• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    實時熒光定量PCR非特異性分析*

    2017-03-06 12:44:48姜文燦岳素文何賞陳琛孫慧珍江洪王成彬
    臨床檢驗雜志 2017年5期
    關(guān)鍵詞:內(nèi)標探針定量

    姜文燦,岳素文,何賞,陳琛,孫慧珍,江洪,王成彬

    (1.中國人民解放軍總醫(yī)院臨檢科,北京 100853;2.北京泰格瑞分子檢驗有限公司,北京 100085;3.溫州醫(yī)科大學檢驗醫(yī)學院/生命科學學院,溫州 325000 )

    ·專題筆談·

    實時熒光定量PCR非特異性分析*

    姜文燦1,3,岳素文2,何賞1,陳琛1,孫慧珍1,江洪2,王成彬1,3

    (1.中國人民解放軍總醫(yī)院臨檢科,北京 100853;2.北京泰格瑞分子檢驗有限公司,北京 100085;3.溫州醫(yī)科大學檢驗醫(yī)學院/生命科學學院,溫州 325000 )

    聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)因靈敏度高、操作簡便在各個領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。然而,伴隨其高靈敏度存在的非特異性問題在一定程度上限制了其應(yīng)用。不同于普通檢測方法,該技術(shù)的非特異性問題主要由可以指數(shù)擴增的引物二聚體(primer dimer, PD)引起。對此,引物設(shè)計時使用的中部同序引物對可以從根本上避免PD的產(chǎn)生,從而解決由其引起的非特異性問題。該文從PCR的發(fā)展和本質(zhì)、PCR非特異性產(chǎn)生的原因和應(yīng)對策略等方面作一總結(jié)及分析。

    實時熒光定量PCR;非特異性;引物二聚體

    聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)是在體外模擬體內(nèi)核酸復制過程從而達到快速核酸檢測目的的一門核心技術(shù),相比于一般信號疊加的檢測方法,其具有指數(shù)放大的模式使靈敏度提升了上百萬倍。實時熒光定量PCR在傳統(tǒng)PCR基礎(chǔ)上加入信號系統(tǒng)對反應(yīng)過程進行實時監(jiān)測,繼承了傳統(tǒng)PCR靈敏度高和操作簡便的特點,實現(xiàn)了對樣本的定量檢測,并進一步提升了PCR技術(shù)的靈敏度。該技術(shù)在醫(yī)藥衛(wèi)生、生物科學、農(nóng)業(yè)科學等方面得到了廣泛的應(yīng)用[1-3]。然而,在進行PCR檢測時,其難以克服的非特異性問題在一定程度上限制了該技術(shù)的進一步臨床應(yīng)用。因此,本文從PCR的發(fā)展、非特異性問題產(chǎn)生的原因及解決非特異性問題進行討論,并以常用的探針法實時熒光定量PCR作為對象進行分析。

    1 PCR技術(shù)的發(fā)展和本質(zhì)

    PCR非特異性問題與其發(fā)展歷史和PCR的本質(zhì)密不可分。1953年Watson建立的DNA雙螺旋模型及半保留復制法則奠定了PCR擴增的分子基礎(chǔ);1971年Khorana等[4]發(fā)表了1篇核酸體外擴增相關(guān)論文;1985年,Wittwer等[5]根據(jù)指數(shù)擴增或幾何級數(shù)式放大的能力,發(fā)明了由一對特異引物結(jié)合、復制靶分子基因,體外(于試管內(nèi))模擬天然基因半保留復制的PCR擴增技術(shù)。然而,因同樣起始量的樣本經(jīng)PCR級聯(lián)放大以后變化太大而產(chǎn)量不均一,致使常規(guī)終末PCR難以定量檢測。1997年,采用動態(tài)實時檢測擴增對數(shù)期的循環(huán)數(shù)與靶初始量成反比(反對數(shù)關(guān)系)的封閉熒光定量PCR技術(shù)誕生。根據(jù)發(fā)光原理的不同,該技術(shù)主要分為熒光染料法PCR和各種熒光核酸探針PCR兩大類[6]。

    靶分子數(shù)量以2n級數(shù)激增,是PCR最核心的本質(zhì)。常規(guī)PCR通常進行30個熱循環(huán),而230約等于109,靶模板以如此高的擴增速度擴增是一般線性放大檢測方法無可比擬的,其靈敏度也遠遠大于普通的檢測方法?,F(xiàn)階段使用的實時熒光定量PCR技術(shù)通常反應(yīng)40個循環(huán),檢測靈敏度可達飛克級(10-15g)水平或數(shù)個分子。這也是PCR成為應(yīng)用最廣、最核心技術(shù)的根本原因。此外,其指數(shù)放大亦伴隨PCR高度的特異性,PCR特異性直接由引物的特異性決定,引物一端的非特異錯配擴增甚至完全配對擴增也僅是線性增大,自然遠遠趕不上指數(shù)擴增或幾何級數(shù)放大。另外,引物特異性少量的降低或與靶序列微弱的不匹配雖然也會導致擴增速率的下降,但這遠遠趕不上特異的指數(shù)或幾何級數(shù)放大,換而言之,靶模板進行指數(shù)擴增或幾何級數(shù)放大即可保證PCR擴增檢測的高特異性。除此之外,PCR的熔解曲線也具有極高的特異性,靶擴增產(chǎn)物顯示典型狹窄變性溫度,即特定Tm值。探針法PCR通過增加一條結(jié)合探針使特異性更有保證,但在多數(shù)情況下普通PCR的特異性已經(jīng)足夠,因此PCR非特異性也主要由指數(shù)放大或幾何放大這一本質(zhì)決定。

    2 PCR非特異性產(chǎn)生的原因

    2.1 引物模板非特異性結(jié)合 超靈敏且呈幾何級數(shù)放大的PCR技術(shù)在帶來高靈敏度檢測的同時也帶來難以克服的非特異障礙,如引物在低溫條件下非特異性結(jié)合模板所導致的非特異擴增等。然而,一方面,Taq酶在低于40 ℃時的環(huán)境中活性很低,不足以引起PCR出現(xiàn)非特異性擴增;另一方面,PCR反應(yīng)中僅一條引物與其他模板結(jié)合引起的非特異線性擴增為線性擴增,不能與靶模板的特異性指數(shù)擴增相比。故而低溫啟動不是非特異性出現(xiàn)的關(guān)鍵原因。

    2.2 引物二聚體(primer dimer, PD) PD是由引物間互為模板、互為引物所形成的,其指數(shù)擴增是引起PCR非特異性的根本原因,也是PCR反應(yīng)非特異性難以克服的根本原因。一般3′末端數(shù)個堿基連續(xù)反向互補的引物,在不加模板的本底染料法PCR擴增反應(yīng)中,約在幾個至十幾個循環(huán)處即出現(xiàn)可見的PD擴增;一對常規(guī)設(shè)計的引物本底PCR反應(yīng)的Ct值在30左右(這也是普通PCR只進行30個循環(huán)反應(yīng)的主要原因)。染料法實時熒光定量PCR所使用的嵌合染料可結(jié)合任何雙鏈產(chǎn)物,而反應(yīng)體系中PD在經(jīng)過30個熱循環(huán)之后出現(xiàn)明顯的指數(shù)擴增,因此PD的Ct值多在30左右,從而致使Ct值在30~38之間的低濃度靶分子無法區(qū)分是PD還是擴增產(chǎn)物(檢測時Ct值均顯示為30)。探針法實時熒光定量PCR中靶特異探針雖可繞開PD引起的假陽性,但高濃度的PD可與靶模板競爭靶引物,抑制了引物同低濃度靶模板的結(jié)合,從而限制了其檢測的靈敏度。

    2.3 汽霧膠污染 熒光定量PCR進程中,除螺旋蓋毛細管外,所謂的“閉管分析”多數(shù)情況下并不完全密閉,大多數(shù)0.2 mL PCR試管或96孔板,在熱循環(huán)95 ℃變性時,高溫高壓下就會有一些氣霧膠溢(擠)出管蓋。氣霧膠不僅含高濃度已擴增的陽性靶分子,更多的是一對過量引物間產(chǎn)生的小分子PD或引物-探針聚合體, 且每一個檢測反應(yīng)管/孔都會產(chǎn)生PD非特異性指數(shù)擴增。隨著重復,泄漏的污染物會反復地進行指數(shù)擴增、積聚,隨后的實時熒光定量PCR不是從第1個循環(huán)開始而是從上次PCR結(jié)束循環(huán)數(shù)開始,由此PCR污染物越來越嚴重。

    除上述情況外,常規(guī)PCR檢測中也會出現(xiàn)由于其他原因所造成的非特異性擴增,但均為非指數(shù)擴增,因此,只有一對引物均為非特異結(jié)合、延伸的擴增才能引起非特異性指數(shù)的擴增。PCR反應(yīng)的非特異性包括內(nèi)生PD和外源氣霧膠兩個方面,二者也會相互影響,內(nèi)生PD非特異性之源不消除就難以判斷氣霧膠控制效果;反之外源氣霧膠不控制就難以消除內(nèi)源PD引起的PCR非特異性。

    3 解決PCR非特異性的策略

    3.1 引物設(shè)計 在PCR體系穩(wěn)定的情況下,真正決定模板能否實現(xiàn)擴增的關(guān)鍵程序為引物設(shè)計。同樣,克服PCR非特異性的首要方法應(yīng)從引物設(shè)計入手。引物引起的指數(shù)非特異性主要源于其堿基序列,一對完全同序的引物絕對沒有引物非特異性。相同標簽輔助-無引物二聚體(homo-tag assisted non-dimer, HAND)技術(shù)采用完全同序引物標簽,通過引物二聚體單鏈5′端自身結(jié)合形成二級機構(gòu),抑制其與游離引物的結(jié)合,但該方法不僅顯著抑制PD的擴增,也沒有選擇性地減低了靶模板特異性擴增效率[7]。與此不同,另有學者根據(jù)一對完全同序引物絕沒有非特異性的現(xiàn)象,采用部分同序引物抑制PD的擴增,將“同序”置于引物中部偏3′端,能最大化地選擇性抑制PD擴增而不影響靶擴增效率[8];PCR體系中添加與引物中部同序部位配對結(jié)合的含反義堿基的Oligo,反義堿基的存在使其不能作為模板和非特異性延伸的起點,能進一步特異性地選擇放大對PD抑制的作用。在無3′末端反向互補常規(guī)引物設(shè)計原則基礎(chǔ)上,選擇中部6~8個堿基同序引物對和結(jié)合中部8~10個反義堿基Oligo在實時熒光定量PCR的40個循環(huán)反應(yīng)內(nèi),沒有PD非特異性擴增的干擾。配合礦物油封閉下的PCR成份緩釋策略,將徹底杜絕PD非特異性,通常選擇一端引物溶于高比重粘糖溶液并預先加入PCR管底部,再小心加入PCR其他成份反應(yīng)液及封閉油并保持一段時間分層,待PCR熱變性自動混勻熱啟動;加礦物油封閉不影響熒光光路但要避免熱蓋下的油面上濺起的PCR反應(yīng)液出現(xiàn)熱循環(huán)擴增及泄露,若出現(xiàn)反應(yīng)液泄露,也可由于缺少一端引物而成為無效的擴增及泄露。

    3.2 反應(yīng)體系優(yōu)化及技術(shù)改進 目前,各種控制非特異的措施如變化PCR組分、添加各種化學試劑等均得到一定程度的應(yīng)用。例如單鏈結(jié)合蛋白(single strand binding-protein,SSB)、基因32蛋白和引物結(jié)合反義堿基Oligo的使用,但其對特異與非特異擴增基本是平行的,顯著抑制PCR非特異性的同時也不同程度地干擾了靶特異性擴增效率。此外,對反應(yīng)體系使用熱啟動的策略也可以在一定程度上減輕非特異性問題,具體措施包括:蠟包中Mg2+離子熱釋放、聚合酶Taq修飾抑制(包括端N缺失的KlenTaq, 抗Taq酶抗體和Taq酶抑制寡核苷酸Aptamar,以及四氧化戊烷熱激活引物)等[9-11]。但多數(shù)低溫熱啟動作用有限,僅可以將非特異性擴增推后1~2個循環(huán),并不能解決后續(xù)的非特異性產(chǎn)物的指數(shù)擴增。而傳統(tǒng)使用的PCR預變性后手工加入PCR反應(yīng)組分的絕對熱啟動策略對非特異性出現(xiàn)的本底Ct值也僅推后1~3個循環(huán)。

    3.3 其他 為了控制產(chǎn)物氣霧膠污染,現(xiàn)在采用的策略還包括過濾系統(tǒng)、產(chǎn)品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范(good manufacturing practice,GMP)車間、P3/P4實驗室,然而擴增產(chǎn)物氣霧膠再污染僅靠過濾系統(tǒng)、GMP車間、P3/P4實驗室是隔絕不了的。對于氣霧膠再污染,可采用dUTP代替dTTP產(chǎn)物再結(jié)合尿嘧啶-DNA-糖基酶(UDG/UNG)降解絕大部分擴增產(chǎn)物的策略,但該方法對反應(yīng)過程中新產(chǎn)生的PD作用有限。

    不設(shè)置熱蓋的PCR儀器熒光光路必須均位于管底橫向讀取熒光,否則油面上的濺起液冷凝至管蓋會遮擋熒光。獨立設(shè)置的擴增室或物理隔絕的PCR儀器是防止外源氣霧膠再污染的最可靠策略。

    4 熒光探針PCR非特異性

    以最常用的TaqMan探針法實時熒光定量PCR為例,體系中引入一靶特異熒光標記探針,一方面靶探針不針對引物序列而不會結(jié)合PD非特異擴增產(chǎn)物,增加了一定的特異性。但PD的擴增在探針法PCR中不可見并不代表其不存在或不起作用,同引物雙重PCR相互間嚴重干擾、抑制;在共同引物的雙靶分子擴增條件下,濃度降低10倍的靶模板的擴增會被高濃度靶分子徹底抑制;本底Ct值為30的PD擴增競爭性抑制低一個數(shù)量級的低濃度靶分子擴增,PD非特異性降低了PCR系統(tǒng)靈敏度,低濃度樣本結(jié)果產(chǎn)生假陰性反應(yīng)[12-13]。采用中部同序引物推后本底Ct值也有助于提升探針法PCR的靈敏度。

    另一方面,過量引物與探針之間也產(chǎn)生一定程度的非特異聚合、延伸的擴增,不加靶模板的PCR本底系統(tǒng),一對引物與熒光標記TaqMan探針可產(chǎn)生Ct值為33~35的非特異性擴增曲線,且隨著反復的重復同一PCR擴增,其擴增平臺期熒光吸收峰值越來越高, Ct值也逐漸前移,產(chǎn)生一定的假陽性。探針自身兩兩結(jié)合的解鏈式TaqMan/水解探針(中國專利CN201510961208.4)一定程度有助于降低探針法PCR本底擴增[14]。

    由于一些如血液、泥土等樣本及提取時殘留的PCR抑制成分干擾或抑制PCR樣本檢測而產(chǎn)生假陰性反應(yīng)。從2000年開始逐步出現(xiàn)不同熒光波長的內(nèi)標擴增的探針法PCR報道,如通過內(nèi)標基因擴增監(jiān)測PCR抑制劑成分所造成的假陰性[15];到2010年采用管家基因等不同靶序列的內(nèi)標擴增探針法PCR成為常規(guī)標準程序。然而,不同序列的雙引物雙重PCR也存在一定相互干擾、抑制,低濃度的靶擴增逐漸被高濃度的靶分子所抑制,不同引物的內(nèi)標擴增非競爭性抑制更低濃度靶分子擴增和引物—探針間聚合的非特異本底擴增[16]。結(jié)果客觀上使所有陰性樣本全部陰性反應(yīng),商業(yè)探針法PCR試劑盒表面上看靈敏度高且沒有假陽性,而其本質(zhì)為內(nèi)標基因的存在抑制了引物—探針聚合產(chǎn)生的非特異性。過量的內(nèi)標擴增反而增加了系統(tǒng)假陰性,內(nèi)標的用量也尚無行業(yè)標準。

    內(nèi)標增加了系統(tǒng)復雜性。內(nèi)標引物與靶引物更加容易形成PD及多聚合擴增,非特異性本底Ct值(約為30)進一步前移,使PCR系統(tǒng)靈敏度進一步降低,反而提高了系統(tǒng)假陰性程度,然而,內(nèi)標用以監(jiān)測PCR抑制所導致的假陰性出現(xiàn),卻增加了假陰性。但降低PD非特異性的中部同序優(yōu)化引物和調(diào)整本底至Ct值近30時的對照內(nèi)標仍有一定的應(yīng)用效果。樣本中抑制劑的監(jiān)測可通過樣本添加模板質(zhì)粒、染料法PCR熔解曲線分析,或者調(diào)整PCR反應(yīng)基線來監(jiān)測,能上下波動的擴增基線顯示PCR沒有抑制。

    5 展望

    PCR技術(shù)自推出以來得到了飛速發(fā)展和廣泛應(yīng)用,顯示了其強大的生命力和發(fā)展?jié)摿?。由于其靈敏、特異、操作簡便等特點,現(xiàn)已成為分子檢測的核心技術(shù)之一,隨著該技術(shù)的普及,免疫結(jié)合PCR的分子診斷技術(shù)將得到推廣。如今,大批科研工作者基于核酸擴增原理對這一技術(shù)進行了不斷深入的研究和改良,使其特性得到了進一步的完善,并推出來其他核酸擴增技術(shù)。隨著科技的發(fā)展,檢測更準確、更迅速的PCR擴增儀將不斷被推出,聯(lián)合不斷革新的軟件分析技術(shù),該技術(shù)將得到進一步的推廣和應(yīng)用。

    [1]Tang J, Khan S, Delmiglio C,etal. Sensitive detection of Tomato ringspot virus by real-time TaqMan RT-PCR targeting the highly conserved 3′-UTR region [J]. J Virol Methods, 2014, 201:38-43.

    [2]Srivastava A, Sharma A, Yadav S,etal. Gene expression profiling of candidate genes in peripheral blood mononuclear cells for predicting toxicity of diesel exhaust particles[J]. Free Radic Biol Med, 2014,67:188-194.

    [3]Cho S, Ge J, Seo SB,etal. Age estimation via quantification of signal-joint T cell receptor excision circles in Koreans[J]. Leg Med (Tokyo), 2014,16(3):135-138.

    [4]Kleppe K, Ohtsuka E, Kleppe R,etal. Studies on polynucleotides. XCVI. Repair replications of short synthetic DNA′s as catalyzed by DNA polymerases[J]. J Mol Biol, 1971, 56 (2):341-361.

    [5]Wittwer CT, Herrmann MG, Moss AA,etal. Continuous fluorescence monitoring of rapid cycle DNA amplification[J]. Biotechniques,1997, 54(6):314-320.

    [6]Navarro E, Serrano-Heras G, Castao MJ,etal. Real-time PCR detection chemistry[J]. Clin Chim Acta, 2015, 439:231-250.

    [7]Brownie J, Shawcross S, Theaker J,etal. The elimination of primer-dimer accumulation in PCR[J]. Nucleic Acids Res, 1997, 25(16):3235-3241.

    [8]北京泰格瑞分子檢驗有限公司.一種引物中部序列干擾PCR技術(shù):中國,CN201210550086.6[P].2013-5-22.

    [9]Kellogg DE, Rybalkin I, Chen S,etal. TaqStart Antibody: "hot start" PCR facilitated by a neutralizing monoclonal antibody directed against Taq DNA polymerase[J]. Biotechniques, 1994, 16(6):1134-1137.

    [10]Lin Y, Jayasena SD. Inhibition of multiple thermostable DNA polymerases by a heterodimeric aptamer[J]. J Mol Biol,1997, 271(1):100-111.

    [11]Lebedev AV, Paul N, Yee J,etal. Hot start PCR with heat-activatable primers: a novel approach for improved PCR performance[J]. Nucleic Acids Res,2008, 36(20): e131.

    [12]Satterfield BC. Cooperative primes: 2.5 million-fold improvement in the reduction of nonspecific amplification[J]. J Mol Diagn, 2014, 16(2): 163-173.

    [13]姜文燦,岳素文,江洪,等. TaqMan探針法實時熒光定量PCR的應(yīng)用和研究進展[J]. 臨床檢驗雜志(電子版), 2015, 4(1):797-805.

    [14]北京泰格瑞分子檢驗有限公司.一種解鏈式水解探針實時熒光PCR:中國,CN201510961208.4[P]. 2016-3-16.

    [15]Ham S, Harrison C, Southwick G,etal. Selection of internal control genes for analysis of gene expression in normal and diseased human dermal fibroblasts using quantitative real-time PCR[J]. Exp Dermatol,2016,25(11):911-914.

    [16]姜文燦,岳素文,江洪,等. 影響內(nèi)標雙重PCR靶模板檢測靈敏度的因素分析[J]. 臨床檢驗雜志, 2016, 34(4):244-246.

    (本文編輯:許曉蒙)

    10.13602/j.cnki.jcls.2017.05.14

    國家重大科學儀器設(shè)備開發(fā)專項(2012YQ03026107)。

    姜文燦,1992年生,男,碩士研究生,主要從事分子生物學研究。

    王成彬,主任醫(yī)師,教授,博士研究生導師,E-mail: wangcbin301@163.com;江洪,博士,E-mail: tagarray@163.com。

    R446.6

    A

    2017-02-07)

    猜你喜歡
    內(nèi)標探針定量
    氣相色譜內(nèi)標法測洗滌劑中的甲醇
    有機熱載體熱穩(wěn)定性測定內(nèi)標法的研究
    顯微定量法鑒別林下山參和園參
    當歸和歐當歸的定性與定量鑒別
    中成藥(2018年12期)2018-12-29 12:25:44
    GC內(nèi)標法同時測定青刺果油中4種脂肪酸
    中成藥(2018年6期)2018-07-11 03:01:32
    10 種中藥制劑中柴胡的定量測定
    中成藥(2017年6期)2017-06-13 07:30:35
    多通道Taqman-探針熒光定量PCR鑒定MRSA方法的建立
    BOPIM-dma作為BSA Site Ⅰ特異性探針的研究及其應(yīng)用
    核磁共振磷譜內(nèi)標法測定磷脂酰膽堿的含量
    慢性HBV感染不同狀態(tài)下HBsAg定量的臨床意義
    黄片wwwwww| 18+在线观看网站| 乱码一卡2卡4卡精品| a级毛色黄片| 欧美xxxx性猛交bbbb| 亚洲国产精品成人久久小说| 青春草亚洲视频在线观看| 亚洲内射少妇av| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 欧美国产精品一级二级三级 | 久久久久久久久久久丰满| 国产视频首页在线观看| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 国产人妻一区二区三区在| 亚洲四区av| 免费观看的影片在线观看| 国模一区二区三区四区视频| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 综合色丁香网| 亚洲高清免费不卡视频| 丝袜脚勾引网站| 国产精品久久久久久久久免| 亚洲久久久久久中文字幕| 久久精品国产a三级三级三级| 久久99热6这里只有精品| 国产亚洲av嫩草精品影院| 国产片特级美女逼逼视频| 99久国产av精品国产电影| 18禁在线播放成人免费| 国产乱人视频| 天堂中文最新版在线下载 | 国产av码专区亚洲av| 国产精品国产av在线观看| 免费av观看视频| 国产一区二区三区综合在线观看 | av国产免费在线观看| 一级二级三级毛片免费看| 婷婷色综合www| 国产日韩欧美亚洲二区| 国产高清不卡午夜福利| 成人国产av品久久久| 少妇高潮的动态图| 成人欧美大片| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| videos熟女内射| 男人添女人高潮全过程视频| 国产精品国产av在线观看| av天堂中文字幕网| 黄片无遮挡物在线观看| 国产成人免费观看mmmm| 最新中文字幕久久久久| 国产精品福利在线免费观看| 亚洲欧美日韩无卡精品| 日韩制服骚丝袜av| 欧美国产精品一级二级三级 | 亚洲,一卡二卡三卡| 女人被狂操c到高潮| 久久久精品免费免费高清| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 亚洲国产成人一精品久久久| 精品一区在线观看国产| 亚洲欧洲日产国产| 18禁在线播放成人免费| 老司机影院成人| 免费在线观看成人毛片| 大码成人一级视频| 亚洲怡红院男人天堂| 九九在线视频观看精品| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 国产精品精品国产色婷婷| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 国产精品av视频在线免费观看| 丰满人妻一区二区三区视频av| 丰满人妻一区二区三区视频av| 五月玫瑰六月丁香| 一级片'在线观看视频| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 久久99蜜桃精品久久| 国产黄频视频在线观看| 成人国产麻豆网| 麻豆国产97在线/欧美| 日韩强制内射视频| 在线观看三级黄色| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 男女边吃奶边做爰视频| 搡老乐熟女国产| 一级毛片我不卡| 欧美日本视频| 中国美白少妇内射xxxbb| 天堂网av新在线| av在线app专区| 97在线人人人人妻| 免费少妇av软件| 欧美高清成人免费视频www| h日本视频在线播放| 国产探花极品一区二区| 日韩欧美一区视频在线观看 | 精品久久久久久久久亚洲| 欧美bdsm另类| 日本wwww免费看| 国产精品久久久久久精品电影| 97在线视频观看| 久久精品久久精品一区二区三区| 大片免费播放器 马上看| 亚洲四区av| 97精品久久久久久久久久精品| 亚洲人与动物交配视频| 亚洲人成网站在线播| 免费av观看视频| 男女边摸边吃奶| 综合色av麻豆| 激情 狠狠 欧美| 在线观看国产h片| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 久久精品国产亚洲av涩爱| 哪个播放器可以免费观看大片| 久久人人爽av亚洲精品天堂 | 亚洲在久久综合| 婷婷色综合大香蕉| 在线观看免费高清a一片| 大话2 男鬼变身卡| 亚洲av日韩在线播放| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 啦啦啦中文免费视频观看日本| 久久6这里有精品| 91久久精品国产一区二区成人| 美女内射精品一级片tv| 国产中年淑女户外野战色| 色视频www国产| 久久久久久久大尺度免费视频| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 人人妻人人看人人澡| 亚洲国产高清在线一区二区三| 看非洲黑人一级黄片| 99久久精品热视频| 亚洲伊人久久精品综合| 中国三级夫妇交换| 亚洲欧洲日产国产| 丝袜美腿在线中文| 性色avwww在线观看| 成年免费大片在线观看| 久久精品国产a三级三级三级| 白带黄色成豆腐渣| 久久久国产一区二区| 欧美xxxx性猛交bbbb| 在线精品无人区一区二区三 | 午夜亚洲福利在线播放| 极品少妇高潮喷水抽搐| 国产精品一区二区性色av| 在线观看一区二区三区| 水蜜桃什么品种好| 大香蕉久久网| 大片电影免费在线观看免费| 人妻系列 视频| 搞女人的毛片| 国产伦精品一区二区三区视频9| 超碰av人人做人人爽久久| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 国产精品不卡视频一区二区| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 久久午夜福利片| 一级爰片在线观看| 国产精品无大码| 91精品伊人久久大香线蕉| 九九爱精品视频在线观看| 在线天堂最新版资源| 国产成年人精品一区二区| 丝袜脚勾引网站| 日韩成人伦理影院| 97超视频在线观看视频| 啦啦啦啦在线视频资源| 国产伦理片在线播放av一区| 永久网站在线| 亚洲电影在线观看av| 午夜福利网站1000一区二区三区| 中文欧美无线码| 少妇的逼好多水| 一区二区三区乱码不卡18| 晚上一个人看的免费电影| 色5月婷婷丁香| 婷婷色麻豆天堂久久| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 又爽又黄a免费视频| 三级国产精品欧美在线观看| 最近中文字幕高清免费大全6| 乱码一卡2卡4卡精品| 日日啪夜夜撸| 国产精品嫩草影院av在线观看| 国产成人午夜福利电影在线观看| av免费在线看不卡| 韩国av在线不卡| 看十八女毛片水多多多| 精品一区在线观看国产| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 亚洲精品自拍成人| 亚洲va在线va天堂va国产| 波多野结衣巨乳人妻| 最新中文字幕久久久久| a级毛色黄片| 欧美区成人在线视频| 久久久久久国产a免费观看| 如何舔出高潮| 亚洲精品自拍成人| 亚洲av免费高清在线观看| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 国产精品成人在线| 久久人人爽av亚洲精品天堂 | 国产片特级美女逼逼视频| 91精品国产九色| 中文字幕久久专区| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 免费av毛片视频| 亚洲va在线va天堂va国产| 别揉我奶头 嗯啊视频| 亚洲精品一二三| h日本视频在线播放| 午夜日本视频在线| 一边亲一边摸免费视频| 日韩免费高清中文字幕av| 99久久人妻综合| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 啦啦啦在线观看免费高清www| 在线 av 中文字幕| 最近中文字幕2019免费版| 成人漫画全彩无遮挡| tube8黄色片| 久久99蜜桃精品久久| 国产亚洲精品久久久com| 久久精品国产亚洲av涩爱| 日韩三级伦理在线观看| 久久久久久久久久久丰满| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 男插女下体视频免费在线播放| 在线播放无遮挡| 美女国产视频在线观看| 晚上一个人看的免费电影| 中文字幕制服av| 色网站视频免费| 欧美一区二区亚洲| 男女无遮挡免费网站观看| 五月伊人婷婷丁香| 久久久久九九精品影院| 国产v大片淫在线免费观看| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 人妻夜夜爽99麻豆av| 日韩三级伦理在线观看| 亚洲av免费高清在线观看| 亚洲丝袜综合中文字幕| 三级国产精品欧美在线观看| 亚洲国产欧美人成| 亚洲国产精品成人久久小说| 看黄色毛片网站| 国产高清不卡午夜福利| 男人舔奶头视频| 久久久久久久午夜电影| 亚洲精品一区蜜桃| 日本午夜av视频| 亚洲精品日本国产第一区| 伊人久久精品亚洲午夜| 嫩草影院精品99| 真实男女啪啪啪动态图| 久久99热这里只有精品18| 99热全是精品| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 国产精品嫩草影院av在线观看| 成人免费观看视频高清| 精品国产三级普通话版| 午夜亚洲福利在线播放| 精品视频人人做人人爽| 日韩大片免费观看网站| 丝瓜视频免费看黄片| 神马国产精品三级电影在线观看| 乱系列少妇在线播放| 高清午夜精品一区二区三区| 嫩草影院入口| 亚洲欧美日韩东京热| 亚洲精品国产成人久久av| 国产 一区 欧美 日韩| av免费观看日本| 欧美成人a在线观看| 99久久人妻综合| 国产爱豆传媒在线观看| 99久国产av精品国产电影| 国产成人精品福利久久| 午夜亚洲福利在线播放| 麻豆成人av视频| 久久久久久久午夜电影| 日韩欧美一区视频在线观看 | 久久久午夜欧美精品| 高清欧美精品videossex| 女人久久www免费人成看片| 欧美一区二区亚洲| 亚洲无线观看免费| 一级二级三级毛片免费看| 精品一区二区三卡| 国产成人精品婷婷| 国产69精品久久久久777片| 波多野结衣巨乳人妻| 成人毛片a级毛片在线播放| 欧美bdsm另类| 熟女人妻精品中文字幕| 成人毛片a级毛片在线播放| 欧美成人一区二区免费高清观看| 亚洲性久久影院| 深夜a级毛片| 777米奇影视久久| 亚洲四区av| 另类亚洲欧美激情| 我的女老师完整版在线观看| 国产精品蜜桃在线观看| 国产亚洲5aaaaa淫片| 熟女人妻精品中文字幕| 中文字幕av成人在线电影| 亚洲精品日本国产第一区| 大陆偷拍与自拍| 国产av国产精品国产| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 久久久精品欧美日韩精品| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 中国三级夫妇交换| 国产日韩欧美亚洲二区| 高清日韩中文字幕在线| 又爽又黄a免费视频| 日韩精品有码人妻一区| 欧美极品一区二区三区四区| 亚洲自拍偷在线| 日韩一区二区三区影片| 国产精品偷伦视频观看了| 熟女人妻精品中文字幕| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 亚洲成人久久爱视频| 麻豆久久精品国产亚洲av| 国产在视频线精品| 国产精品一区二区在线观看99| 中国国产av一级| 人人妻人人看人人澡| 高清av免费在线| 欧美一级a爱片免费观看看| 中国三级夫妇交换| 国产日韩欧美亚洲二区| 黄片wwwwww| a级毛色黄片| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 热99国产精品久久久久久7| 老女人水多毛片| 亚洲精品一二三| 久久久成人免费电影| 国产 精品1| 赤兔流量卡办理| 美女主播在线视频| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 亚洲在线观看片| 街头女战士在线观看网站| 男插女下体视频免费在线播放| 尾随美女入室| 丰满人妻一区二区三区视频av| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 精华霜和精华液先用哪个| 少妇人妻 视频| 欧美激情在线99| 国产爽快片一区二区三区| 男的添女的下面高潮视频| 精品久久久久久久末码| 精品久久久噜噜| 国产黄频视频在线观看| 午夜爱爱视频在线播放| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 国产乱来视频区| 国产黄色免费在线视频| 女人被狂操c到高潮| 91aial.com中文字幕在线观看| 人妻系列 视频| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 熟女人妻精品中文字幕| av在线观看视频网站免费| 熟女人妻精品中文字幕| 男人舔奶头视频| 99热全是精品| 亚洲精品视频女| 在线免费十八禁| 国产av码专区亚洲av| 久久6这里有精品| av国产久精品久网站免费入址| 一区二区三区乱码不卡18| 久久久久久久久久成人| 国国产精品蜜臀av免费| 免费观看性生交大片5| 精品人妻一区二区三区麻豆| .国产精品久久| 青春草亚洲视频在线观看| 97在线人人人人妻| 久久精品国产自在天天线| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 九九在线视频观看精品| 一二三四中文在线观看免费高清| 精品一区二区免费观看| a级毛色黄片| 麻豆久久精品国产亚洲av| 观看美女的网站| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 精品久久久久久久久亚洲| 久久精品久久久久久久性| 亚洲精品亚洲一区二区| 97热精品久久久久久| 99久久九九国产精品国产免费| 欧美一区二区亚洲| 精品视频人人做人人爽| 色吧在线观看| 青春草国产在线视频| 国产免费一级a男人的天堂| 亚洲va在线va天堂va国产| 伊人久久精品亚洲午夜| 男女边吃奶边做爰视频| 九九爱精品视频在线观看| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 亚洲精品色激情综合| 亚洲成人一二三区av| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 一边亲一边摸免费视频| 亚洲国产成人一精品久久久| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 我要看日韩黄色一级片| 亚洲人与动物交配视频| 亚洲无线观看免费| xxx大片免费视频| 国产一级毛片在线| 亚洲av日韩在线播放| 亚洲色图综合在线观看| 久热这里只有精品99| 久久精品国产自在天天线| 韩国高清视频一区二区三区| 国产 一区精品| 超碰97精品在线观看| 黄片wwwwww| 中文字幕免费在线视频6| 日韩制服骚丝袜av| 男女那种视频在线观看| 午夜激情久久久久久久| kizo精华| 嫩草影院新地址| 黄色配什么色好看| 六月丁香七月| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 国产高清有码在线观看视频| 成人亚洲精品一区在线观看 | 久久ye,这里只有精品| 十八禁网站网址无遮挡 | av国产精品久久久久影院| 久久女婷五月综合色啪小说 | av福利片在线观看| 日本欧美国产在线视频| 亚洲真实伦在线观看| 国产欧美日韩一区二区三区在线 | 欧美老熟妇乱子伦牲交| 91久久精品国产一区二区成人| 高清午夜精品一区二区三区| 最近的中文字幕免费完整| 亚洲欧美精品专区久久| 日日啪夜夜爽| 国产男女内射视频| 欧美激情国产日韩精品一区| 国产av国产精品国产| 亚洲经典国产精华液单| 一本久久精品| 三级国产精品欧美在线观看| 国产精品国产三级国产专区5o| 91aial.com中文字幕在线观看| 99热这里只有是精品在线观看| 寂寞人妻少妇视频99o| 久久97久久精品| 91精品一卡2卡3卡4卡| 亚洲精品久久午夜乱码| .国产精品久久| 99久久精品国产国产毛片| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 三级国产精品欧美在线观看| 禁无遮挡网站| 永久免费av网站大全| 乱系列少妇在线播放| 免费高清在线观看视频在线观看| 久久久久久久大尺度免费视频| 草草在线视频免费看| 真实男女啪啪啪动态图| 国产精品爽爽va在线观看网站| 欧美激情国产日韩精品一区| 亚洲国产最新在线播放| 久久热精品热| 亚洲久久久久久中文字幕| 亚州av有码| 国产精品不卡视频一区二区| 一区二区三区免费毛片| 高清午夜精品一区二区三区| 男插女下体视频免费在线播放| 亚洲国产高清在线一区二区三| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 亚洲欧美清纯卡通| av福利片在线观看| 欧美成人a在线观看| 久久精品国产亚洲av涩爱| 成人漫画全彩无遮挡| 97超碰精品成人国产| 激情五月婷婷亚洲| 国产成人精品一,二区| 亚洲精品乱久久久久久| 欧美成人午夜免费资源| 国产伦精品一区二区三区视频9| 免费黄网站久久成人精品| 在线观看一区二区三区| 熟妇人妻不卡中文字幕| 26uuu在线亚洲综合色| 内地一区二区视频在线| 99久久中文字幕三级久久日本| 赤兔流量卡办理| av卡一久久| 国产成人精品久久久久久| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 日本免费在线观看一区| 日韩av不卡免费在线播放| 日韩强制内射视频| 可以在线观看毛片的网站| 色哟哟·www| 亚洲丝袜综合中文字幕| 一级片'在线观看视频| 美女被艹到高潮喷水动态| 国产精品三级大全| 人妻 亚洲 视频| 亚洲国产精品专区欧美| 乱码一卡2卡4卡精品| 国产一区亚洲一区在线观看| 精品一区二区三卡| 免费av毛片视频| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 免费av毛片视频| 观看免费一级毛片| xxx大片免费视频| 国产欧美日韩精品一区二区| a级毛片免费高清观看在线播放| a级一级毛片免费在线观看| 91久久精品国产一区二区三区| 亚洲精品一二三| 一区二区三区乱码不卡18| 国产黄色免费在线视频| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 亚洲av电影在线观看一区二区三区 | 久久99热这里只有精品18| 午夜免费男女啪啪视频观看| 成人无遮挡网站| 只有这里有精品99| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 在线观看美女被高潮喷水网站| 天堂中文最新版在线下载 | 亚洲精品自拍成人| 精品人妻一区二区三区麻豆| 久久综合国产亚洲精品| 亚洲电影在线观看av| 免费看日本二区| 2018国产大陆天天弄谢| 岛国毛片在线播放| 51国产日韩欧美| 国产伦精品一区二区三区视频9| 国产精品99久久99久久久不卡 | 特大巨黑吊av在线直播| 国产男人的电影天堂91| 国产又色又爽无遮挡免| 视频中文字幕在线观看| 网址你懂的国产日韩在线| 日本一二三区视频观看| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 直男gayav资源| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 九九在线视频观看精品| 又爽又黄无遮挡网站| 2018国产大陆天天弄谢| 成人亚洲精品一区在线观看 | 高清在线视频一区二区三区| 亚洲欧洲日产国产| 伦精品一区二区三区| 亚洲国产精品成人综合色| 亚洲成色77777| 在现免费观看毛片| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 如何舔出高潮| 国产精品一及| av专区在线播放| 在线观看国产h片| 国产欧美亚洲国产| 日韩免费高清中文字幕av| 国产永久视频网站| 免费看日本二区| 国产成人91sexporn| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 一级毛片久久久久久久久女| 1000部很黄的大片| 亚洲精品一区蜜桃| 综合色丁香网| 日韩人妻高清精品专区| 国产综合懂色| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 九九在线视频观看精品| 久久久久国产精品人妻一区二区| eeuss影院久久| av在线app专区| 久久久久久国产a免费观看| 亚洲在久久综合| 插阴视频在线观看视频| 久久热精品热| 中文字幕亚洲精品专区| 最近最新中文字幕免费大全7| av专区在线播放| 亚洲精品久久午夜乱码| 国产男女超爽视频在线观看| 丝袜脚勾引网站| 哪个播放器可以免费观看大片| 乱码一卡2卡4卡精品|