纈沙坦對糖尿病腎病大鼠足細(xì)胞相關(guān)蛋白TRPC6的影響

李 禮，王彩麗*，米 焱，馮 濤

（內(nèi)蒙古包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古 包頭 014010）

瞬時受體電位陽離子通道亞型6（TRPC6）為新近發(fā)現(xiàn)的與蛋白尿發(fā)生密切相關(guān)的重要的足細(xì)胞膜蛋白，在腎小球中其主要表達(dá)于裂孔隔膜（slit diaphragm，SD）附近。糖尿病腎?。―N）作為終末期腎衰竭的主要病因，一直為臨床上的治療難點，而蛋白尿是促進(jìn)腎小球硬化的獨立危險原因，促進(jìn)腎臟病的發(fā)展，所以說減少DN蛋白尿、研究導(dǎo)致糖尿病腎病蛋白尿的發(fā)生機制是近幾年的研究熱點[1]。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔健康的40只雄性SD大鼠體重180～200 g。

1.2 藥物和試劑

纈沙坦由北京諾華制藥有限公司提供、鏈脲佐菌素、Trizol、PrimeScript TMRT Master Mix、RNA PCR Kit（AMV）（TaKaRa，大連）。

1.3 糖尿病大鼠模型的制備與分組情況

將40只雄性SD大鼠分為成兩個組別：正常對照組設(shè)置為NC組，數(shù)量為7、糖尿病腎病模型組，數(shù)量為33。全部模型均禁食過夜，糖尿病腎病模型組實施一次性腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）40 mg／kg，72小時后，測量大鼠的尾血隨機血糖，間隔一天測量其血糖水平，4周后測量其24小時尿蛋白定量，如果模型的隨機血糖水平連續(xù)2周大于16.7 mmol/l、24小時尿蛋白定量≥30 mg[3]，即可判定為建立糖尿病腎病模型成功。隨后對糖尿病腎病模型組依據(jù)體重情況再次實施分組：糖尿病腎病設(shè)為對照組（DN組，數(shù)量為11）、纈沙坦干預(yù)組H0組[10 mg/（kd·d），數(shù)量為11）]、纈沙坦干預(yù)組H1組[30 mg/（kd·d），數(shù)量為11）]，纈沙坦干預(yù)組模型連續(xù)用藥8周。

1.4 RT-PCR方法檢測TRPC6 mRNA表達(dá)

應(yīng)用經(jīng)典的Trizol法對腎臟組織總RNA進(jìn)行采集，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄RNA成cDNA，RT體系（10 μl）：Master Mix（2 μl）、RNA（6 μl）、ddH2O（2 μl）。

TRPC6擴增體系如下：cDNA 2 μl，Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus）（2×）12.5 μl，PCR Forward Primer（10 μM）1 μl，PCR Reverse Primer（10 μM）1 μl，DEPC水8.5 μl，終反應(yīng)體系25 μl。反應(yīng)的條件為：在95℃溫度下進(jìn)行預(yù)變性，在溫度為95℃的環(huán)境下實施變性，在溫度在58℃中退火，72℃延伸，共計30個循環(huán)，最后在溫度是72℃的環(huán)境下進(jìn)行延伸。PCR產(chǎn)物在溫度是4℃的環(huán)境中進(jìn)行保存。

取PCR產(chǎn)物5 μl和marker 5 μl，然后分別點樣在2%的瓊脂糖凝膠中實施電泳操作，經(jīng)過20分鐘后，在紫外光燈下進(jìn)行結(jié)果的觀察。把電泳后凝膠放在凝膠成像分析系統(tǒng)中，實施陽性條帶吸光度掃描并準(zhǔn)確記錄結(jié)果，使用betaactin作為內(nèi)參照校正，目的基因的吸光度和beta-actin吸光度的比值就顯示的是目的基因的相對表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用統(tǒng)計學(xué)軟件GraphPad Prism5對本實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，統(tǒng)計程序為單因子方差分析（one-way ANOVA）和相關(guān)分析（Correlation）。數(shù)據(jù)以±s表示。P＜0.05表示對比組之間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

干預(yù)8周后，應(yīng)用計算機定量實施分析后顯示，和NC組進(jìn)行對比，DN組的TRPC6 mRNA表達(dá)為上調(diào)，經(jīng)過比較，有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異（均P＜0.05）；和DN組進(jìn)行對比，H1組及H0組TRPC6 mRNA表達(dá)都顯示為下調(diào)，經(jīng)比較，有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異（均P＜0.05）；H1組和H0組進(jìn)行比較，TRPC6 mRNA表達(dá)發(fā)生下調(diào)，經(jīng)比較，有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異（均P＜0.05）。

3 討 論

目前有相關(guān)的研究結(jié)果顯示：TRPC通道參與了DM的發(fā)展過程。在2005年，Winn等首次報道了TRPC6基因突變產(chǎn)物會造成大量蛋白尿出現(xiàn)。本實驗通過RT-PCR方法顯示DKD大鼠足細(xì)胞裂孔膜分子TRPC6基因水平表達(dá)呈現(xiàn)不斷增加的趨勢，這個研究結(jié)果顯示：過度表達(dá)TRPC6會導(dǎo)致蛋白尿的出現(xiàn)，證實了TRPC6和蛋白尿是有一定的聯(lián)系的[2]。通過纈沙坦對TRPC6的表達(dá)進(jìn)行抑制，對臨床對蛋白尿的控制措施的制定是有幫助的。說明纈沙坦在一定范圍內(nèi)，其腎臟保護(hù)作用呈劑量依賴性[3]。

[1] 任直親,范 慧,李芳芳.纈沙坦對糖尿病腎病大鼠腎臟TRPC6表達(dá)的影響[J].糖尿病新世界,2016,19(11):48-49.

[2] 王彥江,謝席勝,王寶福,等.足細(xì)胞TRPC6與糖尿病腎病蛋白尿發(fā)生機制的研究新進(jìn)展[J].中國中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志,2012,13(8):747-749.

[3] 李 禮,王彩麗.足細(xì)胞TRPC6與糖尿病腎病相關(guān)的研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述,2014,20(5):872-874.