谷氨酸鹽對(duì)膽囊收縮素引發(fā)的灌流摘出胰臟外分泌的影響

李娜+姜成哲+崔正云

摘 要：本實(shí)驗(yàn)的目的在于觀察胰島？茁細(xì)胞分泌的內(nèi)源性GABA對(duì)胰臟外分泌的影響。胰臟外分泌由10pM濃度CCK喚起，GABA的前導(dǎo)物質(zhì)谷氨酸鹽以（1，4，10mM）濃度從開始CCK刺激45分鐘前實(shí)施到實(shí)驗(yàn)結(jié)束。胰液被收集后檢測(cè)其總分泌量和淀粉酶產(chǎn)量。GABAA受體拮抗劑荷包牡丹鹼（10？滋M）對(duì)胰臟外分泌的影響也被記錄。門靜脈流出液中的GABA含量也被測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果強(qiáng)烈地提示谷氨酸鹽能夠促進(jìn)大鼠胰島？茁細(xì)胞分泌GABA到胰島-腺泡細(xì)胞門脈體系并通過GABAA受體加強(qiáng)由CCK引起的胰臟外分泌。

關(guān)鍵詞：胰臟；膽囊收縮素；γ-氨基丁酸

前言

胰臟是分泌胰島素等的內(nèi)分泌部，分散在分泌胰蛋白酶等消化酶及重碳酸離子（HCO3-）、水份的外分泌部的混合腺體器官。流入胰臟的血液的大部分直接供應(yīng)到外分泌部，有約10%在內(nèi)分泌部形成毛細(xì)血管網(wǎng)后再于外分泌部形成毛細(xì)血管網(wǎng)，即經(jīng)過所謂的胰島-腺泡細(xì)胞門脈體系再經(jīng)內(nèi)分泌部再供應(yīng)到外分泌部[1]。胰臟的外分泌功能主要通過分布在胰臟的自律神經(jīng)系統(tǒng)和胃腸管激素等胰臟外部機(jī)制來調(diào)節(jié)。

γ-氨基丁酸最初被Roberts和Frankel （1950）從哺乳類的腦組織中發(fā)現(xiàn)，之后也從心血管系統(tǒng)、胃腸管系統(tǒng)、泌尿生殖系統(tǒng)等神經(jīng)系統(tǒng)以外的臟器中被發(fā)現(xiàn)[2]，特別是γ-氨基丁酸以相當(dāng)于腦組織中觀察到的量存在于胰臟islet的β-細(xì)胞中。不僅如此，β-細(xì)胞中還發(fā)現(xiàn)有γ-氨基丁酸的合成酶L-谷氨酸脫羧酶和其代謝酶γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶。因此，γ-氨基丁酸可能在β-細(xì)胞中合成并代謝。但迄今為止γ-氨基丁酸是否由胰臟的胰島分泌還找不到直接證據(jù)。只是在β-細(xì)胞中觀察到了存在于神經(jīng)細(xì)胞的突觸樣微泡，來源于胰臟的胰島瘤細(xì)胞β-TC6細(xì)胞株[3]和體外培養(yǎng)的胰島中都分泌γ-氨基丁酸的結(jié)果來看，γ-氨基丁酸由胰臟的胰島分泌有充分的可能性。并且胰小葉內(nèi)胰管細(xì)胞和腺泡中心細(xì)胞中觀察到了γ-氨基丁酸的高親和性結(jié)合部位[4]，胰臟的腺泡細(xì)胞中檢測(cè)出了γ-氨基丁酸的免疫反應(yīng)性[5]。綜合上述研究結(jié)果，γ-氨基丁酸如果由胰島分泌，推測(cè)它將經(jīng)過胰島-腺泡細(xì)胞門脈系統(tǒng)影響外分泌部的功能的可能性極高，但迄今為止沒有任何相關(guān)的發(fā)現(xiàn)。

近期利用大鼠灌流摘出胰臟的實(shí)驗(yàn)報(bào)道外源性γ-氨基丁酸對(duì)胰臟自發(fā)或促胰液素引起的外分泌影響不大，但對(duì)對(duì)促進(jìn)酶分泌的GRP或膽囊收縮素（CCK）引發(fā)的胰臟外分泌，電場(chǎng)刺激引發(fā)的胰臟外分泌有上升作用[6]。而這些影響可被GABAA受體拮抗劑荷包牡丹鹼（bicuculline）切斷[7]。因此，本實(shí)驗(yàn)的目的在于觀察胰島？細(xì)胞分泌的內(nèi)源性GABA對(duì)胰臟外分泌的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本實(shí)驗(yàn)中使用了體重在250-300g的Sprague-Dawley系的雄性大鼠，在開始實(shí)驗(yàn)前24小時(shí)起只供應(yīng)水實(shí)施禁食。通過腹腔注射20%烏拉坦溶液麻醉實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，用量為7ml每公斤體重。在麻醉的狀態(tài)下結(jié)束實(shí)驗(yàn)或摘出胰臟后靜脈輸注過量的烏拉坦?fàn)奚鼘?shí)驗(yàn)動(dòng)物。每組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為六只。

1.2 大鼠的灌流摘取胰臟中的谷氨酸鹽對(duì)胰臟外分泌的影響

1.2.1 大鼠灌流摘出胰臟中采集胰臟液

胰臟的摘出按Park等（1993）的方法去進(jìn)行（8）。

1.2.2 谷氨酸鹽對(duì)膽囊收縮素引發(fā)的胰臟外分泌的影響

把合成膽囊收縮素-8（USA）以10pM的濃度注射引發(fā)胰臟的外分泌，開始實(shí)施膽囊收縮素前45分鐘開始把γ-氨基丁酸的前驅(qū)物質(zhì)谷氨酸鹽以1，4，10mM的濃度實(shí)施至本實(shí)驗(yàn)結(jié)束為止。

1.2.3 γ-氨基丁酸抑制劑對(duì)內(nèi)因性γ-氨基丁酸的影響

注射膽囊收縮素前45分鐘開始把GABAA受體的抑制劑荷包牡丹鹼（B-6889， Sigma）以10？滋m的濃度為實(shí)施至本實(shí)驗(yàn)結(jié)束為止。

1.2.4 谷氨酸鹽對(duì)灌流排液中γ-氨基丁酸濃度的影響

給胰臟注射膽囊收縮素以10pM的濃度引發(fā)外分泌再注入1，4，10mM的濃度的谷氨酸鹽、每15分鐘采集灌流排液測(cè)定其中γ-氨基丁酸的濃度。

1.2.5 測(cè)定γ-氨基丁酸

第一階段反應(yīng)是把從肝門脈采集的灌流液5ml試劑凍結(jié)干燥后與80？滋e GABA 鑒定試劑1混合，在37℃下反應(yīng)30分鐘。γ-氨基丁酸鑒定試劑1以0.3 M Tris-HCl buffer （pH 8.9， T-1503）， 0.6 U/ml GABAse （G-7509）， 5mm a-ketoglutarate （K-1750）， 0.01% mercaptoethanol （M-6250）， 0.5 mM NADP （N-0505）來組成。

第二階段反應(yīng)是加20？滋e、 1.5N NaOH，在60℃下反應(yīng)20分鐘來除掉剩下的NADP。再與250？滋e的酶回收液混合后在37℃下反應(yīng)一個(gè)小時(shí)，再100℃下加熱7分鐘后中斷反應(yīng)。酶回收液以 0.2 M Tris- HCl buffer （pH 8.0），5mM a-ketoglutarate，1mM glucose-6-phosphate（G-7772），25mM a㎜onium acetate （A-7330），0.1mM ADP（A-2754），0.02% BSA，3.3U/ml glutamate dehydrogenase （G-2501）來組成。

第三階段反應(yīng)是再與 250？滋e的鑒定試劑2混合后在25℃下進(jìn)行反應(yīng)30分鐘后測(cè)定在340nm下的吸光度，測(cè)定6-phos-phogluconate轉(zhuǎn)化成ribulose-phosphate過程中產(chǎn)生的NADPH。鑒定試劑2以 0.1 M Tris- HCl buffer （pH 8.0）， 1 mM NADP， 0.4 mM EDTA （E-9884）， 22 mU/ml 6-phospho-gluconate dehydrogenase （P-4553）來組成。所有試劑都從Sigma采購來使用。

1.3 胰臟液和腺泡細(xì)胞培養(yǎng)液中的a-淀粉酶活性測(cè)定法

胰液和胰臟腺泡細(xì)胞培養(yǎng)液中的α-淀粉酶活性度是按已經(jīng)發(fā)表的方法測(cè)定的[9]。

1.4 測(cè)定值的統(tǒng)計(jì)處理

本實(shí)驗(yàn)中得到的所有測(cè)定值按平均±標(biāo)準(zhǔn)偏差給出。平均差用Student's t test進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)學(xué)驗(yàn)證，顯著性水平為5%。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 灌流摘出大鼠胰臟中谷氨酸鹽對(duì)胰臟外分泌的影響

2.1.1 谷氨酸鹽對(duì)已用膽囊收縮素引發(fā)的胰臟外分泌的影響

從正常大鼠灌流摘出的胰臟在基礎(chǔ)環(huán)境下分泌出2.09±0.35 /60min的胰液和20.86 ± 6.69U/60min的淀粉酶。

把膽囊收縮素 以10pM的濃度注入，胰液和淀粉酶的分泌量各自增加了18.28±1.41 /60min、298.11± 25.59U/60min。

圖1提示把1，4及10mm濃度的谷氨酸鹽邊注射到灌流摘出的胰臟邊注射膽囊收縮素，注射膽囊收縮素的60分鐘內(nèi)胰液的分泌量隨著谷氨酸鹽的濃度增加。分別為23.24±2.34 /60min，25.94±2.90 /60min，26.34±2.72 /60min。比谷氨酸鹽的濃度為4及10mM時(shí)單獨(dú)注射膽囊收縮素得到的胰液分泌量都增加了。而且淀粉酶的分泌量為416.47 ± 34.20U/60 min，518.37± 42.77 U/60min及644.92±62.92U/60min，比單獨(dú)注射膽囊收縮素時(shí)得到的淀粉酶分泌量明顯增加。

2.1.2 γ-氨基丁酸抑制劑對(duì)內(nèi)因性γ-氨基丁酸的作用的影響

正常大鼠灌流摘出的胰臟以10pM實(shí)施膽囊收縮素的60分鐘內(nèi)，上述分泌胰臟和淀粉酶分別為18.28±1.41 /60min，298.11±25.59U/60min。注射膽囊收縮素前45分鐘開始以4㎜的濃度來注射谷氨酸鹽注射膽囊收縮素的60分鐘內(nèi)胰液的分泌量增加了25.94±2.90 /60min、淀粉酶的分泌量也增加了518.37±42.77U/60min。（P<0.05）。

圖2提示合并注射4㎜濃度的谷氨酸鹽和10？滋Mγ-氨基丁酸抑制劑注射膽囊收縮素的60分鐘內(nèi)胰液分泌量和淀粉酶的分泌量分別為17.36±1.32 /60min，283.32±25.21U/60min。這些測(cè)定值比未注射γ-氨基丁酸抑制劑時(shí)的測(cè)定值都顯低。

左：胰液分泌量；右：淀粉酶分泌量

2.1.3 谷氨酸鹽對(duì)灌流排液中γ-氨基丁酸濃度的影響

正常大鼠灌流摘出實(shí)施10pM的膽囊收縮素采集灌流排液，測(cè)定γ-氨基丁酸的分泌量，測(cè)定值為292.05±59.63nmol/60min。

圖3以1，4及10mM的濃度實(shí)施谷氨酸鹽，γ-氨基丁酸的分泌量隨著谷氨酸鹽濃度增加，分別為340.04±72.86nmol/60min，643.42±57.97nmol/60min，871.75±54.08nmol/60min。

GABA的含量的影響。

*表示和對(duì)照組相比差異顯著（P<0.05）。

3 討論

已有文章報(bào)道外源性GABA對(duì)胰臟外分泌的影響[10]?，F(xiàn)在不清楚在胰臟腺體細(xì)胞中GABA通過什么途徑去改變其功能而影響胰臟外分泌，但在利用a-T3-1 gonadotropes的實(shí)驗(yàn)中提出GABA和其受體結(jié)合后引起GABA-gated Cl- 通道的興奮導(dǎo)致voltage-operated Ca2+通道（VOCCs）開放，大幅度增加Ca2+的內(nèi)流[11]。所以，在胰臟腺體細(xì)胞中GABA也有可能通過相同的機(jī)制引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的增加而影響胰臟的外分泌功能。從這種GABA的效果可被GABAA受體拮抗劑荷包牡丹鹼阻斷的現(xiàn)象分析，GABA肯定通過GABAA受體發(fā)揮其作用。

本實(shí)驗(yàn)中谷氨酸鹽對(duì)胰臟外分泌的影響可看做是在胰島？茁細(xì)胞中誘發(fā)了內(nèi)源性GABA的合成分泌而上升了CCK喚起的胰臟外分泌。因此，在灌流摘除胰臟的門靜脈端流出液中測(cè)定了GABA的含量，結(jié)果觀察到谷氨酸鹽濃度依賴地增加了GABA的分泌量。此結(jié)果強(qiáng)力地說明谷氨酸鹽能夠誘發(fā)胰島？茁細(xì)胞中GABA的合成和分泌。實(shí)驗(yàn)中還用了GABAA受體拮抗劑荷包牡丹鹼[7]阻斷內(nèi)源性GABA對(duì)已被CCK喚起的胰臟外分泌，可以斷定GABA的作用是通過GABAA受體發(fā)揮其作用。可是，GABA受體的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制還沒有完全解讀出來，這需要往后的研究繼續(xù)探索。

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通訊作者：崔正云。