人類胚胎期和成年期巨核細胞的分子特征比較

李敏敏， 夏美娟， 趙晶晶， 陳肖源， 劉翠翠， 蘇培， 王洪濤， 周家喜

中國醫(yī)學科學院血液病醫(yī)院（中國醫(yī)學科學院血液學研究所），北京協(xié)和醫(yī)學院，實驗血液學國家重點實驗室；國家血液系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學研究中心；細胞生態(tài)海河實驗室，天津 300020

巨核細胞是一類體積大、數(shù)量少的造血細胞，其經(jīng)典功能是產(chǎn)生血小板，參與機體的止凝血過程［1-2］。與紅細胞和巨噬細胞一樣，巨核細胞存在于哺乳動物多個發(fā)育位點，包括胚胎期的卵黃囊（yolk sac，YS）和胎肝（fetal liver，F(xiàn)L）以及成年期的骨髓（bone marrow，BM）等［3-4］。與成年期相比，胚胎期的巨核細胞呈現(xiàn)出體積小、多倍體化程度低等特點［5］。研究發(fā)現(xiàn)，人卵黃囊和胎肝巨核細胞以2倍體和4倍體為主，而成年骨髓巨核細胞則以16倍體為主，提示骨髓巨核細胞血小板生成能力更高［5-6］。然而，由于人類樣本的稀缺性及研究手段的缺乏，目前對于不同發(fā)育時期原代巨核細胞產(chǎn)板能力的差異尚不明確。

體外巨核細胞分化體系為評估不同來源巨核細胞的差異提供了很好的研究模型。Bluteau等［7］利用人胚胎期干細胞、胎肝、臍帶血和成年期骨髓來源的CD34+造血干祖細胞體外誘導分化產(chǎn)生巨核細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與其他來源的巨核細胞相比，骨髓造血干祖細胞分化產(chǎn)生的巨核細胞產(chǎn)板能力更高；同時對體外不同來源的巨核細胞進行轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，不同來源的巨核細胞在轉(zhuǎn)錄組分子特征方面存在顯著差異。然而，目前對于人類發(fā)育不同階段原代巨核細胞分子特征的差異仍未明確。

近期，有研究者突破了原代巨核細胞分離的技術(shù)瓶頸，利用單細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)分別解析了人類胚胎期卵黃囊、胎肝和成年期骨髓巨核細胞的分子特征［5-6］。本研究在此基礎(chǔ)上對不同發(fā)育時期巨核細胞之間的相似性和差異性進行對比分析，并探究了轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的差異，以期為深入了解巨核細胞的發(fā)育特征提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

Wang等［5］對人胚胎期（孕4～9周）YS和FL的巨核細胞進行了Smart-seq2單細胞轉(zhuǎn)錄組測序，數(shù)據(jù)發(fā)表于 GEO（gene expression omnibus）數(shù)據(jù)庫，檢索號為GSE144024；Liu等［6］對人成年期BM巨核細胞進行了Smart-seq2單細胞轉(zhuǎn)錄組測序，數(shù)據(jù)發(fā)表于NODE（national omics data encyclopedia）數(shù)據(jù)庫，檢索號為OEP001150。本研究基于以上數(shù)據(jù)（表1）展開進一步分析。

表1 數(shù)據(jù)來源信息Table 1 Data source information

1.2 相關(guān)性分析

利用Scanpy包的Scanpy.tl.paga函數(shù)計算不同來源巨核細胞的相似性，并用Scanpy.pl.paga函數(shù)進行了可視化。

1.3 差異基因（differential expression gene，DEG）鑒定及可視化

利用 Seurat包（3.1.5）［8］的 FindAllMarkers函數(shù)計算不同組織來源的巨核細胞差異表達基因，參數(shù)設(shè)置為“only.pos=TRUE，min.pct=0.25，logfc.threshold=0.25”。矯正后以P≤0.01為差異表達基因。利用Seurat包的DoHeatmap功能對差異表達基因進行可視化。

1.4 GO（gene ontology）富集分析

利用R包clusterProfiler［9］（3.16.0）各組織來源的巨核細胞差異表達基因進行GO富集分析，對具有代表性的GO條目進行展示。

1.5 基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）

利 用 GSEA［10］（http：//software.broadinstitute.org/gsea/index.jsp）軟件對不同組織來源的巨核細胞進行基因集富集分析和可視化，并以從GSEA下載的小鼠GSEA基因集（msigdb.v7.4.symbols.gmt）作為基因集數(shù)據(jù)庫。

1.6 基因集評分分析

利用Seurat包中的AddModuleScore函數(shù)對單個細胞的基因集所有基因的表達進行評分，這些基因集代表了不同的生物學功能。用Wilcox檢驗對不同組織來源的巨核細胞差異進行顯著性檢驗。

1.7 基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析

單細胞基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)推斷與聚類（single-cell regulatory network inference and clustering，SCE-NIC）是一個可以計算轉(zhuǎn)錄因子及其潛在靶基因共表達和模體分析，并進行基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)重建以及細胞狀態(tài)鑒定的方法［11］。利用pySCENIC包（0.9.11）對不同組織來源的巨核細胞轉(zhuǎn)錄子（轉(zhuǎn)錄因子和靶基因）及其活性進行計算，用Pheatmap進行可視化。利用Cytoscape軟件對不同組織來源的巨核細胞活性排名前20的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進行可視化。

2 結(jié)果與分析

2.1 人胚胎期和成年期巨核細胞轉(zhuǎn)錄組水平相似性分析

為研究胚胎期和成年期巨核細胞在轉(zhuǎn)錄組水平的差異，對人胚胎期YS和FL以及成年期BM的巨核細胞單細胞轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)進行了分析［5-6］，如圖1所示，共計1 358個細胞，包括胚胎期和成年期兩個發(fā)育時期；為從整體層面了解3個不同組織來源的巨核細胞轉(zhuǎn)錄組相似性，進行了基于分區(qū)的圖抽象（partition-based graph abstraction，PAGA）相關(guān)性分析。結(jié)果顯示，胚胎期YS和FL來源的巨核細胞間的轉(zhuǎn)錄組相似性較高，但與成年期BM來源巨核細胞的差異均較大，YS與FL來源的巨核細胞轉(zhuǎn)錄組水平更相似。以上結(jié)果提示，人胚胎期和成年期的巨核細胞轉(zhuǎn)錄組水平具有明顯差異。

圖1 人YS、FL和BM來源的巨核細胞轉(zhuǎn)錄組水平PAGA圖Fig.1 Transcriptome-level PAGA picture of human YS,FL,and BM-derived megakaryocytes

2.2 人胚胎期和成年期巨核細胞分子特征的差異分析

為進一步研究人胚胎期和成年期巨核細胞分子特征的差異，對YS、FL和BM來源的巨核細胞進行了DEG分析?；虮磉_熱圖顯示，YS來源的巨核細胞顯著高表達1 269個基因，F(xiàn)L來源的巨核細胞顯著高表達1 599個基因，而BM來源的巨核細胞顯著高表達715個基因（圖2A）。結(jié)果表明，YS和FL來源的巨核細胞的差異基因表達水平更相近。為明確差異表達基因的生物學意義，對YS、FL和BM來源的巨核細胞差異表達的基因進行了GO富集分析，發(fā)現(xiàn)YS來源的巨核細胞富集了有絲分裂細胞周期和細胞低氧應答的生物過程，F(xiàn)L來源的巨核細胞富集了細胞周期和蛋白定位的生物過程，而BM來源的巨核細胞富集了止凝血相關(guān)的生物過程（圖2B）。與成年期相比，胚胎期兩個組織的巨核細胞均富集了DNA復制的生物過程，而成年期巨核細胞相比胚胎期的兩個組織富集了血小板聚集的生物過程（圖2C～D）。胚胎期（YS和FL）巨核細胞高表達編碼增殖標記分子結(jié)合核仁磷蛋白（MKI67）、增殖細胞核抗原（PCNA）和微染色體支持蛋白5（MCM5）等細胞周期相關(guān)蛋白［12］，而成年期（BM）巨核細胞高表達肌球蛋白重鏈9（MYH9）、微管蛋白β1Ⅵ類（TUBB1）以及人血管性血友病因子（VWF）等血小板生成相關(guān)基因［13］（圖2E）。胚胎期（YS和FL）的巨核細胞細胞周期評分高于成年期（BM），而成年期巨核細胞的血小板生成評分高于胚胎期（圖2F）。以上結(jié)果說明胚胎期巨核細胞的增殖特征較強，而成年期巨核細胞血小板生成特征較強。

圖2 人胚胎期和成年期巨核細胞分子特征的差異分析Fig.2 Differential analysis of molecular characteristics of human embryonic and adult megakaryocytes

2.3 人胚胎期和成年期巨核細胞表達的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子分析

轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控是基因表達調(diào)控的重要環(huán)節(jié)，并且與多種疾病和表型相關(guān)，轉(zhuǎn)錄因子是調(diào)控巨核細胞功能的重要組成部分。為在轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控層面了解胚胎期和成年期巨核細胞的差異，本研究運用SCENIC包進行了轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析。結(jié)果顯示YS來源的巨核細胞和細胞增殖（ELF3）［14］相關(guān)的轉(zhuǎn)錄子活性較高，F(xiàn)L來源的巨核細胞的細胞增殖相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子（E2F1、SOX4）［15］活性較高，而BM來源的巨核細胞分化成熟（NFIB、FLI1、MAX、TAL1）［16］相關(guān)的轉(zhuǎn)錄子活性較高（圖3A～B）?；虮磉_也證實了以上結(jié)論，即胚胎期巨核細胞相對高表達細胞增殖相關(guān)的SOX4轉(zhuǎn)錄因子，而BM來源的巨核細胞相對高表達巨核細胞分化成熟相關(guān)的MAX轉(zhuǎn)錄因子（圖3C）。上述結(jié)果進一步表明，胚胎期和成年期巨核細胞分別具有與細胞周期和血小板產(chǎn)生相關(guān)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。

圖3 人胚胎期和成年期巨核細胞的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Fig.3 The bey transcription factors of megakaryocytes in human embryonic stage and adult stage

2.4 人胚胎期和成年期巨核細胞免疫亞群特征分析

本研究提取了人胚胎期smart-seq2測序獲得的巨核細胞免疫亞群（MK6亞群）［5］和成年期的巨核細胞免疫亞群（hBM-MK5）進行差異分析［6］。差異基因分析結(jié)果表明，胚胎期的巨核細胞免疫亞群高表達MAF、MRC1等巨噬細胞標志基因，而成年期巨核細胞免疫亞群高表達S100A8、LCN2等中性粒細胞標志基因（圖4），提示不同時期巨核細胞免疫亞群的免疫特性可能存在差異。

圖4 人胚胎期和成年期巨核細胞免疫亞群特征Fig.4 The characteristics of immune subsets megakaryocyte in human embryo stage and adult stage

3 討論

體外分化研究表明，與人胎肝來源的巨核細胞相比，骨髓來源的巨核細胞具有更高的產(chǎn)板能力［7，17］。受限于樣本的稀缺性、巨核細胞的稀少性及技術(shù)的局限性，目前對于不同發(fā)育時期原代巨核細胞產(chǎn)板能力差異的分子機制尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，與胚胎期巨核細胞相比，成年期巨核細胞高表達MYH9、TUBB1及VWF等血小板產(chǎn)生相關(guān)基因，且富集NFIB、FLI1、MAX、TAL1等調(diào)控巨核細胞成熟和血小板生成的轉(zhuǎn)錄因子，表明成年期巨核細胞具有更高的產(chǎn)板潛能。大量研究表明，成年期的原代巨核細胞比胚胎期多倍體特性更高，且巨核細胞的多倍體程度與產(chǎn)板能力呈正相關(guān)關(guān)系［5-6，18］。同時與成年期巨核細胞相比，胚胎期巨核細胞高表達MKI67、PCNA、MCM5等細胞周期相關(guān)的基因，且富集E2F1、SOX4等調(diào)控細胞增殖的轉(zhuǎn)錄因子，表明胚胎期巨核細胞具有更高的增殖能力。結(jié)果提示與成年期穩(wěn)態(tài)造血情況下巨核細胞主要由造血干祖細胞分化產(chǎn)生不同，胚胎期巨核細胞可能主要來源于自我擴增，從而滿足個體發(fā)育對其數(shù)量的需求。

Pariser等［19］研究認為，肺臟中的巨核細胞體積小于骨髓巨核細胞，多倍體化程度低于骨髓巨核細胞，提示肺臟巨核細胞的血小板生產(chǎn)能力可能低于骨髓巨核細胞；同時該研究還發(fā)現(xiàn)，肺臟中的巨核細胞具有與DC細胞相似的基因表達譜，高表達MHCⅡ類分子和CD11c等基因。本研究發(fā)現(xiàn)卵黃囊和胎肝的巨核細胞免疫亞群高表達MAF、MRC1等巨噬細胞標志基因，而骨髓巨核細胞免疫亞群相對高表達S100A8、LCN2等中性粒細胞標志基因。結(jié)果提示巨核細胞的產(chǎn)板特性和免疫特征可能均受到微環(huán)境的調(diào)控。

體外再生血小板作為解決臨床血小板短缺的有效手段。人多能干細胞由于具有自我更新能力和多向分化潛能，是血小板再生的重要種子細胞［20］。人多能干細胞生成血小板主要經(jīng)歷造血干祖細胞、高增殖特性的巨核祖細胞、高產(chǎn)板特性的成熟巨核細胞幾個階段，鑒定調(diào)控每個階段細胞產(chǎn)生的核心調(diào)控因子對于建立體外高效生成血小板的體系至關(guān)重要［21］。通過鑒定系列調(diào)控巨核細胞增殖特性和產(chǎn)板特性潛在的轉(zhuǎn)錄因子，并對這些轉(zhuǎn)錄因子進一步研究與驗證，有望顯著提高巨核祖細胞和成熟巨核細胞的產(chǎn)生效率，為建立體外高效生成血小板體系奠定理論基礎(chǔ)。