鯽腹水癥病原菌分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

李戰(zhàn)福，宋亞嬌，呂愛(ài)軍,*，張 超，裴 超，李 莉，胡秀彩，孫敬鋒

(1.河南師范大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453007；2.天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300384)

鯽腹水癥病原菌分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

李戰(zhàn)福1，宋亞嬌1，呂愛(ài)軍1,2*，張 超1，裴 超1，李 莉1，胡秀彩2，孫敬鋒2

(1.河南師范大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453007；2.天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300384)

從河南新鄉(xiāng)某養(yǎng)殖場(chǎng)患腹水癥的鯽魚體內(nèi)分離純化獲得1株細(xì)菌，編號(hào)為CA1618，通過(guò)細(xì)菌形態(tài)學(xué)觀察、Biolog微生物鑒定系統(tǒng)，進(jìn)一步采用PCR方法擴(kuò)增其16 S rDNA序列分析。結(jié)果表明CA1618菌株為革蘭陰性桿菌，利用葡萄糖、麥芽糖、半乳糖、海藻糖等多種碳源，與Aeromonassobria特征同源性為0.575、遺傳距離為6.226；測(cè)序獲得16 S rDNA序列片段為1 363 bp，與Aeromonassobria序列同源性為99%～100%，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)表明與模式菌株AeromonassobriaATCC43979T(GenBank登錄號(hào):X74683)親緣關(guān)系最近，最終鑒定為溫和氣單胞菌(Aeromonassobria)。CA1618菌株人工感染鯽魚半數(shù)致死量(LD50)為1.55×107CFU/mL，藥敏試驗(yàn)顯示對(duì)頭孢哌酮、頭孢噻肟、頭孢克肟、萘啶酸、諾氟沙星、復(fù)方新諾明、四環(huán)素、氯霉素等抗生素敏感。

鯽魚；溫和氣單胞菌；分離鑒定；腹水癥；藥敏試驗(yàn)

溫和氣單胞菌(Aeromonassobria)是魚類常見(jiàn)的條件致病菌，可引起鯉(Cyprinuscarpio)、鯽(Carassiuscarassius)、羅非魚(Tilapianilotica)、蟹(Eriocheirsinensis)、鱉(Trionyxsinensis)等多種水產(chǎn)動(dòng)物感染發(fā)病[1-4]，往往給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。近年來(lái)研究表明，溫和氣單胞菌可導(dǎo)致腐皮病、肝水腫、出血性敗血癥等[5]。Majtan J等[6]報(bào)道淡紅墨頭魚(Garrarufa)出現(xiàn)大量死亡是由致病性溫和氣單胞菌引起。最近，Dar C M等[7]報(bào)道溫和氣單胞菌感染鰱(Hypophthalmichthysmolitrix)表現(xiàn)體表針狀出血點(diǎn)，鰓出血、增生病變等癥狀。此外，溫和氣單胞菌也是一種“人-魚-獸”共患病病原，可引起人類腹膜炎、菌血癥和腸胃炎等疾病[8]。

鯽魚(Carassiuscarassius)是我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖重要淡水魚類之一。鯽魚細(xì)菌性疾病頻繁發(fā)生，這對(duì)人類健康構(gòu)成了潛在威脅。鯽魚“腹水癥”是以腹水形成為主要臨床特征[1,9]。近幾年，國(guó)內(nèi)學(xué)者報(bào)道溫和氣單胞菌感染引起異育銀鯽“腹水癥”主要表現(xiàn)為眼球突出，體表出血，腹部腫脹伴有腹水等臨床癥狀。關(guān)于鯽魚腹水癥病原菌的分離鑒定研究，目前鮮有文獻(xiàn)報(bào)道[9]。本研究從河南新鄉(xiāng)某養(yǎng)殖場(chǎng)患腹水癥的鯽魚體內(nèi)分離純化獲得1株細(xì)菌，暫時(shí)編號(hào)為CA1618，并通過(guò)細(xì)菌形態(tài)學(xué)觀察、Biolog微生物鑒定系統(tǒng)結(jié)合16 S rDNA分子鑒定及藥敏試驗(yàn)等系統(tǒng)研究，旨在為魚類細(xì)菌性疾病防治提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)用魚 患病鯽魚來(lái)自河南省新鄉(xiāng)市某水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)，病魚臨床表現(xiàn)為游泳失常，腹部體表及鰭基部充血，腹部腫脹且伴有大量腹水，尾鰭邊緣發(fā)白。健康鯽魚購(gòu)自河南師范大學(xué)水產(chǎn)養(yǎng)殖基地。

1.1.2 主要試劑 細(xì)菌鑒定GenⅢ 96孔板,Biolog公司產(chǎn)品；LB固體培養(yǎng)基、細(xì)菌DNA提取試劑盒、CR Master Mix、DNA膠回收試劑盒等，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品；藥敏紙片，杭州濱和微生物試劑有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌的分離與純化 無(wú)菌操作取患病鯽魚肝臟等組織涂布接種于LB平板，28℃恒溫培養(yǎng)24 h挑取典型單菌落劃線接種，經(jīng)2次～3次傳代得到純菌種接種試管斜面，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 Biolog生理生化特性分析 利用美國(guó)Biolog公司GenⅢ Microstation自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)，主要包括71種碳源、23種化學(xué)敏感物質(zhì)及陽(yáng)性、陰性對(duì)照孔，用8道移液槍向96孔板加入100 μL適量菌液，28℃孵育24 h后，通過(guò)細(xì)菌特征指紋圖譜與Biolog GenⅢ數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行菌種匹配，顯示鑒定結(jié)果。

1.2.3 細(xì)菌16 S rDNA基因PCR擴(kuò)增及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建 細(xì)菌基因組DNA提取參照文獻(xiàn)[10]方法進(jìn)行。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系20 μL，其中通用引物F：5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′，R:5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′各1 μL，DNA模板2 μL，PCR Master Mix(Mg2+、Tag酶、dNTP、6×buffer)10 μL；ddH2O 6 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃ 5 min；94℃ 1 min、55℃ 1 min、72℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min, 4℃ 保存。。PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色觀察。將上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行16 S rDNA序列測(cè)定，通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)Blast檢索進(jìn)行序列相似性分析，采用MEGA6.0軟件鄰接法(neighbor-joining)，Bootstrap設(shè)置驗(yàn)證次數(shù)為1 000次，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析。1.2.4 人工感染與藥敏試驗(yàn) 按常規(guī)方法進(jìn)行，隨機(jī)選取健康鯽魚60尾，在實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)1周確認(rèn)無(wú)病后用于感染試驗(yàn)。通過(guò)平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定菌懸液濃度為4.8×108CFU/mL，依次倍比稀釋5個(gè)濃度梯度，設(shè)置感染魚5組、每組10尾魚，進(jìn)行腹腔注射0.4 mL/尾，對(duì)照組10尾魚注射等量無(wú)菌液體培養(yǎng)基，連續(xù)觀察14 d，統(tǒng)計(jì)鯽魚發(fā)病死亡情況，采用Bliss法計(jì)算半數(shù)致死量(LD50)。采用K-B紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，用毫米尺量取抑菌圈直徑，根據(jù)藥敏紙片說(shuō)明書，判定24種抗生素藥物敏感性。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌形態(tài)學(xué)觀察

從患腹水病鯽魚肝臟中分離純化獲得1株細(xì)菌，編號(hào)為CA1618，該菌在LB平板生長(zhǎng)良好，主要為圓形、表面濕潤(rùn)、透明、隆起、邊緣整齊菌落，大小為1.0 mm～1.3 mm，革蘭陰性短桿菌、兩端鈍圓(圖1)。

圖1 CA1618菌株革蘭染色(1 000×)

2.2 細(xì)菌的生理生化特性

利用Biolog GenⅢ自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)，鑒定結(jié)果與Aeromonassobria特征相似性(SIM)為0.575、遺傳距離(DIST)為6.226，初步判定該菌屬于溫和氣單胞菌(Aeromonassobria)。該分離菌株CA1618能夠利用葡萄糖、麥芽糖、D-半乳糖、海藻糖、纖維二糖、蔗糖、棉籽糖、甘露糖、果糖及鼠李糖等20種碳源(表1)。

表1 CA1618菌株的生理生化特性

續(xù)表1

項(xiàng)目Item菌株CA1618StrainCA1618項(xiàng)目Item菌株CA1618StrainCA1618項(xiàng)目Item菌株CA1618StrainCA1618α?D?乳糖α?D?gentiobiose-L?絲氨酸L?serine+10g/LNaCl10g/Lsodiumchloride+蜜二糖D?melibiose-果膠Pectin+40g/LNaCl40g/Lsodiumchloride-β?甲酰?D?葡糖苷β?methyl?D?glucoside+D?半乳糖醛酸D?galacturonic+80g/LNaCl80g/Lsodiumchloride-D?水楊苷D?salicin+L?半乳糖醛酸內(nèi)酯L?galactonicacidlactone+乳酸鈉Sodiumlactate+N?乙酰?D?半乳糖胺N?acetyl?D?glucosamine-D?葡糖酸D?gluconicacid+梭鏈孢酸Fusidicacid-N?乙酰神經(jīng)氨酸N?acetylneuraminicacid+D?葡糖醛酸D?glucuronic+D?絲氨酸D?serine+α?D?葡糖α?D?glucose+葡糖醛酰胺Glucuronamide-醋竹桃霉素Troleandomycin+D?甘露糖D?mannose+黏液酸Mucicacid+利福霉素SVRifamycinSV+D?果糖D?fructose+奎寧酸Quinicacid+二甲胺四環(huán)素Minocycline-D?半乳糖D?galactose+糖質(zhì)酸D?saccharicacid+林肯霉素Lincomycin-3?甲酰葡糖3?methylglucose-P?羥基?苯乙酸p?hydroxy?phenylacetic-鹽酸胍Guanidinechloride+L?果糖L?fructose+丙酮酸甲酯Methylpyruvate+硫酸四葵鈉Niaproof4+L?鼠李糖L?rhamnose+D?乳酸甲酯D?lacticacidmethylester+萬(wàn)古霉素Vancomycin+肌苷Inosine+L?乳酸L?lacticacid+四唑素Tetrazoliumviolet+D?山梨醇D?sorbitol+檸檬酸Citricacid+四唑藍(lán)Tetrazoliumblue+D?甘露醇D?mannito+α?酮戊二酸α?keto?glutaricacid+萘啶酮酸Nalidixicacid-D?阿拉伯醇D?arabitol+D?蘋果酸D?malicacid-氯化鋰Lithiumchloride-肌醇myo?inositol-L?蘋果酸L?malicacid+亞碲酸鉀Potassiumtellurite-甘油Glycerol+溴?丁二酸Bromo?succinic+氨曲南Aztreonam-D?葡糖?6?磷酸D?glucose?6?PO4+吐溫40Tween40+丁酸鈉Sodiumphenylbutyrate-D?果糖?6?磷酸D?fructose?6?PO4+γ?氨基?丁酸γ?amino?butryricacid+溴酸鈉Sodiumbromate-N?乙酰?D?葡糖胺N?acetyl?D?glucosamine+L?谷氨酸L?glutamicacid+N?乙酰?β?D?甘露糖胺N?acetyl?β?Dmannosamine+

注：“陽(yáng)性”(+)，“陰性”(-)。

Note:“positive”(+)，“negative”(-).

2.3 16 S rDNA序列及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析

以分離菌基因組DNA為模板，采用PCR方法擴(kuò)增其16 S rDNA序列，進(jìn)行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示目的條帶位于1 400 bp左右(圖2)，經(jīng)測(cè)序獲得16 S rDNA序列片段長(zhǎng)度為1 363 bp，與預(yù)期大小基本一致。通過(guò)Blast檢索表明CA1618菌株與Aeromonassobria的16S rDNA序列同源性為99%～100%，以氣單胞菌屬13種模式細(xì)菌為參考序列進(jìn)行16 S rDNA基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析，結(jié)果顯示CA1618菌株與溫和氣單胞菌ATCC43979T(登錄號(hào)：X74683)親緣關(guān)系最近，聚為一支(圖3)，最終確定CA1618菌株為溫和氣單胞菌(Aeromonassobria)。

2.4 人工感染與藥敏試驗(yàn)結(jié)果

CA1618菌株人工腹腔注射感染鯽魚半數(shù)致死量(LD50)為1.55×107CFU/mL。人工感染病魚與自然感染臨床癥狀基本相似(圖4)，主要為眼球突出，腹部體表、鰭基部出血，肛門腫脹充血，尾鰭中央發(fā)白，腹部腫脹,剖檢有大量腹水，這與腹水癥特征基本一致，并且從頻死魚肝臟中再次分離到與CA1618細(xì)菌形態(tài)一致的病原菌，而對(duì)照組魚觀察14 d無(wú)發(fā)病死亡現(xiàn)象。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示CA1618菌株對(duì)頭孢哌酮、頭孢噻肟、頭孢克肟、奈替米星、萘啶酸、諾氟沙星、氯霉素、四環(huán)素、卡那霉素等抗生素高度敏感，對(duì)磺胺異亞唑、紅霉素、甲氧嘧啶等抗生素中度敏感，而對(duì)氧氟沙星、阿莫西林、氨芐西林等抗生素具有耐藥性(表2)，其中4種抗生素藥敏圖譜見(jiàn)圖5。

M.DNA Maker； 1～5.菌株CA1618

圖3 CA1618菌株16 S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析

圖4 人工感染鯽魚臨床癥狀

3 討論

1.紅霉素；2.萘啶酸；3.頭孢哌酮；4.氨芐西林

抗菌藥物Antimicrobials抑菌圈直徑/mmInhibitionzone判斷標(biāo)準(zhǔn)/mmStandards耐藥R中敏I敏感S敏感性Sensitivity萘啶酸Nalidixicacid40≤1314～18≥19S頭孢噻肟Cefotaxime40≤1415～22≥23S頭孢克肟Cefixime36≤1516～18≥19S奈替米星Netilmicin33≤1415～16≥17S氯霉素Chloramphenicol33≤1213～17≥18S諾氟沙星Norfloxacin31≤1213～16≥17S四環(huán)素Tetracycline28≤1415～18≥19S頭孢哌酮Cefoperazone27≤1516～20≥21S新霉素Neomycin27≤1213～16≥17S慶大霉素Gentamycin26≤1213～14≥14S阿米卡星Amikacin25≤1415～18≥19S呋喃妥因Nitrofurantoin24≤1415～16≥17S利福平Rifampicin23≤1617～19≥20S復(fù)方新諾明Sulfamethoxazolecompound23≤1011～15≥16S卡那霉素Kanamycin18≤1314～17≥18S磺胺異噁唑Sulfasoxazole16≤1213～16≥17I紅霉素Erythromycin15≤1314～22≥23I甲氧嘧啶Sulfadimethoxine15≤1415～16≥17I氧氟沙星Ofloxacin13≤1213～15≥16R阿奇霉素Azithromycin12≤1314～17≥18R阿莫西林Amoxicillin9≤1314～17≥18R氨芐西林Ampicillin0≤1112～14≥15R頭孢噻吩Cefalotin0≤1415～17≥18R頭孢氨芐Cephalexin0≤1415～17≥18R

注：S.高度敏感，I.中度敏感，R.耐藥。

Note:S.Sensitivie;I.Intermediate;R.Resisstance.

溫和氣單胞菌屬于氣單胞菌科(Aeromonadaceae)、氣單胞菌屬(Aeromonas)，廣泛存在于淡水養(yǎng)殖水體環(huán)境中，常常引起多種水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物發(fā)病[1-4]。近幾年，國(guó)外學(xué)者陸續(xù)開(kāi)展魚源溫 和 氣 單 胞菌的分離鑒定研究，已報(bào)道虹鱒[2]、墨頭魚[6]、鰱等魚類致病菌[7]。胡琳琳等[3]從發(fā)病金魚中分離出溫和氣單胞菌并進(jìn)行形態(tài)、生理生化特征、16 S rDNA基因序列分析及人工感染試驗(yàn)，證實(shí)溫和氣單胞菌人工感染金魚死亡率達(dá)90%。韓繼衛(wèi)等[11]從患病黃顙魚皮膚潰爛處及肝臟組織分離到SX-1菌株，人工感染試驗(yàn)證實(shí)是致病性溫和氣單胞菌。童桂香等[3]從患病黃沙鱉肝臟組織中分離到1株菌株，結(jié)果表明溫和氣單胞菌是引起黃沙鱉發(fā)病的病原菌，并且具有較強(qiáng)致病性。但是，關(guān)于鯽魚腹水癥病原菌診斷與防治研究，目前鮮有文獻(xiàn)報(bào)道[1,9]。孫其煥等[1]報(bào)道溫和氣單胞菌N-l-2菌株為引起異育銀鯽溶血性腹水病的病原菌，病魚體表及眼睛充血，肝臟腫大，腸道充血、肛門紅腫，有腹水、突眼癥狀。張曉君等[9]報(bào)道異溫和氣單胞菌JY081016菌株導(dǎo)致銀鯽發(fā)病，主要表現(xiàn)為眼球突出，腹部膨脹，腹腔積有大量腹水，人工感染證實(shí)對(duì)鯽致病性較強(qiáng)。本試驗(yàn)證實(shí)從患病腹水癥鯽魚體內(nèi)分離到溫和氣單胞菌CA1618菌株，人工回歸感染鯽魚LD50為1.55×107CFU/mL，病魚臨床表現(xiàn)與腹水癥特征基本一致。以上研究表明鯽魚腹水癥是由溫和氣單胞菌致病株引起的，這不僅對(duì)鯽腹水癥病原診斷學(xué)有重要意義，而且對(duì)該病流行病學(xué)及其防控具有科學(xué)參考價(jià)值。

近年來(lái)，魚類病原菌耐藥性不斷增強(qiáng)，進(jìn)一步增加了魚類疾病臨床治療難度。因此，積極開(kāi)展魚源病原菌的藥敏特性研究，可為水產(chǎn)養(yǎng)殖魚病防治提供依據(jù)。鱉源溫和氣單胞菌藥敏試驗(yàn)表明對(duì)頭孢哌酮、諾氟沙星、鏈霉素、氧氟沙星等藥物敏感[4]。金魚溫和氣單胞菌菌株對(duì)慶大霉素、卡拉霉素、氯霉素等敏感[3]。曹海鵬等[12]報(bào)道溫和氣單胞菌對(duì)新霉素、頭孢呋肟、奈替米星等藥物敏感。本研究從鯽魚腹水癥病例中分離到致病性溫和氣單胞菌并進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，旨在篩選有效治療藥物，藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示對(duì)頭孢哌酮、頭孢噻肟、頭孢克肟、萘啶酸、諾氟沙星、四環(huán)素、復(fù)方新諾明等藥物敏感，這與邢根娣等[13]報(bào)道鯽魚溫和氣單胞菌XA-2菌株藥敏譜基本一致。本試驗(yàn)結(jié)果為鯽魚腹水癥的防治提供了重要參考。

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Isolation,Identification and Antimicrobial Susceptibility Test of PathogenicAeromonassobriafrom Ascitesosis of Crucian Carp

LI Zhan-fu1,SONG Ya-jiao1,Lü Ai-jun1,2,ZHANG Chao1,PEI Chao1,LI Li1, HU Xiu-cai2,SUN Jing-feng2

(1.CollegeofFisheries,HenanNormalUniversity,Xinxiang，Henan，453007,China; 2.TianjinKeyLabofAqua-EcologyandAquaculture,CollegeofFisheries,TianjinAgriculturalUniversity,Tianjin,300384,China)

The bacterial strain was isolated from the diseased crucian carp (Carassiuscarassius) mainly occured the abdominal swelling and ascitesosis,which were collected from a fish farm in Xinxiang city,Henan province.The results showed that a purified bacterial strain was isolated from the liver and then named strain CA1618,it was identified as theAeromonassobriaby using bacterial morphology,biochemical characteristics of Biolog GenⅢ microstation system,amplification of 16 S rDNA gene sequence based on PCR method and construction of phylogenetic tree analysis.The strain CA1618 was Gram-negative rod-shaped cells,showing fermentation of glucose,maltose,galactose and trehalose etc.,and similarity and distance of physiological and biochemical characteristics compared withAeromonassobriawere 0.575 and 6.226,respectively.The 16 S rDNA gene sequence of the isolate CA1618 was 1 363 bp in length,and Blast alignments showed that the isolate shared the 99%-100% sequence identities of 16 S rDNA with the reference strainAeromonassobria.It had the closest relationship,and naturally clustered into one group with type strainAeromonassobriaATCC43979 (GenBank No.X74683) by phylogenetic tree analysis.The isolate CA1618 exhibited a 50% lethal dose (LD50) of 1.55×107CFU/mL.Antimicrobial susceptibility pattern of the isolate showed it was susceptible to cefoperazone,cefotaxime,cefixime,nalidixic acid,norfloxacin,sulfamethoxazole/trimethoprim,tetracycline and chloromycetin,etc.

crucian carp;Aeromoanssobria; isolation and identification; ascitesosis；antimicrobial susceptibility test

2016-06-29

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31272692)；河南省高等學(xué)校重點(diǎn)科研項(xiàng)目(17A240001)；河南省高校科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)支持計(jì)劃(15IRTSTHN018)；天津市自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(16JCZDJC33500，15JCZDJC34000)

李戰(zhàn)福(1992-)，男，江西上饒人， 2012級(jí)本科生，主要從事水產(chǎn)動(dòng)物微生物學(xué)研究。*通訊作者

S941.4

B

1007-5038(2017)02-0120-06