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    實時熒光定量PCR非特異性分析*

    2017-03-06 12:44:48姜文燦岳素文何賞陳琛孫慧珍江洪王成彬
    臨床檢驗雜志 2017年5期
    關(guān)鍵詞:內(nèi)標探針定量

    姜文燦,岳素文,何賞,陳琛,孫慧珍,江洪,王成彬

    (1.中國人民解放軍總醫(yī)院臨檢科,北京 100853;2.北京泰格瑞分子檢驗有限公司,北京 100085;3.溫州醫(yī)科大學檢驗醫(yī)學院/生命科學學院,溫州 325000 )

    ·專題筆談·

    實時熒光定量PCR非特異性分析*

    姜文燦1,3,岳素文2,何賞1,陳琛1,孫慧珍1,江洪2,王成彬1,3

    (1.中國人民解放軍總醫(yī)院臨檢科,北京 100853;2.北京泰格瑞分子檢驗有限公司,北京 100085;3.溫州醫(yī)科大學檢驗醫(yī)學院/生命科學學院,溫州 325000 )

    聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)因靈敏度高、操作簡便在各個領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。然而,伴隨其高靈敏度存在的非特異性問題在一定程度上限制了其應(yīng)用。不同于普通檢測方法,該技術(shù)的非特異性問題主要由可以指數(shù)擴增的引物二聚體(primer dimer, PD)引起。對此,引物設(shè)計時使用的中部同序引物對可以從根本上避免PD的產(chǎn)生,從而解決由其引起的非特異性問題。該文從PCR的發(fā)展和本質(zhì)、PCR非特異性產(chǎn)生的原因和應(yīng)對策略等方面作一總結(jié)及分析。

    實時熒光定量PCR;非特異性;引物二聚體

    聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)是在體外模擬體內(nèi)核酸復制過程從而達到快速核酸檢測目的的一門核心技術(shù),相比于一般信號疊加的檢測方法,其具有指數(shù)放大的模式使靈敏度提升了上百萬倍。實時熒光定量PCR在傳統(tǒng)PCR基礎(chǔ)上加入信號系統(tǒng)對反應(yīng)過程進行實時監(jiān)測,繼承了傳統(tǒng)PCR靈敏度高和操作簡便的特點,實現(xiàn)了對樣本的定量檢測,并進一步提升了PCR技術(shù)的靈敏度。該技術(shù)在醫(yī)藥衛(wèi)生、生物科學、農(nóng)業(yè)科學等方面得到了廣泛的應(yīng)用[1-3]。然而,在進行PCR檢測時,其難以克服的非特異性問題在一定程度上限制了該技術(shù)的進一步臨床應(yīng)用。因此,本文從PCR的發(fā)展、非特異性問題產(chǎn)生的原因及解決非特異性問題進行討論,并以常用的探針法實時熒光定量PCR作為對象進行分析。

    1 PCR技術(shù)的發(fā)展和本質(zhì)

    PCR非特異性問題與其發(fā)展歷史和PCR的本質(zhì)密不可分。1953年Watson建立的DNA雙螺旋模型及半保留復制法則奠定了PCR擴增的分子基礎(chǔ);1971年Khorana等[4]發(fā)表了1篇核酸體外擴增相關(guān)論文;1985年,Wittwer等[5]根據(jù)指數(shù)擴增或幾何級數(shù)式放大的能力,發(fā)明了由一對特異引物結(jié)合、復制靶分子基因,體外(于試管內(nèi))模擬天然基因半保留復制的PCR擴增技術(shù)。然而,因同樣起始量的樣本經(jīng)PCR級聯(lián)放大以后變化太大而產(chǎn)量不均一,致使常規(guī)終末PCR難以定量檢測。1997年,采用動態(tài)實時檢測擴增對數(shù)期的循環(huán)數(shù)與靶初始量成反比(反對數(shù)關(guān)系)的封閉熒光定量PCR技術(shù)誕生。根據(jù)發(fā)光原理的不同,該技術(shù)主要分為熒光染料法PCR和各種熒光核酸探針PCR兩大類[6]。

    靶分子數(shù)量以2n級數(shù)激增,是PCR最核心的本質(zhì)。常規(guī)PCR通常進行30個熱循環(huán),而230約等于109,靶模板以如此高的擴增速度擴增是一般線性放大檢測方法無可比擬的,其靈敏度也遠遠大于普通的檢測方法?,F(xiàn)階段使用的實時熒光定量PCR技術(shù)通常反應(yīng)40個循環(huán),檢測靈敏度可達飛克級(10-15g)水平或數(shù)個分子。這也是PCR成為應(yīng)用最廣、最核心技術(shù)的根本原因。此外,其指數(shù)放大亦伴隨PCR高度的特異性,PCR特異性直接由引物的特異性決定,引物一端的非特異錯配擴增甚至完全配對擴增也僅是線性增大,自然遠遠趕不上指數(shù)擴增或幾何級數(shù)放大。另外,引物特異性少量的降低或與靶序列微弱的不匹配雖然也會導致擴增速率的下降,但這遠遠趕不上特異的指數(shù)或幾何級數(shù)放大,換而言之,靶模板進行指數(shù)擴增或幾何級數(shù)放大即可保證PCR擴增檢測的高特異性。除此之外,PCR的熔解曲線也具有極高的特異性,靶擴增產(chǎn)物顯示典型狹窄變性溫度,即特定Tm值。探針法PCR通過增加一條結(jié)合探針使特異性更有保證,但在多數(shù)情況下普通PCR的特異性已經(jīng)足夠,因此PCR非特異性也主要由指數(shù)放大或幾何放大這一本質(zhì)決定。

    2 PCR非特異性產(chǎn)生的原因

    2.1 引物模板非特異性結(jié)合 超靈敏且呈幾何級數(shù)放大的PCR技術(shù)在帶來高靈敏度檢測的同時也帶來難以克服的非特異障礙,如引物在低溫條件下非特異性結(jié)合模板所導致的非特異擴增等。然而,一方面,Taq酶在低于40 ℃時的環(huán)境中活性很低,不足以引起PCR出現(xiàn)非特異性擴增;另一方面,PCR反應(yīng)中僅一條引物與其他模板結(jié)合引起的非特異線性擴增為線性擴增,不能與靶模板的特異性指數(shù)擴增相比。故而低溫啟動不是非特異性出現(xiàn)的關(guān)鍵原因。

    2.2 引物二聚體(primer dimer, PD) PD是由引物間互為模板、互為引物所形成的,其指數(shù)擴增是引起PCR非特異性的根本原因,也是PCR反應(yīng)非特異性難以克服的根本原因。一般3′末端數(shù)個堿基連續(xù)反向互補的引物,在不加模板的本底染料法PCR擴增反應(yīng)中,約在幾個至十幾個循環(huán)處即出現(xiàn)可見的PD擴增;一對常規(guī)設(shè)計的引物本底PCR反應(yīng)的Ct值在30左右(這也是普通PCR只進行30個循環(huán)反應(yīng)的主要原因)。染料法實時熒光定量PCR所使用的嵌合染料可結(jié)合任何雙鏈產(chǎn)物,而反應(yīng)體系中PD在經(jīng)過30個熱循環(huán)之后出現(xiàn)明顯的指數(shù)擴增,因此PD的Ct值多在30左右,從而致使Ct值在30~38之間的低濃度靶分子無法區(qū)分是PD還是擴增產(chǎn)物(檢測時Ct值均顯示為30)。探針法實時熒光定量PCR中靶特異探針雖可繞開PD引起的假陽性,但高濃度的PD可與靶模板競爭靶引物,抑制了引物同低濃度靶模板的結(jié)合,從而限制了其檢測的靈敏度。

    2.3 汽霧膠污染 熒光定量PCR進程中,除螺旋蓋毛細管外,所謂的“閉管分析”多數(shù)情況下并不完全密閉,大多數(shù)0.2 mL PCR試管或96孔板,在熱循環(huán)95 ℃變性時,高溫高壓下就會有一些氣霧膠溢(擠)出管蓋。氣霧膠不僅含高濃度已擴增的陽性靶分子,更多的是一對過量引物間產(chǎn)生的小分子PD或引物-探針聚合體, 且每一個檢測反應(yīng)管/孔都會產(chǎn)生PD非特異性指數(shù)擴增。隨著重復,泄漏的污染物會反復地進行指數(shù)擴增、積聚,隨后的實時熒光定量PCR不是從第1個循環(huán)開始而是從上次PCR結(jié)束循環(huán)數(shù)開始,由此PCR污染物越來越嚴重。

    除上述情況外,常規(guī)PCR檢測中也會出現(xiàn)由于其他原因所造成的非特異性擴增,但均為非指數(shù)擴增,因此,只有一對引物均為非特異結(jié)合、延伸的擴增才能引起非特異性指數(shù)的擴增。PCR反應(yīng)的非特異性包括內(nèi)生PD和外源氣霧膠兩個方面,二者也會相互影響,內(nèi)生PD非特異性之源不消除就難以判斷氣霧膠控制效果;反之外源氣霧膠不控制就難以消除內(nèi)源PD引起的PCR非特異性。

    3 解決PCR非特異性的策略

    3.1 引物設(shè)計 在PCR體系穩(wěn)定的情況下,真正決定模板能否實現(xiàn)擴增的關(guān)鍵程序為引物設(shè)計。同樣,克服PCR非特異性的首要方法應(yīng)從引物設(shè)計入手。引物引起的指數(shù)非特異性主要源于其堿基序列,一對完全同序的引物絕對沒有引物非特異性。相同標簽輔助-無引物二聚體(homo-tag assisted non-dimer, HAND)技術(shù)采用完全同序引物標簽,通過引物二聚體單鏈5′端自身結(jié)合形成二級機構(gòu),抑制其與游離引物的結(jié)合,但該方法不僅顯著抑制PD的擴增,也沒有選擇性地減低了靶模板特異性擴增效率[7]。與此不同,另有學者根據(jù)一對完全同序引物絕沒有非特異性的現(xiàn)象,采用部分同序引物抑制PD的擴增,將“同序”置于引物中部偏3′端,能最大化地選擇性抑制PD擴增而不影響靶擴增效率[8];PCR體系中添加與引物中部同序部位配對結(jié)合的含反義堿基的Oligo,反義堿基的存在使其不能作為模板和非特異性延伸的起點,能進一步特異性地選擇放大對PD抑制的作用。在無3′末端反向互補常規(guī)引物設(shè)計原則基礎(chǔ)上,選擇中部6~8個堿基同序引物對和結(jié)合中部8~10個反義堿基Oligo在實時熒光定量PCR的40個循環(huán)反應(yīng)內(nèi),沒有PD非特異性擴增的干擾。配合礦物油封閉下的PCR成份緩釋策略,將徹底杜絕PD非特異性,通常選擇一端引物溶于高比重粘糖溶液并預先加入PCR管底部,再小心加入PCR其他成份反應(yīng)液及封閉油并保持一段時間分層,待PCR熱變性自動混勻熱啟動;加礦物油封閉不影響熒光光路但要避免熱蓋下的油面上濺起的PCR反應(yīng)液出現(xiàn)熱循環(huán)擴增及泄露,若出現(xiàn)反應(yīng)液泄露,也可由于缺少一端引物而成為無效的擴增及泄露。

    3.2 反應(yīng)體系優(yōu)化及技術(shù)改進 目前,各種控制非特異的措施如變化PCR組分、添加各種化學試劑等均得到一定程度的應(yīng)用。例如單鏈結(jié)合蛋白(single strand binding-protein,SSB)、基因32蛋白和引物結(jié)合反義堿基Oligo的使用,但其對特異與非特異擴增基本是平行的,顯著抑制PCR非特異性的同時也不同程度地干擾了靶特異性擴增效率。此外,對反應(yīng)體系使用熱啟動的策略也可以在一定程度上減輕非特異性問題,具體措施包括:蠟包中Mg2+離子熱釋放、聚合酶Taq修飾抑制(包括端N缺失的KlenTaq, 抗Taq酶抗體和Taq酶抑制寡核苷酸Aptamar,以及四氧化戊烷熱激活引物)等[9-11]。但多數(shù)低溫熱啟動作用有限,僅可以將非特異性擴增推后1~2個循環(huán),并不能解決后續(xù)的非特異性產(chǎn)物的指數(shù)擴增。而傳統(tǒng)使用的PCR預變性后手工加入PCR反應(yīng)組分的絕對熱啟動策略對非特異性出現(xiàn)的本底Ct值也僅推后1~3個循環(huán)。

    3.3 其他 為了控制產(chǎn)物氣霧膠污染,現(xiàn)在采用的策略還包括過濾系統(tǒng)、產(chǎn)品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范(good manufacturing practice,GMP)車間、P3/P4實驗室,然而擴增產(chǎn)物氣霧膠再污染僅靠過濾系統(tǒng)、GMP車間、P3/P4實驗室是隔絕不了的。對于氣霧膠再污染,可采用dUTP代替dTTP產(chǎn)物再結(jié)合尿嘧啶-DNA-糖基酶(UDG/UNG)降解絕大部分擴增產(chǎn)物的策略,但該方法對反應(yīng)過程中新產(chǎn)生的PD作用有限。

    不設(shè)置熱蓋的PCR儀器熒光光路必須均位于管底橫向讀取熒光,否則油面上的濺起液冷凝至管蓋會遮擋熒光。獨立設(shè)置的擴增室或物理隔絕的PCR儀器是防止外源氣霧膠再污染的最可靠策略。

    4 熒光探針PCR非特異性

    以最常用的TaqMan探針法實時熒光定量PCR為例,體系中引入一靶特異熒光標記探針,一方面靶探針不針對引物序列而不會結(jié)合PD非特異擴增產(chǎn)物,增加了一定的特異性。但PD的擴增在探針法PCR中不可見并不代表其不存在或不起作用,同引物雙重PCR相互間嚴重干擾、抑制;在共同引物的雙靶分子擴增條件下,濃度降低10倍的靶模板的擴增會被高濃度靶分子徹底抑制;本底Ct值為30的PD擴增競爭性抑制低一個數(shù)量級的低濃度靶分子擴增,PD非特異性降低了PCR系統(tǒng)靈敏度,低濃度樣本結(jié)果產(chǎn)生假陰性反應(yīng)[12-13]。采用中部同序引物推后本底Ct值也有助于提升探針法PCR的靈敏度。

    另一方面,過量引物與探針之間也產(chǎn)生一定程度的非特異聚合、延伸的擴增,不加靶模板的PCR本底系統(tǒng),一對引物與熒光標記TaqMan探針可產(chǎn)生Ct值為33~35的非特異性擴增曲線,且隨著反復的重復同一PCR擴增,其擴增平臺期熒光吸收峰值越來越高, Ct值也逐漸前移,產(chǎn)生一定的假陽性。探針自身兩兩結(jié)合的解鏈式TaqMan/水解探針(中國專利CN201510961208.4)一定程度有助于降低探針法PCR本底擴增[14]。

    由于一些如血液、泥土等樣本及提取時殘留的PCR抑制成分干擾或抑制PCR樣本檢測而產(chǎn)生假陰性反應(yīng)。從2000年開始逐步出現(xiàn)不同熒光波長的內(nèi)標擴增的探針法PCR報道,如通過內(nèi)標基因擴增監(jiān)測PCR抑制劑成分所造成的假陰性[15];到2010年采用管家基因等不同靶序列的內(nèi)標擴增探針法PCR成為常規(guī)標準程序。然而,不同序列的雙引物雙重PCR也存在一定相互干擾、抑制,低濃度的靶擴增逐漸被高濃度的靶分子所抑制,不同引物的內(nèi)標擴增非競爭性抑制更低濃度靶分子擴增和引物—探針間聚合的非特異本底擴增[16]。結(jié)果客觀上使所有陰性樣本全部陰性反應(yīng),商業(yè)探針法PCR試劑盒表面上看靈敏度高且沒有假陽性,而其本質(zhì)為內(nèi)標基因的存在抑制了引物—探針聚合產(chǎn)生的非特異性。過量的內(nèi)標擴增反而增加了系統(tǒng)假陰性,內(nèi)標的用量也尚無行業(yè)標準。

    內(nèi)標增加了系統(tǒng)復雜性。內(nèi)標引物與靶引物更加容易形成PD及多聚合擴增,非特異性本底Ct值(約為30)進一步前移,使PCR系統(tǒng)靈敏度進一步降低,反而提高了系統(tǒng)假陰性程度,然而,內(nèi)標用以監(jiān)測PCR抑制所導致的假陰性出現(xiàn),卻增加了假陰性。但降低PD非特異性的中部同序優(yōu)化引物和調(diào)整本底至Ct值近30時的對照內(nèi)標仍有一定的應(yīng)用效果。樣本中抑制劑的監(jiān)測可通過樣本添加模板質(zhì)粒、染料法PCR熔解曲線分析,或者調(diào)整PCR反應(yīng)基線來監(jiān)測,能上下波動的擴增基線顯示PCR沒有抑制。

    5 展望

    PCR技術(shù)自推出以來得到了飛速發(fā)展和廣泛應(yīng)用,顯示了其強大的生命力和發(fā)展?jié)摿?。由于其靈敏、特異、操作簡便等特點,現(xiàn)已成為分子檢測的核心技術(shù)之一,隨著該技術(shù)的普及,免疫結(jié)合PCR的分子診斷技術(shù)將得到推廣。如今,大批科研工作者基于核酸擴增原理對這一技術(shù)進行了不斷深入的研究和改良,使其特性得到了進一步的完善,并推出來其他核酸擴增技術(shù)。隨著科技的發(fā)展,檢測更準確、更迅速的PCR擴增儀將不斷被推出,聯(lián)合不斷革新的軟件分析技術(shù),該技術(shù)將得到進一步的推廣和應(yīng)用。

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    (本文編輯:許曉蒙)

    10.13602/j.cnki.jcls.2017.05.14

    國家重大科學儀器設(shè)備開發(fā)專項(2012YQ03026107)。

    姜文燦,1992年生,男,碩士研究生,主要從事分子生物學研究。

    王成彬,主任醫(yī)師,教授,博士研究生導師,E-mail: wangcbin301@163.com;江洪,博士,E-mail: tagarray@163.com。

    R446.6

    A

    2017-02-07)

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