響應(yīng)面法優(yōu)化鈍裂銀蓮花花色素提取工藝

藍(lán)雯琳,劉左軍,劉志鵬

(蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院， 甘肅 蘭州 730000)

響應(yīng)面法優(yōu)化鈍裂銀蓮花花色素提取工藝

藍(lán)雯琳,劉左軍,劉志鵬

(蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院， 甘肅 蘭州 730000)

以鈍裂銀蓮花(Anemoneobtusiloba)的萼片為提取材料，選取料液質(zhì)量濃度、pH、提取時(shí)間、提取溫度4個因素，以鈍裂銀蓮花花色素提取液的吸光值為響應(yīng)面，對鈍裂銀蓮花花色素的提取條件進(jìn)行優(yōu)化，用四舍五入法確定了鈍裂銀蓮花花色素提取的最佳工藝為：料液質(zhì)量濃度70 g·mL-1，pH 3.8，提取溫度61 ℃，提取時(shí)間87 min，在此條件下，鈍裂銀蓮花花色素提取液的吸光值可達(dá)最佳，為0.154 5。

鈍裂銀蓮花;花色素;優(yōu)化;響應(yīng)面法

鈍裂銀蓮花(Anemoneobtusiloba)為毛茛科(Ranunculaceae)銀蓮花屬(Anemone)多年生草本植物，主要分布在我國西藏南部和東部，四川西部[1-2]。本屬植物全草可入藥，具有清熱解毒等顯著功效[3-4]。其花期為5月-7月，花瓣有黃色、淺黃色、白色3種[5]。目前，國內(nèi)關(guān)于鈍裂銀蓮花的研究很少，主要研究集中在藥用價(jià)值[6]和繁殖分配[7]等方面。作為青藏高原上比較原始的一種雜草，它是草原退化的一種重要的指示性植物。通過提取其花色素并將花色素進(jìn)行分離純化，可以進(jìn)一步分析出其花色的基因表達(dá)，為鈍裂銀蓮花適應(yīng)高寒環(huán)境做出合理的理論推斷，是后續(xù)開發(fā)鈍裂銀蓮花的經(jīng)濟(jì)價(jià)值重要的理論依據(jù)，也為鈍裂銀蓮花生物多樣性的后續(xù)研究提供重要的參考?；ㄉ厥且环N天然色素，并且大部分花色素可以安全食用，由于它有一定的營養(yǎng)價(jià)值并且可以入藥，越來越受到人們的重視[8-9]。本研究以青藏高原東部分布的鈍裂銀蓮花的萼片為試驗(yàn)材料，控制花色素的提取條件為單一變量，利用響應(yīng)面法選出花色素的最佳提取方法，為提取高寒草甸地區(qū)植被的花色素提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用鈍裂銀蓮花于2015年6月采自蘭州大學(xué)干旱農(nóng)業(yè)生態(tài)國家重點(diǎn)試驗(yàn)室高寒草地生態(tài)系統(tǒng)定位站，地屬青藏高原東部的瑪曲地區(qū)，平均海拔3 600 m，年均溫度1.2 ℃，年降水量620 mm，植被類型屬高寒草甸[10]。采回的花用鑷子將花蕊去除，在60 ℃中烘干24 h，取出后磨碎呈粉末狀，裝入自封袋中避光保存。

1.2 試驗(yàn)儀器

上海博迅實(shí)業(yè)有限公司GZX-9030MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱、上海佑科儀器儀表有限公司PHB-8、Mettle-Toledo Group AB104-N分析天平、上海美譜達(dá)儀器有限公司UV-3000PC紫外-可見分光光度計(jì)、江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠KS康式振蕩器。

1.3 單因素試驗(yàn)

選取料液質(zhì)量濃度、pH、提取時(shí)間和提取溫度作為鈍裂銀蓮花花色素提取影響因素。分別稱取0.1 g鈍裂銀蓮花的萼片粉末，提取劑的種類是蒸餾水、70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、甲醇、乙醚、鹽酸與甲醇(1/99)混合液、鹽酸與甲醇(1/60)混合液、乙酸乙酯；料液質(zhì)量濃度設(shè)為60、80、100、120、140、160、180和200 g·mL-1；調(diào)節(jié)每瓶pH分別為2、4、6、8、10、12和14；放在搖床中震蕩，浸提時(shí)間分別為30、60、90、120、150 和180 min；提取溫度設(shè)置為20、30、40、50、60、70和80 ℃。單因素變化時(shí)，確定其它因素不變，確定單因素的順序依據(jù)試驗(yàn)所選單因素影響花色素提取的強(qiáng)弱。肉眼觀察其顏色變化及溶解性，濾紙過濾，取上清液于比色管中，稀釋10倍，蒸餾水作為對照組，在紫外可見光自動記錄分光光度計(jì)400-600 nm進(jìn)行最大波長掃描[11]，測得其吸光值，每組3次重復(fù)。

1.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

以單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ)，根據(jù)Box-Benhnken方法[12-13]，利用Design-expert軟件，以鈍裂銀蓮花花色素的提取劑、料液質(zhì)量濃度、pH、提取時(shí)間及提取溫度作為自變量，花色素提取的吸光值作為響應(yīng)值，進(jìn)行了4因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定鈍裂銀蓮花花色素提取的最優(yōu)方法。

1.5 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析

本試驗(yàn)采用響應(yīng)面法，利用Design-expert軟件進(jìn)行二次回歸擬合，運(yùn)用SPSS 22.0軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

各因素影響下的花色素吸光值在波長為535 nm處有最大吸收峰。單因素試驗(yàn)結(jié)果表明：最佳提取劑為鹽酸與甲醇(1/60，V/V)混合液；最佳提取料液質(zhì)量濃度為80 g·mL-1；最佳提取pH為4；最佳提取時(shí)間為90 min最佳提取溫度為60 ℃(圖1)。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化鈍裂銀蓮花花色素的提取工藝

2.2.1 Box-Benhnken法優(yōu)化試驗(yàn) 以單因素試驗(yàn)結(jié)果為依據(jù)，選取料液質(zhì)量濃度、pH、提取溫度和提取時(shí)間4個因素為自變量，根據(jù)Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理優(yōu)化鈍裂銀蓮花花色素的提取工藝，試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案見表1。

圖1 5個因素下下鈍裂銀蓮花的吸光值Fig.1 The light absorption values of Anemone obtusiloba for five different factors表1 因素水平設(shè)計(jì)表Table 1 Experimental factors and levels of design

水平Level因素Factor料液質(zhì)量濃度Thematerialliquidmassconcentration/g·mL-1pH提取溫度Extractiontime/℃提取時(shí)間Extractiontemperature/min-16025060080460901100670120

2.2.3 響應(yīng)面交互作用分析 為了進(jìn)一步研究相關(guān)變量之間作用的最佳選擇，通過軟件Design-Expert8.0繪制出的響應(yīng)面曲線圖來進(jìn)行分析，根據(jù)各因素之間的等高線和響應(yīng)面圖可知(圖2)，曲線表現(xiàn)的越陡，說明影響越顯著[16]。三維空間曲面圖可反映A、B、C、D 4個因素對響應(yīng)值A(chǔ)535的影響。由等高線可以看出，存在極值的條件應(yīng)該在圓心處。通過軟件分析得到的本試驗(yàn)最佳提取工藝為料液質(zhì)量濃度是70 g·mL-1，pH為3.8，提取溫度是61.01℃，提取時(shí)間為86.97 min，預(yù)測最優(yōu)值為0.152 0。由于試驗(yàn)儀器的限制，驗(yàn)證試驗(yàn)選取的最佳提取工藝(四舍五入)為料液質(zhì)量濃度是70 g·mL-1，pH為3.8，提取溫度是61 ℃，提取時(shí)間是87 min，進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，得到鈍裂銀蓮花花色素提取液實(shí)際吸光值為0.154 5，與理論值相差不顯著(P>0.05)，說明響應(yīng)值的真實(shí)值與回歸方程的預(yù)測值吻合良好，所以優(yōu)化結(jié)果是合理可靠的。

表2 Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)值表(n=29)Table 2 Box-Benhnken experimental design and response(n=29)

3 討論與結(jié)論

植物花色形成是一個復(fù)雜的過程，受到很多因素影響[17]，其中最主要的是花色素是否在植物花瓣中存在[18]。學(xué)者根據(jù)顏色將花色色素分為類胡蘿卜素、類黃酮和花青素[19]。傳統(tǒng)的色素提取方法存在著提取時(shí)間長、原料預(yù)處理能耗高、生產(chǎn)的色素產(chǎn)品純度差等缺點(diǎn)[20]，直接影響了天然色素的開發(fā)和應(yīng)用。本研究提取鈍裂銀蓮花花色素采用了有機(jī)溶劑提取[21]的方法，并在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行了響應(yīng)面分析，優(yōu)化了鈍裂銀蓮花花色素提取的條件，為后續(xù)開發(fā)草原上其它植物色素提取的方法提供技術(shù)支撐。參考相關(guān)文獻(xiàn)，認(rèn)為鈍裂銀蓮花花色素的主要成分是類黃酮類化合物[22-23]，并含有少量葉綠素和類胡蘿卜素[24]。優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果表明鈍裂銀蓮花花色素提取的最佳工藝為：料液質(zhì)量濃度是70 g·mL-1，pH為3.8，提取溫度是61 ℃，提取時(shí)間為87 min(由于儀器條件，此條件均為四舍五入的結(jié)果)。關(guān)于鈍裂銀蓮花花色素的研究及其分離純化目前已經(jīng)取得初步進(jìn)展，本研究僅對鈍裂銀蓮花花色素的提取方法的優(yōu)化進(jìn)行了初步的探討，為后續(xù)鈍裂銀蓮花花色素的分離純化提供技術(shù)支撐，而鈍裂銀蓮花花色素苷的主要成分的分離以及藥用價(jià)值有待于做進(jìn)一步驗(yàn)證。

表3 響應(yīng)面方差分析Table 3 Response surface analysis of variance

注：A,料液質(zhì)量濃度；B，pH;C,提取溫度；D,提取時(shí)間；* 表示顯著(P<0.05)；**表示極顯著(P<0.01)。

Note: A, the material liquid mass concentration; B, pH; C, extraction temperature; D, etraction time; * indicates significant at the 0.05 level; ** indicates highly significant at the 0.01 level.

圖2 兩因素交互影響吸光值的的響應(yīng)面圖Fig.2 Two-factor interactions affecting the light absorption value of the response surface plot

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(責(zé)任編輯 茍燕妮)

Optimization of anthocyanidin extraction fromAnemoneobtusilobausing response surface methodology

Lan Wen-lin, Liu Zuo-jun, Liu Zhi-peng

(College of Life Science and Engineering, Lanzhou University of Technology, Lanzhou 730000, China)

In this study, we used the sepals ofAnemoneobtusilobaas experimental material for extraction of anthocyanidin using response surface methodology. Four factors were selected in this experiment: the material liquid mass concentration, pH, extraction time, and extraction temperature. We selected the light absorption value of the anthocyanidin ofA.obtusilobaas a response surface to optimize the extraction conditions of anthocyanidin. Our results confirmed that the most efficient extraction of anthocyanidin was achieved under the following conditions: a material liquid mass concentration of 70 g·mL-1, an extraction temperature of 61 ℃, an extraction time of 87 min, and pH 3.8. Under these conditions, we conclude that the best light absorption value ofA.obtusilobais 0.154 5.

Anemoneobtusiloba; anthocyanin; optimization; response surface method

Liu Zuo-jun E-mail:zuojunl@lut.cn

10.11829/j.issn.1001-0629.2016-0062

2016-01-26 接受日期：2016-06-14

國家自然科學(xué)基金(30960066)

藍(lán)雯琳(1991-)，女，遼寧大連人，在讀碩士生，主要從事植物生態(tài)學(xué)方面研究。E-mail:782077100@qq.com

劉左軍(1957-)，男，陜西三原人，教授，博士，主要從事生態(tài)學(xué)研究。E-mail:zuojunl@lut.cn

S789.9

A

1001-0629(2017)1-0186-08*

藍(lán)雯琳,劉左軍,劉志鵬.響應(yīng)面法優(yōu)化鈍裂銀蓮花花色素提取工藝.草業(yè)科學(xué),2017,34(1)：186-193.

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