代謝工程改造釀酒酵母合成葡萄糖二酸

鞏旭，劉葉，王毳，李江華，康振

1 江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實驗室，江蘇 無錫 214122

2 江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122

代謝工程改造釀酒酵母合成葡萄糖二酸

鞏旭1,2，劉葉1,2，王毳1,2，李江華1,2，康振1,2

1 江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實驗室，江蘇 無錫 214122

2 江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122

鞏旭, 劉葉, 王毳, 等. 代謝工程改造釀酒酵母合成葡萄糖二酸. 生物工程學(xué)報, 2017, 33(2): 228–236.

Gong X, Liu Y, Wang C, et al. Metabolic engineering ofSaccharomyces cerevisiaefor production of glucaric acid. Chin J Biotech, 2017, 33(2): 228–236.

葡萄糖二酸是一種高附加值的有機(jī)酸，廣泛用于食品、醫(yī)藥和化工領(lǐng)域。為獲得生產(chǎn)葡萄糖二酸的微生物細(xì)胞工廠，通過共表達(dá)小鼠來源的肌醇加氧酶 (MIOX) 及惡臭假單胞菌來源的醛酸脫氫酶 (Udh)，在釀酒酵母Saccharomyces cerevisiaeCEN.PK2-1C中構(gòu)建了葡萄糖二酸合成途徑，產(chǎn)量為 (28.28±3.15) mg/L。在此基礎(chǔ)上，通過調(diào)控前體肌醇的合成途徑，發(fā)現(xiàn)肌醇-1-磷酸合成酶 (INO1) 是葡萄糖二酸合成途徑的限速酶，過量表達(dá)INO1，葡萄糖二酸產(chǎn)量達(dá)到 (107.51±10.87) mg/L，提高了2.8倍。進(jìn)一步弱化競爭支路中磷酸果糖激酶 (PFK1) 的表達(dá)，最終葡萄糖二酸的產(chǎn)量達(dá)到 (230.22±10.75) mg/L，為進(jìn)一步獲得高產(chǎn)葡萄糖二酸細(xì)胞工廠提供基礎(chǔ)。

葡萄糖二酸，肌醇-1-磷酸合成酶，磷酸果糖激酶，釀酒酵母，代謝工程

葡萄糖二酸 (Glucaric acid，GA) 是一種天然有機(jī)酸，廣泛存在于水果、蔬菜和哺乳動物中，可應(yīng)用于降低膽固醇[1]、治療肥胖[2]和癌癥[3]等。此外，葡萄糖二酸作為聚合物的合成成分，被大量用于新型羥基化尼龍材料的制造，又因其具備可與金屬螯合的特性，葡萄糖二酸催化法為合成染料的生物降解提供了新思路[4-5]。眾多附加應(yīng)用使得葡萄糖二酸在2004年被美國能源部確定為“最具價值的生物煉制產(chǎn)品”[6]。

葡萄糖二酸主要通過化學(xué)氧化葡萄糖的方法制備，包括硝酸氧化法及2,2,6,6-四甲基哌啶氧自由基 (TEMPO) 氧化法等[7]。但因其存在試劑耗費(fèi)量大、環(huán)境污染等問題，使得化學(xué)法應(yīng)用受到限制。生物法制備葡萄糖二酸因其長足的發(fā)展空間，逐漸受到研究者的重視。哺乳動物體內(nèi)，葡萄糖到葡萄糖二酸至少需要10步酶催化反應(yīng)[8]。Prather團(tuán)隊通過組合表達(dá)不同來源的途徑酶，在大腸桿菌和釀酒酵母中成功構(gòu)建了葡萄糖二酸合成途徑，實現(xiàn)了微生物合成葡萄糖二酸[9-10]；Liu等以肌醇為底物，在畢赤酵母中生產(chǎn)葡萄糖二酸，產(chǎn)量達(dá)到目前最高值(6.61±0.30) g/L[11]；Lee等通過多步酶法降解半纖維素，同時將水解產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)化，成功獲得葡萄糖二酸[12]。

目前，關(guān)于微生物法生產(chǎn)葡萄糖二酸的研究，多依賴于其前體肌醇的添加，造成生產(chǎn)成本較高；酶法降解雖然以生物質(zhì)原料為底物，但產(chǎn)量較低，只達(dá)到微摩爾每升級別。為進(jìn)一步獲得葡萄糖二酸的高產(chǎn)菌株，同時使產(chǎn)品獲得更廣泛的應(yīng)用，本研究對食品安全菌株釀酒酵母進(jìn)行代謝工程改造，實現(xiàn)以葡萄糖為唯一前體合成葡萄糖二酸。首先在釀酒酵母Saccharomyces cerevisiaeCEN.PK2-1C中共表達(dá)小鼠來源的肌醇加氧酶 (MIOX) 及惡臭假單胞菌來源的醛酸脫氫酶 (Udh)，成功構(gòu)建葡萄糖二酸合成途徑，在此基礎(chǔ)上，通過過量表達(dá)肌醇-1-磷酸合成酶 (INO1)，強(qiáng)化其前體肌醇的合成。最后，通過敲除磷酸果糖激酶 (PFK1) 弱化競爭支路——糖酵解途徑，進(jìn)一步提高葡萄糖二酸的產(chǎn)量，重組菌在搖瓶中產(chǎn)量達(dá)到 (230.22± 10.75) mg/L。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和質(zhì)粒

本研究所用菌株和質(zhì)粒均為作者所在實驗室購買和保存，詳見表1。

1.1.2 酶、引物、DNA marker及相關(guān)試劑盒

Primer STAR DNA聚合酶、DNA marker、T4 DNA連接酶和大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備試劑盒均購自TaKaRa (大連)；各種限制性內(nèi)切酶購自Thermo公司；PCR引物 (表2) 由生工生物 (上海) 有限公司合成；質(zhì)粒小量抽提試劑盒和細(xì)菌總DNA提取試劑盒均購自生工生物 (上海) 有限公司；酵母基因組提取試劑盒購自天根生化科技 (北京) 有限公司；葡萄糖二酸鉀色譜級標(biāo)準(zhǔn)品購自Sigma-Aldrich公司。

表1 本文所用的質(zhì)粒與菌株Table 1 Plasmids and strains used in this study

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 LB培養(yǎng)基 (g/L)

蛋白胨10，氯化鈉10，酵母粉5，自然pH。制備固體培養(yǎng)基時添加2%的瓊脂。

1.2.2 YPD培養(yǎng)基 (g/L)

葡萄糖40，蛋白胨20，酵母粉10，自然pH。

1.2.3 SD篩選培養(yǎng)基 (g/L)

Yeast Nitrigon Base 6.7，葡萄糖20，根據(jù)需要添加亮氨酸、組氨酸、色氨酸及尿嘧啶，使其在培養(yǎng)基中終濃度為50 μg/mL，自然pH。制備固體培養(yǎng)基時添加2%的瓊脂。

1.3 培養(yǎng)方法

1.3.1 種子培養(yǎng)

挑取生長良好的單菌落接種于含25 mL的YPD液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，30 ℃、220 r/min培養(yǎng)24 h。

1.3.2 搖瓶培養(yǎng)

將種子培養(yǎng)液按1%接種量轉(zhuǎn)接至50 mL (搖瓶容量為500 mL) 的發(fā)酵培養(yǎng)基YPD中，培養(yǎng)96 h。

1.4 方法

1.4.1 基因的擴(kuò)增與質(zhì)粒的構(gòu)建

以從S.cerevisiaeCEN.PK2-1C中提取的基因組DNA為模板，利用引物對INM1-6a-F/R、 INM2-6a-F/R和INO1-6a-F/R分別擴(kuò)增INM1、INM2和INO1基因；以從惡臭假單胞菌Pseudomonas putidaKT2440中提取的基因組DNA為模板，利用引物對TEF-Udh-F/R擴(kuò)增Udh基因；以pUC57-mmol/L質(zhì)粒為模板，利用引物對GPD-MIOX-F/R擴(kuò)增小鼠來源的MIOX基因。pFA6a-His-F/R引物對用于擴(kuò)增pFA6a質(zhì)粒。

將擴(kuò)增得到的MIOX基因用EcoRⅠ和Hind Ⅲ雙酶切，連接至相應(yīng)切口的質(zhì)粒pY26-GPDTEF中，轉(zhuǎn)化驗證后再將該質(zhì)粒用NotⅠ和BglⅡ雙酶切，與經(jīng)相同限制性內(nèi)切酶酶切后的Udh基因連接，轉(zhuǎn)化驗證后得到質(zhì)粒pY26-MIOX-Udh。

將擴(kuò)增得到的INM1、INM2和INO1基因用NheⅠ和XhoⅠ雙酶切，與擴(kuò)增得到并用相同內(nèi)切酶酶切后的pFA6a質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)化驗證后分別得到pFA6a-INM1、pFA6a-INM2及pFA6a-INO1質(zhì)粒。再分別以pFA6a-INM1、pFA6a-INM2及pFA6a-INO1質(zhì)粒為模板，TEF-INM1 (BamHⅠ) F/R、TEF-INM2 (Hind Ⅲ) F/R、TEF-INO1 (SamⅠ) F為引物，分別擴(kuò)增INM1、INM2和INO1表達(dá)框。得到的表達(dá)框分別經(jīng)BamHⅠ、Hind Ⅲ及SamⅠ單酶切后，連接至相應(yīng)單酶切后的YEp351質(zhì)粒上，轉(zhuǎn)化驗證后分別得到Y(jié)Ep351-INM1、YEp351-INM2及YEp351-INO1質(zhì)粒。

將單酶切后的INM1表達(dá)框連接至BamHⅠ酶切后的YEp351-INO1質(zhì)粒上，得到質(zhì)粒YEp351-INM1-INO1。

以pFA6a-HIS3MX6為模板，分別以Pfk1-disrup-F/R及Pfk2-disrup-F/R引物對擴(kuò)增PFK1及PFK2敲除框。

引物見表2。

表2 本文使用到的引物Table 2 Primers used in this study

1.4.2 酵母的轉(zhuǎn)化和重組子的篩選

釀酒酵母的轉(zhuǎn)化采用LiAc/SSDNA/PEG法[15]。轉(zhuǎn)化后涂布于相應(yīng)氨基酸缺陷的SD篩選平板，挑選轉(zhuǎn)化子，提取基因組或質(zhì)粒進(jìn)行PCR驗證。

1.4.3 葡萄糖二酸的定量檢測

采用HPLC定量檢測葡萄糖二酸，具體參見文獻(xiàn)[10]。HPLC分析條件：流動相為5 mmol/L稀硫酸，色譜柱為Aminex HPX-87H (Bio-Rad，USA)，流速0.5 mL/min，柱溫55 ℃，進(jìn)樣量10 μL，檢測器為紫外檢測器，檢測波長為210 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 釀酒酵母中葡萄糖二酸合成途徑的構(gòu)建

為實現(xiàn)釀酒酵母中葡萄糖二酸的從頭合成，首先需要在菌株中構(gòu)建1條由葡萄糖到葡萄糖二酸的通路。如圖1所示，在釀酒酵母中存在從葡萄糖到肌醇完整的合成途徑，包含3個途徑酶INO1、INM1和INM2，因此只需要異源表達(dá)肌醇加氧酶 (MIOX) 和醛酸脫氫酶 (Udh)。

質(zhì)粒pY26-MIOX-Udh同時含有MIOX表達(dá)框和Udh表達(dá)框，通過將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化S.cerevisiaeCEN.PK2-1C得到產(chǎn)葡萄糖二酸的菌株S-UM，在S.cerevisiae中成功構(gòu)建了從葡萄糖到葡萄糖二酸的合成途徑。將該重組菌株培養(yǎng)96 h后，取發(fā)酵液進(jìn)行HPLC檢測產(chǎn)物，HPLC檢測結(jié)果如圖2B所示。

通過對不同濃度的葡萄糖二酸標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC (圖2A) 分析，確定其保留時間約為9.154 min，并確定其標(biāo)準(zhǔn)曲線為C=1.761 6S+7.954 9 (C代表GA濃度，單位：mg/L；S代表峰面積)，相關(guān)系數(shù)R=0.995。據(jù)此，確定菌株S-UM葡萄糖二酸的產(chǎn)量為 (28.28±3.15) mg/L。

圖1 釀酒酵母中葡萄糖二酸合成途徑Fig. 1 The biosynthetic pathway of GA inS.cerevisiae. The native pathways are in black while the heterologous GA biosynthetic pathway is in red.

圖2 葡萄糖二酸標(biāo)準(zhǔn)品和重組菌發(fā)酵液的HPLC圖Fig. 2 HPLC chromatogram of the standard sample and the product from recombinantS.cerevisiae. (A) GA. (B) The product from S-UM.

2.2 過量表達(dá)肌醇合成途徑關(guān)鍵酶強(qiáng)化葡萄糖二酸的合成

肌醇不僅是合成葡萄糖二酸的重要前體，而且胞內(nèi)肌醇的含量在一定范圍內(nèi)的提升能增強(qiáng)MIOX的活性[16]。因此，在一定程度上，肌醇的含量與葡萄糖二酸的產(chǎn)量存在正相關(guān)性。但是，在釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)，有限的肌醇不僅要生產(chǎn)目標(biāo)產(chǎn)物，還要合成眾多磷脂?；衔锖湍憠A等[17-18]，嚴(yán)重制約了利用微生物作為生產(chǎn)平臺合成葡萄糖二酸。因此，為進(jìn)一步提高葡萄糖二酸產(chǎn)量，過量表達(dá)肌醇合成途徑不同基因，強(qiáng)化葡萄糖二酸代謝流。

如圖1所示，在肌醇合成途徑中，首先由INO1將6-磷酸葡萄糖轉(zhuǎn)化為3-磷酸肌醇，再由INM1或其同工酶INM2將3-磷酸肌醇轉(zhuǎn)化為肌醇。本研究通過分別過量表達(dá)INO1、INM1及INM2，分析對葡萄糖二酸合成的影響。分別將含有INO1、INM1及INM2基因的重組菌株S-INO1-UM、S-INM1-UM、S-INM2-UM及對照菌株S0在搖瓶中培養(yǎng)，葡萄糖二酸產(chǎn)量如圖3所示。

從圖3中可以看出，與對照菌株S0相比，S-INO1-UM的葡萄糖二酸產(chǎn)量有明顯提升，96 h產(chǎn)量達(dá)到 (107.51±10.87) mg/L，是對照菌S0的3.8倍，說明過量表達(dá)INO1有利于葡萄糖二酸的生成。而重組菌株S-INM1-UM及S-INM2-UM中葡萄糖二酸的產(chǎn)量沒有明顯變化。上述結(jié)果說明INO1編碼的是葡萄糖二酸合成途徑中的一個限速酶，而INM1和INM2雖然也是肌醇合成途徑的必需基因，但釀酒酵母自身含有的肌醇單磷酸酶 (INM1/INM2) 已足夠催化3-磷酸肌醇到肌醇的反應(yīng)。

為進(jìn)一步驗證以上推論，將過量表達(dá)INM1和INO1的重組菌株S-INO1+INM1-UM培養(yǎng)，該重組菌葡萄糖二酸產(chǎn)量與S-INO1-UM相近(圖3)。由此可以進(jìn)一步證明，過量表達(dá)INO1可以強(qiáng)化葡萄糖二酸的上游代謝流，進(jìn)而提高其產(chǎn)量。這與大腸桿菌合成葡萄糖二酸的相關(guān)研究一致[16]。

圖3 過表達(dá)肌醇合成途徑不同基因?qū)ζ咸烟嵌岙a(chǎn)量的影響Fig. 3 Effect of overexpression of inositol biosynthetic pathway genes on GA production.

另外，有研究表明INO1是肌醇合成途徑的限速酶[18]。為驗證過量表達(dá)INO1是通過增加胞內(nèi)肌醇含量，進(jìn)而提升葡萄糖二酸含量，本研究用HPLC法[19]分別檢測菌株S、S-INM1、S-INM2、S-INO1和S-INM1+INO1胞內(nèi)肌醇含量，但均因含量較低無法量化?？赡苁且驗榧〈甲鳛獒劸平湍傅拇x中間產(chǎn)物，多流向磷脂酰肌醇代謝途徑中，很少積累，故未獲得相應(yīng)的有效數(shù)據(jù)。

2.3 敲除PFK1/PFK2基因強(qiáng)化葡萄糖二酸的合成

在釀酒酵母中，6-磷酸葡萄糖作為葡萄糖二酸的前體是一個重要的分支點(diǎn)，除了參與肌醇磷酸代謝途徑，還參與其競爭支路——糖酵解及磷酸戊糖途徑 (圖1)。為進(jìn)一步提高重組菌中葡萄糖二酸的產(chǎn)量，需要更多的6-磷酸葡萄糖進(jìn)入肌醇磷酸代謝途徑中。因此，通過弱化其競爭途徑的關(guān)鍵酶——磷酸果糖激酶的活性抑制糖酵解途徑，是減少6-磷酸葡萄糖消耗的一個重要策略。有研究表明，PFK1和PFK2分別編碼磷酸果糖激酶的α亞基和β亞基，兩者中任一亞基突變失活后，另一亞基也能單獨(dú)完成該酶的功能，同時使胞內(nèi)6-磷酸葡萄糖含量上升[20-21]。本研究分別敲除重組菌中PFK1和PFK2基因，即將PFK1敲除框和PFK2敲除框分別轉(zhuǎn)化到S-INO1-UM中，驗證正確后得到重組菌S1和S2。圖4為S1和S2缺陷菌株的PCR鑒定凝膠電泳圖。

S1及S2重組菌搖瓶培養(yǎng)96 h后葡萄糖二酸產(chǎn)量如圖5所示。敲除PFK1或PFK2基因后，重組菌葡萄糖二酸產(chǎn)量均有明顯提高，分別為(230.22±10.75) mg/L及 (178.99±9.21) mg/L。該結(jié)果表明，弱化糖酵解途徑能有效促進(jìn)葡萄糖二酸的合成。

其中，S1比S2產(chǎn)量更高，故敲除PFK1對葡萄糖二酸的合成有更好的促進(jìn)作用。在磷酸果糖激酶中，α亞基主要作用為調(diào)節(jié)功能，而β亞基行使催化功能[20]。因此推測重組菌S1和S2葡萄糖二酸產(chǎn)量存在差異可能是由兩亞基功能不同，失活后對磷酸果糖激酶活性的抑制效果不同而造成的。

圖4 PFK1/PFK2基因敲除菌株的鑒定Fig. 4 Identification ofPFK1/PFK2mutantS.cerevisiae.

圖5 敲除PFK1/PFK2對葡萄糖二酸產(chǎn)量的影響Fig. 5 Effect ofPFK1/PFK2deletion on the GA production.

3 結(jié)語

葡萄糖二酸作為一種自然界存在的高附加值有機(jī)酸，具有重要的生理功能。通過共表達(dá)小鼠來源的肌醇加氧酶 (MIOX) 及惡臭假單胞菌來源的醛酸脫氫酶 (Udh)，在釀酒酵母中成功構(gòu)建了葡萄糖二酸合成途徑。通過調(diào)控其前體肌醇合成途徑，發(fā)現(xiàn)肌醇-1-磷酸合成酶 (INO1) 是葡萄糖二酸合成途徑的限速酶。在此基礎(chǔ)上，通過使PFK1酶失活，弱化競爭支路，使產(chǎn)量達(dá)到(230.22±10.75) mg/L，是相同條件下原始菌株產(chǎn)量的8.14倍。為進(jìn)一步提高葡萄糖二酸的產(chǎn)量，通過抑制磷酸戊糖支路、磷脂酰肌醇支路以及改造葡萄糖二酸途徑限速酶，成為后續(xù)研究的重點(diǎn)。

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

Metabolic engineering ofSaccharomyces cerevisiaefor production of glucaric acid

Xu Gong1,2, Ye Liu1,2, Cui Wang1,2, Jianghua Li1,2and Zhen Kang1,2
1Key Laboratory of Industrial Biotechnology,Ministry of Education,Jiangnan University,Wuxi214122,Jiangsu,China
2School of Biotechnology,Jiangnan University,Wuxi214122,Jiangsu,China

Glucaric acid, a high value-added organic acid, is widely used in food, pharmaceutical and chemical industries. For microbial production of glucaric acid inSaccharomyces cerevisiae, we constructed a synthetic glucaric acid biosynthetic pathway by coexpressing the genes encoding myo-inositol oxygenase from mice and uronate dehydrogenase fromPseudomonas putida. Moreover, myo-inositol-1-phosphate synthase was identified as a rate-limiting enzyme in glucaric acid pathway and was upregulated, resulting in the production of glucaric acid of (107.51±10.87) mg/L, a 2.8-fold increase compared to the parent strain. Then, by repressing the activity of phosphofructokinase, the concentration of glucaric acid further increased to (230.22±10.75) mg/L. The strategy could be further used to construct cell factories for glucaric acid production.

glucaric acid, myo-inositol-1-phosphate synthase, phosphofructokinase,Saccharomyces cerevisiae, metabolic engineering

s:Zhen Kang. Tel: +86-510-85918307; Fax: +86-510-85918309; E-mail: zkang@jiangnan.edu.cn

Received:July 28, 2016;Accepted:September 13, 2016

Supported by:Key Technologies R & D Program of Jiangsu Province, China (No. BE2014607), Program for Chang Jiang Scholar and Innovative Research Team in University (No. IRT_15R26), Natural Science Foundation of Jiangsu Province (No. BK20141107)

Jianghua Li. Tel: +86-510-85329031; Fax: +86-510-85918309; E-mail: lijianghua@jiangnan.edu.cn

江蘇省科技支撐計劃項目 (No. BE2014607)，長江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊發(fā)展計劃 (No. IRT_15R26)，江蘇省自然科學(xué)基金 (No. BK20141107) 資助。