房顫射頻消融術(shù)前后血漿miR-328表達(dá)變化及臨床意義

李 冰, 盧 慧

(1. 大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 檢驗(yàn)科，遼寧 大連 116011; 2. 大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 心血管檢查科，遼寧 大連 116011)

論 著

房顫射頻消融術(shù)前后血漿miR-328表達(dá)變化及臨床意義

李 冰1, 盧 慧2

(1. 大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 檢驗(yàn)科，遼寧 大連 116011; 2. 大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 心血管檢查科，遼寧 大連 116011)

目的 探討血漿miR-328在不同類型房顫患者的射頻消融術(shù)前后的表達(dá)變化,為進(jìn)一步探討房顫發(fā)病機(jī)制提供新方向。方法 選取從2015年3月至2016年1月期間在大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院行射頻消融術(shù)的心房顫動(dòng)患者60例作為房顫組，選擇同期大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院體檢中心的健康體檢者20例作為正常對(duì)照組。使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)正常對(duì)照組及不同類型房顫組手術(shù)前后血漿miR-328表達(dá)水平的變化。結(jié)果 房顫組血漿miR-328同對(duì)照組比較表達(dá)上升。血漿miR-328在房顫組射頻消融術(shù)前后相對(duì)表達(dá)量分別為2.04±0.31和1.12±0.06，術(shù)后同術(shù)前比較表達(dá)下降，差異均有顯著性意義，P<0.05;血漿miR-328在陣發(fā)性房顫、持續(xù)性房顫和永久性房顫中相對(duì)表達(dá)量分別為1.85±0.23、2.13±0.36和2.72±0.93，表達(dá)逐漸升高，組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05。結(jié)論 miR-328同房顫病情發(fā)展密切相關(guān)，可能參與調(diào)控房顫的發(fā)病機(jī)制。

miR-328；心房顫動(dòng)；導(dǎo)管消融術(shù)

心房顫動(dòng)，簡(jiǎn)稱房顫(atrial fibrillation, AF)，是臨床心內(nèi)科最為常見的心律失常疾病之一，隨著人均期許壽命的延長(zhǎng)，房顫的發(fā)病率不斷增加[1]。房顫的危害嚴(yán)重，最大程度降低病死率、致殘率，延長(zhǎng)房顫患者生命，提高患者生活質(zhì)量成為房顫治療的最終目標(biāo)。目前房顫發(fā)病機(jī)制尚未明確，因此在房顫治療和預(yù)后方面難以取得突破。近年來，房顫發(fā)病機(jī)制逐漸成為房顫乃至心律失常領(lǐng)域的熱點(diǎn)。隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，房顫治療已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展，但是在房顫術(shù)后復(fù)發(fā)、療效評(píng)估和預(yù)后判斷方面仍面臨諸多問題，其根本原因是發(fā)病機(jī)制尚未明確。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)多種miRNAs調(diào)節(jié)心臟離子通道、鈣離子結(jié)合蛋白、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白以及其他相關(guān)基因。當(dāng)這些相關(guān)蛋白的基因突變、功能紊亂或表達(dá)失調(diào)都可以誘發(fā)和導(dǎo)致心臟電生理紊亂從而導(dǎo)致心律失常甚至房顫的發(fā)生[2]。近年來，miR-328在腫瘤、心血管疾病方面相關(guān)研究報(bào)道逐漸增多，動(dòng)物模型和心肌細(xì)胞中miR-328的表達(dá)變化同心血管疾病存在一定的關(guān)聯(lián)，miR-328在心律失常尤其是房顫方面的研究已成為熱點(diǎn)。本文通過檢測(cè)血漿miR-328在不同類型房顫患者射頻消融術(shù)前后的表達(dá)變化，擬為進(jìn)一步探討房顫發(fā)病機(jī)制提供新方向。

1 資料與方法

1.1 臨床標(biāo)本收集

選取從2015年3月到2016年1月期間在大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院入院并行射頻消融術(shù)的心房顫動(dòng)患者60例作為房顫組，平均年齡為(64.55±6.34)歲，男性34例，女性26例。其中陣發(fā)性、持續(xù)性和永久性房顫患者分別為26例、19例和15例。選擇同期在大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院體檢中心的健康體檢者20例作為正常對(duì)照組，平均年齡(63.78±5.35)歲，男性11例，女性9例。

房顫組排除標(biāo)準(zhǔn)：年齡>80歲,甲狀腺功能亢進(jìn),糖尿病,血壓控制不良者,左心室功能減低(LVEF<40%),嚴(yán)重冠狀動(dòng)脈疾病,肝、腎功能障礙，急慢性感染性疾病，心肌結(jié)構(gòu)性病變，伴有惡性腫瘤。本研究里，服用β受體阻滯劑、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑、血管緊張素受體抑制劑或是他汀類的患者不影響入選。健康對(duì)照組年齡、性別與房顫組無明顯差異，無明顯循環(huán)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、生殖泌尿系統(tǒng)疾病。本研究涉及的被測(cè)試者都已告知了研究目的，并簽署了知情同意書。房顫術(shù)后1個(gè)月患者均無明顯心悸、氣短及胸部不適等癥狀并經(jīng)24 h動(dòng)態(tài)心電圖檢查均未發(fā)現(xiàn)房顫現(xiàn)象。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

房顫患者行射頻消融術(shù)前和術(shù)后1個(gè)月,正常對(duì)照組體檢時(shí)，分別抽取外周靜脈血3 mL，分別置于EDTA抗凝管中，4 h內(nèi)分離血漿，1500 r/min，離心15 min，吸取上清液放于經(jīng)高壓過的EP管中，并儲(chǔ)存在-80 ℃冰箱備用。

利用德國(guó)凱杰公司RNA提取試劑盒提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量PCR,反應(yīng)條件：95 ℃ 6 min;95 ℃ 12 s,62 ℃ 40 s,組內(nèi)重復(fù)3次取平均值，以Ct值表示，miR-328的相對(duì)表達(dá)量用2-ΔΔCt表示。引物序列如下： HmiR-328-FO，TGGTACTGCTGGCCCTCTCT； HmiR-328-RE，TATGGTTGTTCACGACTCCTTCAC；H-U6-FO，ATTGGAACGATACAGAGAAGATT；H-U6-RE，GGAAC-GCTTCACGAATTTG。

將實(shí)驗(yàn)結(jié)果中對(duì)照組表達(dá)量測(cè)定設(shè)定為1.00±0.00，其他各組數(shù)據(jù)與對(duì)照組數(shù)據(jù)比較，得到相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

房顫組血漿miR-328在射頻消融術(shù)前后相對(duì)表達(dá)量分別為2.04±0.31和1.12±0.06，術(shù)前表達(dá)上升，同對(duì)照組比較差異顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05。而術(shù)后則表達(dá)明顯下降。同術(shù)前比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

血漿miR-328在陣發(fā)性房顫、持續(xù)性房顫和永久性房顫中相對(duì)表達(dá)量分別為1.85±0.23、2.13±0.36和2.72±0.93 ，同對(duì)照組相比均表達(dá)上升；而且表達(dá)量逐漸增加，組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05。術(shù)后血漿miR-328相對(duì)表達(dá)量同對(duì)照組比較以及不同類型房顫組相比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P>0.05。見表1。

表1 血漿miR-328在不同類型房顫患者射頻消融術(shù)前后表達(dá)量比較

Tab 1 Comparison of plasma miR-328 expression in patients with different types of atrial fibrillation before and after radiofrequency catheter ablation

對(duì)照組(n=20)陣發(fā)性房顫組(n=26)持續(xù)性房顫組(n=19)永久性房顫組(n=15)術(shù)前1.00±0.001.85±0.231)2.13±0.361)2)2.72±0.931)2)3)術(shù)后1.00±0.001.07±0.091.22±0.071.09±0.03

1)與對(duì)照組比較，P<0.05；2)與陣發(fā)性房顫組比較，P<0.05；3)與陣發(fā)性房顫和持續(xù)性房顫組比較，P<0.05

3 討 論

近年來，研究發(fā)現(xiàn)許多miRNA與心房顫動(dòng)的發(fā)生發(fā)展關(guān)系十分密切，還有一些根據(jù)其作用的靶基因可以推測(cè)其可能具有調(diào)節(jié)房顫的潛在作用和功能?，F(xiàn)有研究已經(jīng)證實(shí)，miRNA表達(dá)變化是深入研究房顫發(fā)生機(jī)制的一個(gè)潛在領(lǐng)域[3]。近幾年有文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iRNA能夠穩(wěn)定存在于人體各種體液中，有可能參與房顫發(fā)生發(fā)展，此外，在指導(dǎo)用藥和選擇治療方式以及判斷疾病的療效和復(fù)發(fā)方面也發(fā)揮重要作用[4]。

miRNA是對(duì)一類長(zhǎng)度為18～25個(gè)核苷酸的小RNA的總稱，這種RNA不能進(jìn)行編碼，但可與靶基因上的mRNA 3' UTR區(qū)的互補(bǔ)位置進(jìn)行結(jié)合，使靶基因降解或失活，從而對(duì)靶基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控,是目前所知的重要的基因表達(dá)負(fù)調(diào)控機(jī)制之一。miRNA對(duì)腫瘤疾病、心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、血液系統(tǒng)疾病、各種傳染病、細(xì)胞的增殖與分化，以及個(gè)體的生長(zhǎng)發(fā)育等都會(huì)起到調(diào)控作用[5]。在心血管系統(tǒng)疾病的研究中發(fā)現(xiàn)，miRNA可參與心血管細(xì)胞的發(fā)育和增殖以及病理生理狀態(tài)等各種情況的調(diào)控，可能會(huì)為基因治療相關(guān)疾病提供依據(jù)[6]。

本研究中，房顫患者miR-328表達(dá)同地照組比較明顯升高，房顫組射頻消融術(shù)后同術(shù)前比較miR-328相對(duì)表達(dá)量下降。miR-328在心房顫動(dòng)時(shí)普遍表達(dá)上調(diào)，首先由Lu[7]等驗(yàn)證，他們通過microRNAs表達(dá)譜芯片的方法篩查，發(fā)現(xiàn)在因快速起搏而導(dǎo)致犬房顫的實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)到miR-328水平升高了3.7倍；在風(fēng)心病合并房顫的患者中表達(dá)升高了 3.5倍(而miR-1變化不明顯)；而攜帶miR-328的腺病毒轉(zhuǎn)染鼠房顫易感性增高，相反，miR-328的缺失可以降低鼠房顫的易感性[8]。目前發(fā)現(xiàn)，miR-328對(duì)L型鈣通道表達(dá)的抑制是房顫發(fā)生的一個(gè)機(jī)制，且這個(gè)機(jī)制獨(dú)立存在就可以導(dǎo)致房顫的發(fā)生。通過蛋白印跡等實(shí)驗(yàn)手段可以證實(shí)：CACNA1(編碼 L 型鈣通道蛋白α1c 亞基)和 CACNB1(編碼 L 型鈣通道蛋白β1亞基)是 miR-328 的靶基因[9]。由此可以推斷miR-328的表達(dá)水平上升可使L型鈣通道在細(xì)胞中數(shù)量減少，使心房肌動(dòng)作電位平臺(tái)期和有效不應(yīng)期縮短，容易發(fā)生折返，從而引發(fā)房顫。Caveolin-3是一種肌組織特異性成分，可以參與調(diào)節(jié)心肌組織多種離子通道的功能。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-328可能通過抑制Caveolin-3的表達(dá)，改變離子通道，參與電重構(gòu)，引起房顫發(fā)生[10]。本研究中，隨著房顫患者病情的發(fā)展，血漿miR-328表達(dá)逐漸升高，說明miR-328與房顫患者病情發(fā)展密切相關(guān)。由此可見，miR-328可能參與調(diào)控房顫的發(fā)病機(jī)制，為進(jìn)一步研究房顫發(fā)病機(jī)制以及早期診斷和預(yù)后判斷提供了新的發(fā)展方向。

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Plasma miR-328 expression changes and clinical significance in patients with atrial fibrillation before and after radiofrequency ablation

LI Bing1, LU Hui2

(1.ClinicalLaboratory,theFirstAffiliatedHospitalofDalianMedicalUniversity,Dalian116011,China; 2.CardiovascularInspectionSection,theFirstAffiliatedHospitalofDalianMedicalUniversity,Dalian116011,China)

Objective To investigate the changes of plasma miR-328 expression levels before and after radiofrequency ablation(RFA) and its correlation with different clinical atrial fibrillation(AF) types and explore the pathogenesis of atrial fibrillation. Methods The plasma miR-328 expression levels were detected in 60 AF patients before and after RFA and 20 healthy PE subjects using real-time fluorescence quantification PCR technique. Results The plasma miR-328 level in atrial fibrillation group was higher than that in control group. The relative expression levels of plasma miR-328 in the AF group before RFA (2.04±0.31) was higher than that after RFA (1.12±0.06),P<0.05. The relative expression levels of plasma miR-328 were 1.85±0.23, 2.13±0.36 and 2.72±0.93 in paroxysmal AF, persistent AF and permanent AF, respectively (P<0.05). Conclusion The plasma miR-328 expression level are associated with AF progression, which would be a prognosis marker of AF treatment.

miR-328; atrial fibrillation (AF); catheter ablation

李 冰(1982-)，男，主管技師。E-mail：libingwork@163.com

盧 慧，主治醫(yī)師。E-mail:luhuiwork@163.com

10.11724/jdmu.2017.01.05

R446.6

A

1671-7295(2017)01-0023-03

李冰，盧慧.房顫射頻消融術(shù)前后血漿miR-328表達(dá)變化及臨床意義[J].大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2017,39(1)：23-25.

2016-12-02;

2016-12-29)