一起山羊地方性鼻內(nèi)腫瘤的診斷

王 景，周 曼，何亞鵬，付明哲，許信剛

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

一起山羊地方性鼻內(nèi)腫瘤的診斷

王 景△，周 曼△，何亞鵬，付明哲*，許信剛*

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

陜西省某山羊養(yǎng)殖場發(fā)生一起山羊鼻內(nèi)腫瘤病，通過流行病學(xué)和臨床癥狀調(diào)查、病理剖檢、病理切片檢查進(jìn)行初步診斷。其次根據(jù)GenBank收錄的山羊地方性鼻內(nèi)腫瘤病毒基因組序列設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物，通過PCR方法從腫瘤組織中擴(kuò)增獲得目的片段并測序。序列比對(duì)分析表明，該目的基因和山羊地方性鼻內(nèi)腫瘤病毒高度相似，最終確定該病為山羊地方性鼻內(nèi)腫瘤病毒引起的山羊地方性鼻內(nèi)腫瘤(ENT)。

山羊；地方性鼻內(nèi)腫瘤病毒；病理變化；序列分析

山羊地方性鼻內(nèi)腫瘤(Enzootic nasal tumor，ENT)是由山羊地方性鼻內(nèi)腫瘤病毒(Enzootic nasal tumor virus of goat，ENTV-2)引起的一種慢性、進(jìn)行性、接觸傳染性的腫瘤性疾病[1]，被感染山羊主要表現(xiàn)食欲不振、極度消瘦、呼吸困難、運(yùn)動(dòng)減少、運(yùn)動(dòng)時(shí)有大量鼻液流出，最終衰竭而死，病死率高達(dá)100%，給養(yǎng)羊業(yè)造成了較大的經(jīng)濟(jì)損失[2-3]。ENTV感染山羊鼻內(nèi)黏膜上皮細(xì)胞，引起異常增生，最終形成腫瘤[4-5]。國外學(xué)者在腫瘤發(fā)生機(jī)制方面進(jìn)行了深入研究[6-8]。2015年陜西省某山羊飼養(yǎng)場發(fā)現(xiàn)了多起疑似山羊地方性鼻內(nèi)腫瘤病例，通過臨床剖檢觀察、病理切片檢測及ENTV前病毒基因的PCR檢測和序列分析，最終確診為山羊地方性鼻內(nèi)腫瘤病毒引起的山羊地方性鼻內(nèi)腫瘤，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 山羊鼻內(nèi)腫瘤組織材料取自陜西省某山羊養(yǎng)殖場自然感染病例的鼻腔腫瘤組織。

1.1.2 主要試劑 2×EsTaqMasterMix、Super DNA Marker，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司產(chǎn)品；血液/組織/細(xì)胞基因組提取試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 流行情況及剖檢病變 向飼養(yǎng)管理人員了解該病的發(fā)生情況，并仔細(xì)觀察病羊的臨床癥狀。病羊動(dòng)脈放血致死，進(jìn)行系統(tǒng)剖檢觀察，特別是鼻腔及相鄰區(qū)域的檢查，記錄眼觀病變。

1.2.2 病理學(xué)檢查 取自然發(fā)病山羊的鼻內(nèi)增生物、肺臟、肝臟、脾臟、腎臟、心臟等組織樣品(厚約2 mm～3 mm)置于100 mL/L中性福爾馬林液固定24 h～48 h后按照常規(guī)方法制作病理切片。

1.2.3 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)NCBI上公布的ENTV的全基因序列(AY197548.2和NC-004994.2)，參照文獻(xiàn)[3,9-10]，應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物，用于擴(kuò)增ENTV前病毒基因。上游引物為P1：5′-GTTTTCCTCGCCACTACTCTTG-3′，下游引物P2：5′-TACCCAATAAGCGTCGGATGAT-3′，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為2 249 bp，引物由Invitrogen公司合成。

1.2.4 PCR擴(kuò)增及序列分析 按照血液、組織、細(xì)胞基因組提取試劑盒的方法提取病羊鼻內(nèi)腫瘤組織中ENTV前病毒的DNA，作為模板進(jìn)行PCR，另外取2只健康羊鼻內(nèi)容物作為陰性對(duì)照。50 μL PCR反應(yīng)體系：2×EsTaqMasterMix 25 μL，上、下游引物P1和P2各1 μL，模板3 μL，去離子水20 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 3 min；94℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 90 s，35個(gè)循環(huán)；最后72℃ 8 min。電泳檢測有無目的條帶，將出現(xiàn)目的條帶的PCR產(chǎn)物純化，送北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司測序，將測序結(jié)果應(yīng)用NCBI中的Blast工具進(jìn)行序列相似性比對(duì)分析。

2 結(jié)果

2.1 流行特點(diǎn)及臨床癥狀

陜西省某山羊養(yǎng)殖基地的舍飼羊群中發(fā)現(xiàn)鼻內(nèi)腫瘤的病羊，最初僅個(gè)別山羊發(fā)病(發(fā)病率不超過5%)，隨后發(fā)現(xiàn)發(fā)病山羊的數(shù)量有增加的趨勢，初期病羊從鼻內(nèi)流出稀薄的漿液性鼻液，以后逐漸變成濃稠的鼻液(圖1)。隨后病羊逐漸出現(xiàn)呼吸困難，不斷甩頭，并不時(shí)發(fā)出鼻噻音。部分患病嚴(yán)重的山羊眼球外突，有的甚至發(fā)生穿孔，從孔中流出大量分泌物。晚期病羊呼吸困難，食欲廢絕，全身消瘦衰竭，最后窒息而死。病羊體溫變化不明顯，病程長達(dá)半年以上。病羊后期多表現(xiàn)出全身性衰竭，窒息而死。

圖1 感染ENTV患羊流出黏稠膿性鼻液

2.2 剖檢病變

病羊鼻腔內(nèi)充滿濃稠分泌物，單側(cè)鼻道內(nèi)有淡黃色或者淡粉紅色的增生物，似菜花狀，質(zhì)地軟，易碎(圖2)。羊肺部正常，其他部位均無病變。

A.病羊左側(cè)鼻腔內(nèi)單側(cè)性腫瘤，幾乎占據(jù)整個(gè)鼻腔(正中矢狀面)；B.取出的腫瘤組織；C.腫瘤組織大小A.The unilateral tumor in the left side of nasal cavity of goat,occupying almost the whole of the nasal cavity(median sagittal plane);B.Tumor tissue from the nasal cavity; C.The size of tumor tissue

2.3 病理切片觀察

取鼻腔增生物制作病理切片，顯微鏡下可觀察到增生物具有腺瘤的特點(diǎn)，其表面為一層柱狀上皮細(xì)胞構(gòu)成的假膜，基質(zhì)為疏松的結(jié)締組織，其間分布有大量血管。瘤細(xì)胞形態(tài)基本一致，排列成不規(guī)則的腺泡結(jié)構(gòu)，內(nèi)有較多分泌物(圖3A)。乳頭狀生長的腫瘤細(xì)胞呈柱狀，細(xì)胞核位于基部，間質(zhì)內(nèi)巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤(圖3B)；深層腫瘤呈腺管(泡)狀生長，黏液腺腫瘤范圍廣泛，腺管內(nèi)分泌物較多，小血管內(nèi)可見嗜中性粒細(xì)胞(箭頭所示)，腺泡基膜間有巨噬細(xì)胞浸潤(圖3C)。其他組織未見明顯病理損傷。

2.4 PCR擴(kuò)增與序列分析

以提取的鼻腔瘤組織細(xì)胞基因組DNA(含有整合進(jìn)去的前病毒DNA)為模板，PCR擴(kuò)增得到2 249 bp的片段，而正常羊樣品沒有目的條帶出現(xiàn)，與預(yù)期一致(圖4)，將序列上傳至NCBI，登錄號(hào)為KU179192.1。與NCBI已報(bào)道3株ENTV-2核苷酸序列比較發(fā)現(xiàn)，與ENTV-SC株HM104174.1同源性為99%，與國外2株AY197548.2和NC-004994.2同源性均為90%，片段中包含的gag基因與其他3株ENTV-2(HM104174.1，AY197548.2，NC-004994.2)同源性在92.5%以上，因而從核酸水平證實(shí)了這起山羊地方性鼻內(nèi)腺瘤是由ENTV引起的。

A.表層腫瘤呈乳頭狀生長(40×)；B.乳頭狀生長的腫瘤細(xì)胞(100×)；C.深層腫瘤呈腺管(泡)狀生長(400×)A.The surface of tumor growth like papillary tumor(40×); B.Papillary tumor cells(100×); C.The deep of tumor growth like glandular tube (acinus)(400×)

M. DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1.ENA患羊PCR結(jié)果；2～3.陰性對(duì)照
M.DNA Marker DL 2 000 ;1.PCR result of goat with ENA; 2-3.Negative control

圖4 PCR結(jié)果
Fig.4 Result of PCR

3 討論

山羊地方性鼻內(nèi)腫瘤的病例在國內(nèi)報(bào)道的不多，1984年劉鳳翔、林曦等[11-12]對(duì)內(nèi)蒙古地區(qū)的ENT的發(fā)病山羊的臨床癥狀和病理學(xué)進(jìn)行了詳細(xì)的研究。2006在湖南某羊場山羊鼻內(nèi)腫瘤的發(fā)生呈地方流行性[13]。2011年四川某山羊養(yǎng)殖基地發(fā)生該病，確診為山羊地方性鼻內(nèi)腫瘤(ENT)，并首次報(bào)道了ENT的病原[14]。2013年1月至7月四川省攀枝花市某羊場山羊發(fā)生鼻內(nèi)腫瘤[15]。ENT具有明顯的接觸傳染性，病程長，且發(fā)病者多數(shù)為成年羊。臨床表現(xiàn)為食欲減退，極度消瘦，呼吸困難，鼻漏，出現(xiàn)鼻內(nèi)單側(cè)或雙側(cè)性增生物。本試驗(yàn)調(diào)查了陜西省發(fā)生ENT患羊的癥狀，剖檢患羊，觀察組織病變，對(duì)腫瘤進(jìn)行切片，HE染色觀察，初步認(rèn)定為山羊地方性鼻內(nèi)腫瘤，并進(jìn)行ENTV前病毒基因的PCR檢測和序列分析，最終確定該病原為山羊地方性鼻內(nèi)腫瘤病毒。本病例是陜西省首次報(bào)道的山羊地方性鼻內(nèi)腫瘤病例。山羊地方性鼻內(nèi)腫瘤病由于病程長，容易和其他常見的羊呼吸道疾病混淆，極易在羊群中長期存在，造成大批感染。鑒于我國養(yǎng)羊規(guī)模巨大，應(yīng)制定計(jì)劃防治該病，特別是在引種時(shí)要加強(qiáng)檢疫工作，因而應(yīng)盡快建立多種特異性的臨床檢測診斷方法，采取積極的凈化措施，防止該病在我國造成更嚴(yán)重的危害。

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Diagnosis of Enzootic Nasal Tumor in Goats

WANG Jing,ZHOU Man,HE Ya-peng,FU Ming-zhe,XU Xin-gang

(CollegeofVeterinaryMedicine,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi，712100,China)

A comprehensive analysis about epidemiology,clinical symptoms,pathological lesions was made in a goat farm in Shaanxi in order to diagnose the goat with tumors.Then a pair of primers were designed and synthesized according to the enzootic nasal tumor virus of goat(ENTV-2)genome sequence in GenBank.The target fragment was directly amplified by PCR technique and sequenced,which indicated that it was highly related to the ENTV-2.In conclusion,researchers found that the disease was enzootic nasal tumor which was elicited by enzootic nasal tumor virus.

goat; Enzootic nasal tumor virus; pathological lesion; sequence analysis

2016-06-16

西北農(nóng)林科技大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201610712019)；陜西省重點(diǎn)產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新鏈項(xiàng)目(2016KTZDNY02-06)；陜西省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新與攻關(guān)項(xiàng)目(2016NY-092)；陜西省重大農(nóng)技推廣服務(wù)試點(diǎn)項(xiàng)目(2016畜牧-羊-20)

王 景(1995-)，女，甘肅蘭州人，本科，主要從事獸醫(yī)學(xué)研究?！魍蓉暙I(xiàn)作者 *通訊作者

S855.3

B

1007-5038(2017)02-0129-04