán)境。另一種可能是被感染細(xì)胞分泌的外泌體被運(yùn)輸?shù)桨?，可能被器官中的免疫?xì)胞吸收，從而激活抗病毒免疫反應(yīng)抵抗病原體。

近期在HIV、HCV、EBV等領(lǐng)域的研究[28-29]揭示了外泌體在病毒生命周期和致病過程中的作用。HIV-1通過樹突狀細(xì)胞免疫受體結(jié)合到樹突狀細(xì)胞上，刺激樹突狀細(xì)胞分泌外泌體，且該外泌體能誘導(dǎo)未被HIV-1感染的CD4+T淋巴細(xì)胞的凋亡[30]。另外，HIV感染細(xì)胞分泌的外泌體包含脫氨酶，可激活先天免疫反應(yīng)并抑制HIV的復(fù)制[11]。HCV感染細(xì)胞分泌的外泌體中包裹病毒RNA，這些外泌體可以進(jìn)一步感染新的細(xì)胞，提示外泌體在HCV感染擴(kuò)散過程中具有非常重要的作用[31]。此外，HCV感染細(xì)胞所分泌的外泌體可通過TLR7/8致使巨噬細(xì)胞極化，分泌TGFβ，激活肝星狀細(xì)胞，從而使肝細(xì)胞發(fā)生纖維化[32]。另一篇報(bào)道發(fā)現(xiàn)HCV感染的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞分泌的外泌體包含有miR-19a，可直接激活肝星狀細(xì)胞的STAT3-TGFβ引起肝纖維化[33]。Meckes等[34]分析了被γ皰疹病毒[包括卡波氏肉瘤相關(guān)皰疹病毒(Kaposi′s sarcoma-associated herpesvirus，KSHV)和EBV]感染后B淋巴細(xì)胞分泌的外泌體蛋白質(zhì)組成的變化。通過定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，鑒定了871個(gè)外泌體蛋白質(zhì)，其中360個(gè)蛋白質(zhì)是病毒感染組外泌體所特有的。EBV和KSHV外泌體很可能參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生存和死亡、核糖體功能、蛋白質(zhì)合成等生物學(xué)過程，外泌體蛋白質(zhì)組成的改變提示這兩種病毒可通過外泌體途徑來調(diào)控腫瘤微環(huán)境，外泌體中的蛋白質(zhì)可能為EBV和KSHV引起的惡性腫瘤提供特異的診斷標(biāo)志物。而近期關(guān)于EBV感染細(xì)胞分泌外泌體的研究[35-36]表明，EBV感染的類淋巴母細(xì)胞和鼻咽癌細(xì)胞都能分泌包裹LMP1的外泌體，該外泌體能夠抑制T淋巴細(xì)胞激活和增殖。EBV相關(guān)鼻咽癌細(xì)胞分泌外泌體中包裹了半乳凝素9，該蛋白質(zhì)能夠通過與受體CD4+T淋巴細(xì)胞表面受體TIM3發(fā)生相互作用從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[35,37]。EBV還被報(bào)道可能利用宿主外泌體途徑把重要的免疫效應(yīng)分子如IFI16、裂解的半胱氨酸蛋白酶1、IL-1b、IL-18和IL-33排出被感染的細(xì)胞，從而逃避天然免疫反應(yīng)[38]。

6 外泌體與HBV感染及其在致病中的作用

肝臟是HBV復(fù)制的主要器官，擁有非常復(fù)雜的微環(huán)境，它包含了多種不同類型的細(xì)胞。推測在HBV感染肝細(xì)胞的過程中，外泌體包裹的蛋白質(zhì)可能發(fā)揮著非常重要的作用。一方面，HBV感染肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞，可能會(huì)造成正常細(xì)胞生理狀態(tài)的改變，外泌體作為肝內(nèi)不同細(xì)胞群的協(xié)調(diào)溝通工具，其包裹的蛋白質(zhì)可能參與維持肝臟的正常功能；另一方面，感染細(xì)胞分泌的外泌體負(fù)責(zé)傳遞致病的信息，外泌體中包裹的蛋白質(zhì)可能參與病毒的傳播、致病或宿主免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)等過程，病理狀態(tài)下外泌體中攜帶的miRNA和蛋白質(zhì)等成分的改變還可能作為預(yù)測疾病進(jìn)展的標(biāo)志物。

本團(tuán)隊(duì)前期的一項(xiàng)研究[39]表明，由外泌體介導(dǎo)的細(xì)胞和細(xì)胞間的抗病毒物質(zhì)的傳遞是IFN誘導(dǎo)的抗病毒反應(yīng)的一種潛在機(jī)制。IFNα可誘導(dǎo)肝非實(shí)質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生抗病毒物質(zhì)并通過外泌體傳遞給HBV感染的靶細(xì)胞肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞。該研究發(fā)現(xiàn)IFNα刺激肝非實(shí)質(zhì)細(xì)胞所產(chǎn)生的外泌體中富含抗病毒活性分子，這些外泌體能夠被肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞內(nèi)吞，從而實(shí)現(xiàn)抗病毒分子在細(xì)胞間的傳遞。此外，該研究還揭示了外泌體與IFNα對小鼠肝炎病毒A59和腺病毒的抗病毒反應(yīng)相關(guān)。這些結(jié)果提示，IFNα抗病毒活性的機(jī)理之一即通過外泌體介導(dǎo)的抗病毒分子誘生和細(xì)胞間傳播。

由于外泌體作為肝臟微環(huán)境中不同細(xì)胞的物質(zhì)和信號傳遞媒介在肝內(nèi)HBV感染過程中可能起著至關(guān)重要的作用，因此本團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步分析了HBV復(fù)制狀態(tài)下肝細(xì)胞分泌的外泌體蛋白質(zhì)組成并進(jìn)行了初步的功能學(xué)分析。通過非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對可誘導(dǎo)表達(dá)HBV復(fù)制的HepAD38細(xì)胞來源的外泌體蛋白質(zhì)組成及受胞內(nèi)HBV復(fù)制的影響進(jìn)行了研究[40]，共鑒定出1412個(gè)外泌體蛋白質(zhì)，包括外泌體標(biāo)志蛋白質(zhì)、肝功能相關(guān)蛋白質(zhì)、免疫相關(guān)蛋白質(zhì)和蛋白酶體復(fù)合物蛋白質(zhì)等，顯示外泌體中具有非常豐富和復(fù)雜的蛋白質(zhì)組成，可能參與調(diào)控多種生物學(xué)過程。該研究通過對有或無HBV復(fù)制HepAD38細(xì)胞來源的外泌體蛋白質(zhì)豐度進(jìn)行定量分析，發(fā)現(xiàn)HepAD38外泌體中多種蛋白質(zhì)的豐度受HBV復(fù)制的調(diào)控而發(fā)生改變，特別是多個(gè)蛋白酶體復(fù)合物亞基在HBV復(fù)制細(xì)胞來源的外泌體中豐度增加，功能學(xué)實(shí)驗(yàn)初步顯示可能調(diào)節(jié)單核細(xì)胞分泌IL-6的水平。該研究結(jié)果提示，HBV感染肝細(xì)胞后可通過外泌體將蛋白質(zhì)等信號傳遞給免疫細(xì)胞等肝非實(shí)質(zhì)細(xì)胞，介導(dǎo)跨細(xì)胞間通訊和免疫調(diào)節(jié)，這可能是HBV在宿主肝臟內(nèi)形成持續(xù)性感染的一種重要機(jī)制。

關(guān)于HBV復(fù)制和感染過程中宿主細(xì)胞來源外泌體的研究還有一些其他報(bào)道。HBV可能利用外泌體途徑釋放與傳播病毒，調(diào)節(jié)機(jī)體的天然免疫反應(yīng)[41-43]，或者外排抗病毒蛋白質(zhì)[44]，并影響抗HBV分子在細(xì)胞間的傳遞[39]。慢性乙型肝炎患者血清中分離的外泌體中，可檢測到HBV核酸與蛋白質(zhì)，這些外泌體可以迅速被HLCZ01及原代NK細(xì)胞所攝取，促進(jìn)病毒的傳播，同時(shí)還會(huì)引起NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性因子IFNγ、TNFα的產(chǎn)生和活化受體NKp44的表達(dá)均顯著降低，致使NK細(xì)胞功能失調(diào)[41]。Zhao等[45]研究采用SILAC標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，分析了瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HBV基因組的Huh-7細(xì)胞分泌的外泌體蛋白質(zhì)組成的改變，發(fā)現(xiàn)了一批與HBV復(fù)制和HBx表達(dá)相關(guān)的外泌體蛋白質(zhì)。近期的另兩項(xiàng)研究[42,46]揭示了包括外泌體在內(nèi)的細(xì)胞外囊泡中包裹了具有免疫調(diào)節(jié)功能的miRNA，可參與調(diào)節(jié)HBV感染過程中的天然免疫反應(yīng)。以上研究提示宿主的外泌體途徑可被HBV等病毒開發(fā)，以利用其復(fù)制、擴(kuò)散和逃避免疫。

目前肝活組織檢查仍是肝病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但其具有一定的風(fēng)險(xiǎn)和創(chuàng)傷性，且不適用于一些患有特定基礎(chǔ)疾病的患者。因此迫切地需要尋找新的特異、敏感且非損傷性的疾病診斷標(biāo)志物。而肝細(xì)胞在損傷或者病理情況下分泌的外泌體的內(nèi)容物會(huì)發(fā)生特異性改變，可能提示疾病的進(jìn)展。據(jù)報(bào)道肝細(xì)胞癌患者血漿外泌體中miR-18a、miR-221、miR-222和miR-224水平明顯高于慢性乙型肝炎或肝硬化患者(P值均<0.05)；而血漿外泌體miR-101、miR-106b、miR-122和miR-195水平則明顯低于慢性乙型肝炎患者(P值均<0.05)，提示miRNA可能作為新的肝癌血清學(xué)標(biāo)志物[47]。另一項(xiàng)研究[48]顯示，外泌體與血漿miRNA聯(lián)合模型可以輔助AFP用于肝細(xì)胞癌的早期診斷。以上研究提示感染狀態(tài)下外泌體中包裹的miRNA等分子及其水平改變能夠敏感且特異地反映疾病變化，可能作為預(yù)測病毒感染及相關(guān)疾病進(jìn)展的潛在分子標(biāo)志物。

7 外泌體的應(yīng)用前景

綜上所述，外泌體作為一種重要的細(xì)胞與細(xì)胞間物質(zhì)和信息傳遞的工具，在多種病毒感染的過程中都發(fā)揮著非常重要的作用。由于外泌體在病毒感染過程中可能起促進(jìn)或限制感染的作用，因此可應(yīng)用于開發(fā)預(yù)防和治療性疫苗。此外，由于外泌體來源于所有細(xì)胞類型，在病理狀態(tài)下外泌體中包裹的miRNA或蛋白質(zhì)及其水平會(huì)發(fā)生變化，因此體液如血漿、尿液和唾液中的外泌體可作為無創(chuàng)標(biāo)志物的儲(chǔ)藏庫，在病毒性疾病的早期診斷、療效監(jiān)測和疾病的預(yù)后方面有很好的應(yīng)用前景。由于目前對于HBV感染過程中外泌體功能的了解仍然處于起步階段，進(jìn)一步探索這種病毒和宿主的相互作用方式，將有利于揭示外泌體的形成和蛋白質(zhì)分選的機(jī)制及其在病毒感染過程中的作用，并有助于研究外泌體如何通過調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞從而決定病毒感染結(jié)局的新機(jī)制，從而幫助設(shè)計(jì)通過影響外泌體的分泌或改變其成分來控制病毒致病和持續(xù)性感染的策略。

[1] GANGODA L, BOUKOURIS S, LIEM M, et al. Extracellular vesicles including exosomes are mediators of signal transduction: are they protective or pathogenic?[J]. Proteomics, 2015, 15(2-3): 260-271.

[2] HIRSOVA P, IBRAHIM SH, VERMA VK, et al. Extracellular vesicles in liver pathobiology: small particles with big impact[J]. Hepatology, 2016, 64(6): 2219-2233.

[6] SIMS PJ, FAIONI EM, WIEDMER T, et al. Complement proteins C5b-9 cause release of membrane vesicles from the platelet surface that are enriched in the membrane receptor for coagulation factor Va and express prothrombinase activity[J]. J Biol Chem, 1988, 263(34): 18205-18212.

[7] JOHNSTONE RM, ADAM M, HAMMOND JR, et al. Vesicle formation during reticulocyte maturation. Association of plasma membrane activities with released vesicles (exosomes)[J]. J Biol Chem, 1987, 262(19): 9412-9420.

[8] SCHOREY JS, BHATNAGAR S. Exosome function: from tumor immunology to pathogen biology[J]. Traffic, 2008, 9(6): 871-881.

[9] ECHARRI A, MURIEL O, DEL POZO MA. Intracellular trafficking of raft/caveolae domains: insights from integrin signaling[J]. Semin Cell Dev Biol, 2007, 18(5): 627-637.

[10] MIGNOT G, ROUX S, THERY C, et al. Prospects for exosomes in immunotherapy of cancer[J]. J Cell Mol Med, 2006, 10(2): 376-388.

[11] HOSSEINI HM, FOOLADI AA, NOURANI MR, et al. The role of exosomes in infectious diseases[J]. Inflamm Allergy Drug Targets, 2013, 12(1): 29-37.

[12] VALADI H, EKSTR?M K, BOSSIOS A, et al. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells[J]. Nat Cell Biol, 2007, 9(6): 654-659.

[13] HUNTER MP, ISMAIL N, ZHANG X, et al. Detection of microRNA expression in human peripheral blood microvesicles[J]. PLoS One, 2008, 3(11): e3694.

[14] MASYUK AI, MASYUK TV, LARUSSO NF. Exosomes in the pathogenesis, diagnostics and therapeutics of liver diseases[J]. J Hepatol, 2013, 59(3): 621-625.

[15] BABST M, KATZMANN DJ, ESTEPA-SABAL EJ, et al. Escrt-III: an endosome-associated heterooligomeric protein complex required for mvb sorting[J]. Dev Cell, 2002, 3(2): 271-282.

[16] BABST M, KATZMANN DJ, SNYDER WB, et al. Endosome-associated complex, ESCRT-II, recruits transport machinery for protein sorting at the multivesicular body[J]. Dev Cell, 2002, 3(2): 283-289.

[17] BANG C, THUM T. Exosomes: new players in cell-cell communication[J]. Int J Biochem Cell Biol, 2012, 44(11): 2060-2064.

[18] SUN D, ZHUANG X, ZHANG S, et al. Exosomes are endogenous nanoparticles that can deliver biological information between cells[J]. Adv Drug Deliv Rev, 2013, 65(3): 342-347.

[19] VLASSOV AV, MAGDALENO S, SETTERQUIST R, et al. Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials[J]. Biochim Biophys Acta, 2012, 1820(7): 940-948.

[20] MASYUK AI, HUANG BQ, WARD CJ, et al. Biliary exosomes influence cholangiocyte regulatory mechanisms and proliferation through interaction with primary cilia[J]. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2010, 299(4): g990-g999.

[21] KATSUDA T, KOSAKA N, OCHIYA T. The roles of extracellular vesicles in cancer biology: toward the development of novel cancer biomarkers[J]. Proteomics, 2014, 14(4-5): 412-425.

[22] COSTA-SILVA B, AIELLO NM, OCEAN AJ, et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver[J]. Nat Cell Biol, 2015, 17(6): 816-826.

[23] RAAB-TRAUB N, DITTMER DP. Dittmer, Viral effects on the content and function of extracellular vesicles[J]. Nat Rev Microbiol, 2017. [Epub ahead of print]

[24] MECKES DG Jr, RAAB-TRAUB N. Microvesicles and viral infection[J]. J Virol, 2011, 85(24): 12844-12854.

[25] WURDINGER T, GATSON NN, BALAJ L, et al. Extracellular vesicles and their convergence with viral pathways[J]. Adv Virol, 2012, 2012: 767694.

[26] PLAZOLLES N, HUMBERT JM, VACHOT L, et al. Pivotal advance: the promotion of soluble DC-SIGN release by inflammatory signals and its enhancement of cytomegalovirus-mediated cis-infection of myeloid dendritic cells[J]. J Leukoc Biol, 2011, 89(3): 329-342.

[27] MASCIOPINTO F, GIOVANI C, CAMPAGNOLI S, et al. Association of hepatitis C virus envelope proteins with exosomes[J]. Eur J Immunol, 2004, 34(10): 2834-2842.

[28] CHAHAR HS, BAO X, CASOLA A. Exosomes and their role in the life cycle and pathogenesis of RNA viruses[J]. Viruses, 2015, 7(6): 3204-3225.

[29] LI J, LIU K, LIU Y, et al. Exosomes mediate the cell-to-cell transmission of IFN-α-induced antiviral activity[J]. Nat Immunol, 2013, 14(8): 793-803.

[30] MFUNYI CM, VAILLANCOURT M, VITRY J, et al. Exosome release following activation of the dendritic cell immunoreceptor: a potential role in HIV-1 pathogenesis[J]. Virology, 2015, 484: 103-112.

[31] RAMAKRISHNAIAH V, THUMANN C, FOFANA I, et al. Exosome-mediated transmission of hepatitis C virus between human hepatoma Huh7.5 cells[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2013, 110(32): 13109-13113.

[32] SAHA B, KODYS K, ADEJUMO A, et al. Circulating and exosome-packaged hepatitis C single-stranded RNA induce monocyte differentiation via TLR7/8 to polarized macrophages and fibrocytes[J]. J Immunol, 2017, 198(5): 1974-1984.

[33] DEVHARE PB, SASAKI R, SHRIVASTAVA S, et al. Exosome-mediated intercellular communication between hepatitis C virus-infected hepatocytes and hepatic stellate cells[J]. J Virol, 2017, 91(6). pii: e02225-16.

[34] MECKES DG Jr, GUNAWARDENA HP, DEKROON RM, et al. Modulation of B-cell exosome proteins by gamma herpesvirus infection[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2013, 110(31): e2925-e2933.

[35] KERYER-BIBENS C, PIOCHE-DURIEU C, VILLEMANT C, et al. Exosomes released by EBV-infected nasopharyngeal carcinoma cells convey the viral latent membrane protein 1 and the immunomodulatory protein galectin 9[J]. BMC Cancer, 2006, 6: 283.

[36] DUKERS DF, MEIJ P, VERVOORT MB, et al. Direct immunosuppressive effects of EBV-encoded latent membrane protein 1 [J]. J Immunol, 2000, 165(2): 663-670.

[37] KLIBI J, NIKI T, RIEDEL A, et al. Blood diffusion and Th1-suppressive effects of galectin-9-containing exosomes released by Epstein-Barr virus-infected nasopharyngeal carcinoma cells[J]. Blood, 2009, 113(9): 1957-1966.

[38] ANSARI MA, SINGH VV, DUTTA S, et al. Constitutive interferon-inducible protein 16-inflammasome activation during Epstein-Barr virus latency I, II, and III in B and epithelial cells[J]. J Virol, 2013, 87(15): 8606-8623.

[39] LI J, LIU K, LIU Y, et al. Exosomes mediate the cell-to-cell transmission of IFN-α-induced antiviral activity[J]. Nat Immunol, 2013, 14(8): 793-803.

[40] JIA X, CHEN J, MEGGER DA, et al. Label-free proteomic analysis of exosomes derived from inducible hepatitis B virus-replicating HepAD38 cell line[J]. Mol Cell Proteomics, 2017, 16(4 Suppl 1): s144-s160.

[41] YANG Y, HAN Q, HOU Z, et al. Exosomes mediate hepatitis B virus (HBV) transmission and NK-cell dysfunction[J]. Cell Mol Immunol, 2017, 14(5): 465-475.

[42] KOUWAKI T, FUKUSHIMA Y, DAITO T, et al. Extracellular vesicles including exosomes regulate innate immune responses to hepatitis B virus infection[J]. Front Immunol, 2016, 7: 335.

[43] YANG X, LI H, SUN H, et al. Hepatitis B virus-encoded microRNA controls viral replication[J]. J Virol, 2017, 91(10). pii: e01919-16.

[44] CHEN R, ZHAO X, WANG Y, et al. Hepatitis B virus X protein is capable of down-regulating protein level of host antiviral protein APOBEC3G[J]. Sci Rep, 2017, 7: 40783.

[45] ZHAO X, WU Y, DUAN J, et al. Quantitative proteomic analysis of exosome protein content changes induced by hepatitis B virus in Huh-7 cells using SILAC labeling and LC-MS/MS[J]. J Proteome Res, 2014, 13(12): 5391-5402.

[46] KOUWAKI T, OKAMOTO M, TSUKAMOTO H, et al. Extracellular vesicles deliver host and virus RNA and regulate innate immune response[J]. Int J Mol Sci, 2017, 18(3). pii: e666.

[47] SOHN W, KIM J, KANG SH, et al. Serum exosomal microRNAs as novel biomarkers for hepatocellular carcinoma[J]. Exp Mol Med, 2015, 47: e184.

[48] LIU WH, REN LN, WANG X, et al. Combination of exosomes and circulating microRNAs may serve as a promising tumor marker complementary to alpha-fetoprotein for early-stage hepatocellular carcinoma diagnosis in rats[J]. J Cancer Res Clin Oncol, 2015, 141(10): 1767-1778.

引證本文：JIA XF, CHU QF, YUAN ZH. Association of exosomes with viral infection and hepatitis B virus-related liver diseases[J]. J Clin Hepatol, 2017, 33(8): 1465-1470. (in Chinese) 賈小芳， 褚巧芳， 袁正宏. 外泌體與病毒感染及HBV相關(guān)肝病的關(guān)系[J]. 臨床肝膽病雜志, 2017, 33(8): 1465-1470.

(本文編輯：葛 俊)

Association of exosomes with viral infection and hepatitis B virus-related liver diseases

JIAXiaofang,CHUQiaofang,YUANZhenghong.

(ShanghaiPublicHealthClinicalCenter,FudanUniversity,Shanghai201508,China)

Hepatitis B virus (HBV) infection causes pathological changes of the liver, including liver inflammation, hepatocyte necrosis, and even liver fibrosis, and promotes the progression from chronic hepatitis to liver cirrhosis and liver cancer, but related mechanisms remain unclear. The mechanism for the interaction between hepatocytes infected by HBV and uninfected hepatocytes/host immune system might be exosomes-mediated cell-cell communication in liver microenvironment. Many studies have demonstrated that viral infection can regulate the production of exosomes and affect their composition, and viral microRNAs, proteins, and even the entire virion can be incorporated into the exosomes, which can affect the immune recognition of viruses or regulate the function of adjacent cells. This article elaborates on the production and composition of exosomes and their roles in viral infection, as well as the research advances in the association between exosomes and HBV infection.

exosomes; hepatitis B virus; liver diseases

10.3969/j.issn.1001-5256.2017.08.010

2017-07-04；

2017-07-18。

賈小芳(1982-)，女，助理研究員，博士，主要從事傳染病蛋白質(zhì)組學(xué)研究。

袁正宏，電子信箱：zhyuan@shmu.edu.cn。

R512.62

A

1001-5256(2017)08-1465-06