周忠波
血瘀證大腸癌與外周血多藥耐藥基因mRNA表達(dá)的相關(guān)性
周忠波
目的:探討血瘀證大腸癌與外周血多藥耐藥基因(MDR-1)mRNA表達(dá)的相關(guān)性。方法:運(yùn)用“證素辨證”的方法,對(duì)65例初診大腸癌患者進(jìn)行證素辨證,同時(shí)應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)其外周血MDR-1基因mRNA表達(dá)情況,探討血瘀證大腸癌與外周血MDR-1基因mRNA表達(dá)的關(guān)系。結(jié)果:65例中,血瘀組42例(64.6%),非血瘀組23例(35.4%);血瘀組與非血瘀組大腸癌病理分化程度存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。與非血瘀組比較,血瘀組高分化比例較低,而低分化比例較高。血瘀組與非血瘀組臨床病理分期差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);血瘀組Ⅲ、Ⅳ期人數(shù)比例明顯高于非血瘀組(P<0.05)。血瘀組外周血中MDR-1的相對(duì)表達(dá)量均數(shù)為0.872±0.257,明顯高于非血瘀組的(0.436±0.124)(P<0.05)。結(jié)論:血瘀證大腸癌與外周血MDR-1基因mRNA的表達(dá)水平存在相關(guān)性。
大腸癌;多藥耐藥基因;實(shí)時(shí)熒光定量PCR;血瘀證
我國(guó)結(jié)腸癌、直腸癌發(fā)病率分別為12.69/(10萬(wàn))、11.72/(10萬(wàn)),居惡性腫瘤發(fā)病率第5、6位[1]。血瘀證是各種腫瘤常見(jiàn)的臨床證候,腫瘤患者血液處于濃、黏、聚、凝的“高凝狀態(tài)”[2],并貫穿于腫瘤的發(fā)生、增殖、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移不同的病理階段。大部分大腸癌對(duì)化學(xué)治療的敏感性較差,腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生多藥耐藥(multidrug resistance,MDR)是化療失敗最常見(jiàn)而又難以解決的問(wèn)題之一[3-4]。活血化瘀類中藥不僅在腫瘤的治療中得到了廣泛的應(yīng)用,而且還具有逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥的作用。血瘀證與大腸癌多藥耐藥之間相關(guān)性如何,目前尚缺少這方面的臨床研究。2013年1月—2015年7月,我們對(duì)65例大腸癌患者進(jìn)行分析,以探討血瘀證大腸癌與外周血MDR-1基因mRNA表達(dá)的關(guān)系。
1.1 臨床資料 本組共65例,多以便血、大便次數(shù)增多、腹痛、不完全性腸梗阻等癥狀來(lái)診,均經(jīng)結(jié)腸鏡取病理行病理學(xué)檢查確診(腺癌55例,其他類型10例)。男39例,女26例;年齡30~82歲,中位年齡(54.37±11.25)歲。腺癌中病理高分化11例,中分化32例,低分化12例。臨床分期I期8例,II期14例,III期28例,IV期15例。根據(jù)血瘀證素的診斷閾值,進(jìn)一步分為血瘀組(42例)與非血瘀組(23例)。
1.2 中醫(yī)證素診斷標(biāo)準(zhǔn) 參照文獻(xiàn)[5]、[6]對(duì)癥狀輕、中、重程度的定義,制定規(guī)范的四診資料采集量表。在四診基礎(chǔ)上,按證素辨證方法進(jìn)行辨證,采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)術(shù)語(yǔ),以各癥狀要素積分和閾值法確定證候及血瘀證素的權(quán)重。血瘀證素的診斷的確定以100作為通用閾值,各癥狀對(duì)各辨證要素貢獻(xiàn)度之和達(dá)到或超100即可診斷。每一癥狀的輕重以中等程度為準(zhǔn),若該癥狀重,其定量診斷值乘1.5;若該癥狀輕,乘0.7。
1.3 標(biāo)本采集 于病理診斷明確之后,空腹采集靜脈血2 mL,肝素抗凝,分離得到白細(xì)胞后放入1.5 mL Ep管中,加入Trizol l mL。
1.4 總RNA提取及純度分析 使用Trizol RNA提取試劑盒,按照說(shuō)明書提取白細(xì)胞總RNA,用1%瓊脂糖電泳檢測(cè)所提取RNA的完整性,并用蛋白核酸測(cè)定儀DU800測(cè)定A260/A280比值在1.9~2.1之間。
1.5 引物合成 從GENEBANK上查找MDR-1基因堿基序列,應(yīng)用primerex-press2.0軟件設(shè)計(jì)引物,并由大連寶生物公司合成。引物序列見(jiàn)表1。
表1 目的基因及管家基因的引物序列
1.6 逆轉(zhuǎn)錄 按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa Code DDRR037A)操作說(shuō)明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)體系:Rnase Free dH2O 3 μL,Olig dT Primer(50 μM)1 μL,Random 6 mers(100 μM)1 μL,5×PrimeScript Buffer 4 μL,PrimeScript RT Enzyme Mix 1 μL,100 ng/μL Total RNA 10 μL,共20 μL,所得cDNA于-20℃保存。
1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 應(yīng)用SYBR Green II熒光嵌合法。反應(yīng)體系:SYBR PremixEx Taq II(2×)(TaKa-Ra Code DRR081A)12.5 μ L,PCR Forward Primer(10 μM)1 μL,PCR Reverse Primer(10 μM)1 μL,Rnase Free dH2O 8.5 μL,cDNA 2 μL,共25 μL。在Thermal Cycler Dice Real Time System TP800 3.00D系統(tǒng)進(jìn)行,以β-actin為內(nèi)參基因,應(yīng)用雙標(biāo)曲線法求出各樣品MDR-1基因的相對(duì)表達(dá)量。
1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 13.0,計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,組間差異采用t檢驗(yàn),計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn),以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 血瘀組與非血瘀組間外周血MDR-1基因表達(dá)水平比較 應(yīng)用雙標(biāo)曲線法根據(jù)樣品的Ct值分別得到目的基因和管家基因的初始模板量。經(jīng)管家基因的均一化處理,分別得到MDR-1基因的相對(duì)含量,見(jiàn)表2。大腸癌血瘀組外周血中MDR-1相對(duì)表達(dá)量低于血瘀組(P<0.05)。
表2 血瘀組與非血瘀組間外周血MDR-1基因的表達(dá)水平的比較()
表2 血瘀組與非血瘀組間外周血MDR-1基因的表達(dá)水平的比較()
注:與非血瘀組比較,aP<0.05
組別血瘀組非血瘀組n 42 23 MDR-1 0.872±0.257a0.436±0.124
2.2 血瘀證與病理分化程度、臨床分期的關(guān)系 血瘀組與非血瘀組高、中、低分化腺癌的總體構(gòu)成比不同,χ2=6.457,P<0.05,存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與非血瘀組比較,血瘀組高分化比例較低(P<0.05),而低分化比例較高(P<0.05),見(jiàn)表3。
表3 血瘀組與非血瘀組腺癌病理分化程度比較(n,%)
從分期情況看,經(jīng)卡方檢驗(yàn),血瘀組與非血瘀組臨床分期總體構(gòu)成比不同,χ2=11.308,P<0.05;血瘀組Ⅲ、Ⅳ期人數(shù)比例明顯高于非血瘀組(P<0.05),見(jiàn)表4。
血瘀證是包括大腸癌在內(nèi)的各種腫瘤最常見(jiàn)的一種臨床證候。祖國(guó)醫(yī)學(xué)常把腫瘤歸屬于中醫(yī)的“瘕積聚”、“瘕病”、“虛勞”等范疇,認(rèn)為其發(fā)生多由情志郁結(jié)、飲食所傷,寒邪外襲以及病后體虛等以致肝脾受損、臟腑失和、氣機(jī)阻滯、瘀血內(nèi)停或兼痰濕凝滯而成積聚。究其病機(jī),主要是氣滯而導(dǎo)致血瘀內(nèi)停,故“血瘀證”為腫瘤的一個(gè)基本證型?!饵S帝內(nèi)經(jīng)》已論及腫瘤與血瘀證的關(guān)系,其后歷代醫(yī)家對(duì)血瘀與腫瘤的密切關(guān)系也都有所認(rèn)識(shí)。現(xiàn)代多數(shù)臨床和實(shí)驗(yàn)研究也證實(shí),腫瘤與血瘀密切相關(guān)[7]。有研究表明,幾乎所有癌癥患者的局部或全身均存在高凝狀態(tài)[8]。腫瘤患者血液處于濃、黏、聚、凝的“高凝狀態(tài)”,被證實(shí)為腫瘤血瘀證,并貫穿于腫瘤的發(fā)生、增殖、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移不同的病理階段[9-10]。賈小強(qiáng)等[11]研究發(fā)現(xiàn),血瘀證大腸癌與病理類型、腫瘤浸潤(rùn)深度、侵犯周徑、病理分期、轉(zhuǎn)移情況等存在相關(guān)性,黃健飛等[12]的研究發(fā)現(xiàn),熱毒血瘀證與乳腺癌的肺轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。
表4 血瘀證與臨床病理分期的關(guān)系(n,%)
腫瘤的耐藥性是腫瘤化療失敗的主要原因之一。多數(shù)人體腫瘤組織內(nèi)存在MDR基因[13],大腸癌存在MDR基因高表達(dá)[14-15],其化療過(guò)程中的耐藥問(wèn)題十分突出。MDR指由一種藥物誘發(fā),而同時(shí)對(duì)其他多種結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制完全不同的抗癌藥產(chǎn)生交叉耐藥的一種現(xiàn)象。腫瘤產(chǎn)生耐藥有多種因素,如非典型的MDR、MDR-1基因及其編碼產(chǎn)物P-gp糖蛋白的過(guò)度表達(dá)、肺耐藥相關(guān)基因及肺耐藥相關(guān)蛋白表達(dá)增加、MDR相關(guān)蛋白基因表達(dá)增高等。其中最重要的是MDR-1基因的過(guò)度表達(dá)及其編碼產(chǎn)物P-糖蛋白的增多[16]。近年來(lái),關(guān)于腫瘤的MDR機(jī)制及逆轉(zhuǎn)劑的研究成為當(dāng)前腫瘤化療的研究熱點(diǎn),但化學(xué)逆轉(zhuǎn)劑往往只針對(duì)其中的一種機(jī)制,而難以達(dá)到理想的治療效果。中藥具有多組分、多靶點(diǎn)、多階段性作用特點(diǎn),可以針對(duì)腫瘤MDR的多種機(jī)制進(jìn)行有效的逆轉(zhuǎn)?;钛龇ㄊ桥R床治療腫瘤常用的治法,活血化瘀類中藥在逆轉(zhuǎn)腫瘤MDR方面的研究也頗多。因此,探討血瘀證大腸癌與外周血MDR-1基因表達(dá)的關(guān)系,不僅可以為血瘀證大腸癌辨證提供客觀指標(biāo),也可以為中藥逆轉(zhuǎn)腫瘤MDR方面的研究提供依據(jù)。
本研究結(jié)果表明,65例大腸癌患者血瘀組42例(64.6%),非血瘀組23例(35.4%)。血瘀證與病理分化程度、臨床分期存在一定的相關(guān)性。血淤組與非血淤組大腸癌病理分化程度存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,與非血瘀組比較血瘀組高分化比例較低,而低分化比例較高。從分期情況看,血淤組與非血淤組臨床病理分期差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,血瘀組Ⅲ、Ⅳ期人數(shù)比例明顯高于非血瘀組。這與賈小強(qiáng)等[11]的研究結(jié)果一致。大腸癌血瘀組外周血中MDR-1的相對(duì)表達(dá)量均數(shù)為0.872±0.257,明顯高于非血瘀組的0.436± 0.124,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示我們,血瘀型大腸癌患者存在MDR-1高表達(dá),在臨床上選擇化療方案時(shí)應(yīng)避開(kāi)MDR藥物外,還可以使用MDR拮抗劑。這也說(shuō)明,為什么多種活血化瘀類中藥具有逆轉(zhuǎn)腫瘤MDR的功能。本文只是研究了MDR-1表達(dá)水平與血瘀證的關(guān)系,但腫瘤細(xì)胞的耐藥機(jī)制是十分復(fù)雜的,臨床表現(xiàn)為耐藥時(shí),既可能是一種耐藥機(jī)制起作用,又可能是多種耐藥機(jī)制共同作用的結(jié)果。因此,在以后的研究中應(yīng)聯(lián)合檢測(cè)多個(gè)MDR指標(biāo),綜合探討與中醫(yī)證型的關(guān)系,才能更好地指導(dǎo)臨床研究,發(fā)現(xiàn)更加有效的逆轉(zhuǎn)腫瘤MDR中藥種類。
[1]張思維,陳萬(wàn)青,雷正龍,等.中國(guó)腫瘤登記處2004年惡性腫瘤發(fā)病資料分析[J].中國(guó)腫瘤,2008,17(11):909-912.
[2]田同德,儲(chǔ)真真,陳信義.惡性腫瘤高凝狀態(tài)與血瘀證相關(guān)性及中醫(yī)防治對(duì)策研究[J].北京中醫(yī)藥,2009,28(6):425-427.
[3]Pickett J,London E.The neuropathology of autism:a review[J].J Neuropathol Exp Neurol,2005,64(11):925-935.
[4]Stark AK,Pelvig DP,Jorgensen AM,et al.Measuring morphological and cellular changes in Alzheimer's dementia:a review emphasizing stereology[J].Curr Alzheimer Res,2005,2(4):449-481.
[5]中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)中醫(yī)診斷學(xué)分會(huì).中醫(yī)常見(jiàn)證診斷標(biāo)準(zhǔn)(上)[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2008,28(5):3-8.
[6]中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)中醫(yī)診斷學(xué)分會(huì).中醫(yī)常見(jiàn)證診斷標(biāo)準(zhǔn)(下)[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2008,28(6):3-10.
[7]袁海燕,李素娟.惡性腫瘤血瘀證研究[J].遼寧中醫(yī)雜志,2005,32 (7):663-664.
[8]陸化.惡性腫瘤與血栓形成[J].醫(yī)學(xué)綜述,2001,7(9):524-526.
[9]劉永惠,楊曉峰,周冬枝.腫瘤血瘀證實(shí)質(zhì)及活血化瘀治則的研究[J].河北中醫(yī),2002,24(4):252-254.
[10]劉永惠,楊曉峰,周冬枝,等.腫瘤轉(zhuǎn)移與血瘀證的臨床研究[J].中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志,2002,8(4):50-51,58.
[11]賈小強(qiáng),林國(guó)樂(lè).大腸癌血瘀證與腫瘤生物學(xué)行為相關(guān)性的前瞻性研究[J].中國(guó)肛腸病雜志,2005,25(4):25-27.
[12]黃健飛,郭勇.基于生物活體發(fā)光術(shù)觀察寒凝血瘀證及熱毒血瘀證與BALB/c小鼠4T1乳腺癌肺轉(zhuǎn)移的相關(guān)性研究[J].中華中醫(yī)藥雜志,2016,31(3):1085-1088.
[13]齊雪玲,馬建平,于民,等.多耐藥基因在多種腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)[J].新疆醫(yī)學(xué),30(4):237.
[14]柳忠美,李彥文,華培顯.多藥耐藥基因在人體腫瘤組織中的檢測(cè)及其意義[J].腫瘤研究與臨床,2003,3(15):156-158.
[15]陳慧玲.腫瘤多藥耐藥的研究進(jìn)展[J].臨床腫瘤學(xué)雜志,2008,13(5):475-477.
[16]Wang BL,Zhai HY,Chen BY,et al.Clinical relationship between MDR1 gene and gallbladder cancer[J].Hepatobiliary PancreatDis Int,2004,3(2):296-299.
(收稿:2016-05-20 修回:2016-11-22)
(責(zé)任編輯 周振理)
Relevance in Blood Stasis Syndrome of Colorectal Cancer and Expression of Multidrug Resistance-1gene mRNA in Peripheral Blood
ZHOU Zhong-bo Department of Anus&Colorectal Surgery,Maternal and Child Health Hospital of Linzi District,Zibo City(255400),China
ObjectiveTo exploring the relationship between expression of multidrug resistance-1(MDR-1) and blood stasis syndrome of colorectal cancer.MethodsSixty-five patients with colorectal cancer were determined for different syndromes according to syndrome factor differentiation.MDR-1 mRNA were detected by Real-time fluorescent quantitative from peripheral blood of primary carcinoma of colon and rectum,and to detect its comparably correlation to blood stasis syndrome of colorectal cancer.ResultsThere were 42 patients in blood stasis group and 23 patients in non-blood stasis group,with statistical significance in differentiation of pathology between two groups(P<0.05).Compared with non-syndrome of blood stasis,there was a lower proportion of high differentiation adenocarcinoma and a higher proportion of low differentiation adenocarcinoma in syndrome of blood stasis(P<0.05),with clinical statistical significance between two groups(P<0.05).The proportion of phase III,IV among syndrome of blood stasis was significantly higher than that among non-syndrome of blood stasis(P<0.05).The average expression level of MDR-1 gene was 0.872±0.257 in syndrome of blood stasis and 0.436±0.124 in non-syndrome of blood stasis,showing significant differences between the two groups (P<0.05).ConclusionExpression of MDR-1 in peripheral blood of patients with colorectal cancer shows association with blood stasis syndrome.
Colorectal carcinoma;multidrug resistance gene;real-time fluorescent quantitative PCR;syndrome of blood stasis
R735.3+4
A
1007-6948(2017)01-0007-04
10.3969/j.issn.1007-6948.2017.01.002
山東省淄博市臨淄區(qū)婦幼保健院肛腸科(淄博 255400)
周忠波,E-mail:973588978@qq.com