考馬斯亮藍G—250染色法測定苜蓿中可溶性蛋白含量

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摘要：蛋白質(zhì)的存在，會影響到酸堿測定中所用的某些指示劑的顏色變化，從而會改變?nèi)玖系墓馕?。因此在此基礎(chǔ)上發(fā)展了蛋白質(zhì)的染色測定方法，所涉及的指示劑目前最為廣泛使用的染料就是考馬斯亮藍。該文分析了考馬斯亮藍G-250染色法，測定苜蓿中的可溶性蛋白含量。

關(guān)鍵詞：考馬斯亮藍；苜蓿；蛋白含量

可溶性蛋白是屬于蛋白質(zhì)的一種，由于生物體內(nèi)主要吸收利用的是可溶性蛋白，即可溶性蛋白含量高的植物開發(fā)價值高。苜蓿是一種葉蛋白含量較高的植物，但是，其中可溶性蛋白與總蛋白含量不一定成正比例關(guān)系。目前也沒有相關(guān)苜蓿中可溶性蛋白含量的報道，因此我們在苜蓿葉蛋白含量測定基礎(chǔ)上對其可溶性蛋白進行了測定。通過對蛋白質(zhì)含量分析、了解為苜蓿資源評價提供參考依據(jù)。鑒于一般植物體內(nèi)可溶性蛋白含量較低的特點，我們采用具有消耗蛋白質(zhì)量小、靈敏度高、受外界因素影響小等特點的考馬斯亮藍G-250染色法（CBB）來測定[1，2]。

考馬斯亮藍G-250在游離狀態(tài)下呈紅色，與蛋白質(zhì)結(jié)合則呈現(xiàn)藍色。染料的最大吸收從465 nm變?yōu)?95 nm，蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物具有很高的消光系數(shù)，因此蛋白質(zhì)測定的靈敏度較高，最低檢出量為1 ug蛋白質(zhì)。染料與蛋白質(zhì)的結(jié)合，大約只需2 min，結(jié)合物的顏色在1 h內(nèi)是穩(wěn)定的（測定須在1 h內(nèi)完成）。一定范圍內(nèi)，溶液在595 nm波長下的吸光度與蛋白質(zhì)含量成正比，可用比色法測定。本法試劑配制簡單，操作簡便快捷，靈敏度高，測定范圍1-1000 ug 。

1 儀器、材料及試劑

Cary50紫外分光光度計；牛血清蛋白進口分裝；考馬斯亮藍G-250進口分裝（上海新型化工試劑研究所）；其他藥品試劑均為國產(chǎn)分析純。新鮮苜蓿

2 標準溶液及樣品浸體液制備

蛋白質(zhì)標準溶液的制備：稱取牛血清蛋白25 mg，加水溶解并定容至100 mL（250 μg/mL），再吸取上述溶液40 mL，用蒸餾水稀釋至100 mL即可（100 μg/mL），所配置標準儲備液須在冰箱中保存。

考馬斯亮藍G-250溶液制備：準確稱取100.00 mg考馬斯亮藍G-250溶于50 mL90%乙醇中，再加入85%（W/V）磷酸100 mL，最后用蒸餾水定容至1000 mL。此溶液在常溫下可放置一個月。

樣品浸體液制備 ：稱取苜蓿干樣0.07 g（其他植物樣品按蛋白質(zhì)含量而定大約干樣0.05-0.07 g，新鮮樣0.5 g左右），加少量石英砂用蒸餾水研磨成勻漿定容至100 mL，靜置10-30 min（期間搖動數(shù)次）過濾（含色素可用活性炭脫色），過濾定容至10 mL。

3 檢測結(jié)果及討論

3.1 標準曲線繪制

取6支試管，按表1，數(shù)據(jù)配制0-100 μg/mL血清白蛋白液各1.0 mL。準確吸取所配各管溶液0.1 mL，分別放入10 mL具塞試管中，加入5 mL考馬斯亮藍G-250試劑，蓋塞，反轉(zhuǎn)混合數(shù)次，放置2 min后，在595 nm下比色，所測數(shù)據(jù)以蛋白含量（X）為橫坐標以吸光度（A）為縱坐標進行線性回歸分析，回歸方程為：A=1.13265×C=4.3743，R=0.9927。

3.2 重現(xiàn)性試驗

準確稱取同一種樣品5份（1號樣），按“樣品浸體液制備”和“標準曲線繪制”項下操作，測定吸光度，RSD%=1.6，具體測定值如表2。

3.3 加標回收率試驗

準確稱取一支含量的樣品（2號樣），分別加入一定量的牛血清蛋白，按"樣品浸提液制備"和“標準曲線繪制”項下操作，測定吸光度，平均回收率為97%，RSD%=3.7。具體結(jié)果見表3。

3.4 前處理方法改進試驗

我們根據(jù)實驗室儀器設(shè)備以及樣品條件在浸提方法上與傳統(tǒng)提取方法進行對比改進，進行了一定的改進，使得浸提樣品方便快捷，并能達到浸提完全。 具體處理方法及數(shù)據(jù)見表4。

由表4結(jié)果可見，方法②、③前處理效果比④、⑤、⑥方案浸提更完全，測定樣品可溶性蛋白濃度值根接近經(jīng)典方法，而與①比較方法②是樣品浸提方案中最簡便、快捷、測定準確的前處理方案。

3.5 顯色穩(wěn)定性試驗

準確稱?。?號）樣品0.7 g，按“樣品浸提夜制備”及“標準曲線繪制”項下操作，每隔一定的時間測定一次吸收度，結(jié)果表明，再顯色3 h內(nèi)吸收無變化。

4 討論

本研究通過考馬斯亮藍G-250染色法對苜蓿中較低濃度的可溶性蛋白含量進行測定以了解苜蓿中可溶性蛋白含量的情況，并進行處理方法篩選，確定測定低濃度蛋白質(zhì)的最佳條件。結(jié)果表明：

考馬斯亮藍G-250染色法測定蛋白質(zhì)含量，在一定蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)（1-1000 μg）蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍G-250結(jié)合物在595 nm波長下的吸光度于蛋白質(zhì)含量成正比符合朗貝比爾定律，故可用于蛋白質(zhì)含量的測定。

CBB染色法是定量測定低濃度蛋白質(zhì)溶液的快速、靈敏的方法，但在應(yīng)用中我們發(fā)現(xiàn)CBB染色法測定的吸收度值與蛋白質(zhì)濃度的線性關(guān)系明顯，但平行測定的相同濃度的吸收度變化較大，影響測定結(jié)果的準確性。

為了驗證考馬斯亮藍G-250染色法的準確性，我們進行了重復(fù)性試驗對每個樣品測定3次，求得樣品的平均值，其可溶性蛋白18.45-14.42 g/kg的范圍，由RSD=1.6%可知結(jié)果是較穩(wěn)定的，該方法對苜蓿中可溶性蛋白測定結(jié)果較準確。

參考文獻

[1] 王愛軍，王鳳山，王友聯(lián)，等. 低濃度蛋白質(zhì)含量測定方法的比較[J]. 中國生化藥物雜志，2003.24（2）：78-80.

[2] 王衛(wèi)國，吳強，胡寶坤，等. 幾種測定灰樹花多糖中蛋白質(zhì)含量方法的比較研究[J]. 2003，22（1）：27-30.

[3] 李建武，余瑞元，等. 生物化學(xué)實驗原理和方法[M]. 北京：北京大學(xué)出版社，1994.160-176.