TN14003體外阻斷SDF-1/CXCR4信號通路對骨關(guān)節(jié)炎患者軟骨組織分泌基質(zhì)金屬蛋白酶3、9、13水平的影響

李龍滕 李彥林 王坤 閆祥甲 肖渝 賈笛 王國梁

昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院運(yùn)動醫(yī)學(xué)科（云南 昆明 650032）

TN14003體外阻斷SDF-1/CXCR4信號通路對骨關(guān)節(jié)炎患者軟骨組織分泌基質(zhì)金屬蛋白酶3、9、13水平的影響

李龍滕 李彥林 王坤 閆祥甲 肖渝 賈笛 王國梁

昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院運(yùn)動醫(yī)學(xué)科（云南 昆明 650032）

目的：探討TN14003體外阻斷基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1/趨化因子受體-4（SDF-1/CXCR4）信號通路對骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）患者軟骨組織分泌基質(zhì)金屬蛋白酶3、9、13（MMP-3、MMP-9、MMP-13）水平的影響，明確TN14003的作用機(jī)理和阻斷效果。方法：對6例OA患者行膝關(guān)節(jié)置換術(shù)中采集透明軟骨，切成3×3×3 mm3大小的軟骨組織塊（共140塊），平均分為A、B、C、D四組進(jìn)行體外培養(yǎng)，A、B、C三組分別加入TN14003、T140、AMD3100（使其在培養(yǎng)液中的最終濃度為1000 nmol/L），D組為空白對照組，四組培養(yǎng)液中均加入相同劑量SDF-1使其最終濃度為100 ng/ml，分別培養(yǎng)2、4、6、8、10天后取各組組織塊培養(yǎng)液，采用ELISA檢測培養(yǎng)液中MMP-3、MMP-9、MMP-13的含量。結(jié)果：相同時(shí)間點(diǎn)，MMP-3、MMP-9、MMP-13的分泌量A組低于B組（P＜0.05），B組低于C組（P＜0.05），C組低于D組（P＜0.05）；同一組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)，MMP-3、MMP-13的分泌量隨時(shí)間而呈現(xiàn)總體降低趨勢（P＜0.05），MMP-9的分泌量隨時(shí)間而呈現(xiàn)升高趨勢（P＜0.05）。結(jié)論：TN14003、T140、AMD3100均可阻斷SDF-1/CXCR4信號通路，減低MMP-3、MMP-9、MMP-13的分泌，尤其以TN14003阻斷效果最為確切。

SDF-1/CXCR4；基質(zhì)金屬蛋白酶；骨關(guān)節(jié)炎；TN14003

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是多種原因?qū)е碌穆曰りP(guān)節(jié)疾病，以關(guān)節(jié)疼痛和活動受限為主要臨床表現(xiàn)；OA的發(fā)生、發(fā)展常伴隨著軟骨細(xì)胞的凋亡和軟骨組織的破壞。我們前期研究發(fā)現(xiàn)[1-3]：基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1/趨化因子受體-4（stromal cell derived factor-1/CXC chemokine receptor 4，SDF-1/CXCR4）信號通路的激活在OA發(fā)生、發(fā)展過程中起到重要作用，該信號通路的特異阻滯劑（AMD3100和T140）可抑制基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMP）3，9，13的表達(dá)，延緩OA關(guān)節(jié)軟骨的退變，但由于AMD3100的毒副作用和T140的血清不穩(wěn)定性，限制了臨床的應(yīng)用，而TN14003作為T140的衍生物，具有比T140更好的血清穩(wěn)定性及更小的細(xì)胞毒性，其臨床應(yīng)用前景廣泛[4]。本實(shí)驗(yàn)探索TN14003對骨關(guān)節(jié)炎軟骨組織分泌MMP-3、MMP-9、MMP-13水平的影響，為臨床尋找治療骨關(guān)節(jié)炎的分子靶向藥物提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

本實(shí)驗(yàn)在昆明醫(yī)科大學(xué)工程研究中心完成。

1.1 主要試劑、儀器

SDF-1（peprotech公司，美國），T140、TN4003（中科亞光公司，中國），AMD3100（peprotech公司，美國），MMP-3試劑盒（Rebiotech），MMP-9、MMP-13試劑盒（R&D），高速冷凍離心機(jī)（eppeadorf 5415R），多功能酶標(biāo)儀（BIOTEK Synergy2），恒溫箱（THZ-032 SHAKER）。

1.2 培養(yǎng)液的制備

先以高糖DMEM培養(yǎng)液445 ml、胎牛血清50 ml、青霉素+鏈霉素混合溶液5 ml配制成10%的胎牛血清，調(diào)整pH值至7.3～7.4，0.22 μm微孔過濾器過濾除菌并分裝在50 ml無菌管中，4℃冰箱密封保存。

1.3 藥物配制

TN14003、T140、AMD3100原裝1 mg瓶裝固體粉末，SDF-1原裝10 μg瓶裝固體粉末從-20℃冰箱中取出，室溫下復(fù)溫，加入適量經(jīng)高溫滅菌的三蒸水充分溶解使TN1400、T140、AMD3100溶液濃度分別為0.25 mg/ml、0.25 mg/ml、0.1 mg/ml，SDF-1溶液濃度為10 μg/ml，然后按需要量分裝，-20℃冰箱中保存。

1.4 標(biāo)本獲取及培養(yǎng)

組織標(biāo)本均來自于昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，在征得患者及家屬同意后，分批次取6例確診為骨關(guān)節(jié)炎（排外其他關(guān)節(jié)疾?。┒邢リP(guān)節(jié)置換的股骨髁軟骨組織塊，在手術(shù)室無菌條件下將軟骨組織塊切成3× 3×3 mm3大小的軟骨組織塊（共140塊），放在含有1%青霉素+鏈霉素混合溶液的DMEM液中，迅速轉(zhuǎn)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，在超凈工作臺上經(jīng)PBS液充分洗滌去除血液及雜質(zhì)后將軟骨組織塊放在含10%胎牛血清和1%青霉素+鏈霉素混合溶液的DMEM液（3 ml）的6孔板里，37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱里培養(yǎng)3天，然后隨機(jī)將軟骨組織塊（共140塊）分為A、B、C、D四組，每組35塊，放在24孔板里，每孔7塊軟骨組織塊，每孔加入10%胎牛血清和1%青霉素+鏈霉素混合溶液的DMEM液（1ml），四組均加入10 μl濃度為10 μg/ml SDF-1溶液，A組加入8.1 μl濃度為0.25 mg/ml的TN14003溶液，B組加入8.1 μl濃度為0.25 mg/ml的T140溶液，C組加入5 μl濃度為0.1 mg/ml的AMD3100溶液，使A、B、C三組培養(yǎng)液中TN14003、T140、AMD3100的最終濃度為1000 nmol/L，37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱里培養(yǎng)（每2天換液一次），各組于培養(yǎng)第2、4、6、8、10天分別采集各組組織塊的培養(yǎng)液放置在-80℃的超低溫冰箱里，待全部培養(yǎng)液收集完畢后統(tǒng)一進(jìn)行ELISA檢測。

1.5 ELISA檢測培養(yǎng)液中MMP-3、MMP-9、MMP-13的含量

待收集全所有各組軟骨組織塊培養(yǎng)液（n=6）后，從超低溫冰箱取出，室溫下解凍，采用雙抗體夾心ELISA檢測各組培養(yǎng)液中的MMP-3、MMP-9、MMP-13的含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間對比采用重復(fù)資料的方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

相同時(shí)間點(diǎn)各組MMP-3、MMP-9、MMP-13的含量A組低于B組（P＜0.05），B組低于C組（P＜0.05），C組低于D組（P＜0.05），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且MMP-3的含量較高。同一組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)，MMP-3的含量隨時(shí)間延長而呈現(xiàn)降低趨勢，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；MMP-9的含量隨時(shí)間而呈現(xiàn)逐漸升高趨勢，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；MMP-13的含量在培養(yǎng)的前4天呈現(xiàn)逐漸升高，之后又緩慢降低的趨勢，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組MMP-3、MMP-9、MMP-13含量（ng/ml）（各組均n=6）

3 討論

3.1 MMPs在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病中的作用

骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨的退變主要通過兩條途徑而發(fā)揮作用[5，6]：一是軟骨細(xì)胞自身的退變，OA患者軟骨組織中可發(fā)現(xiàn)較多凋亡的軟骨細(xì)胞，且軟骨細(xì)胞的凋亡與軟骨的退變密切相連。二是通過侵蝕性炎性細(xì)胞、血管翳、炎性關(guān)節(jié)液中的各種酶等因素導(dǎo)致的細(xì)胞外基質(zhì)的破壞，尤其以MMPs對軟骨的破壞最為重要。MMPs為一種Zn+2依賴的蛋白酶超家族，可降解細(xì)胞外除多糖外的所有基質(zhì)[7]。且有研究證實(shí)[6]：軟骨細(xì)胞外基質(zhì)在細(xì)胞存活中起到關(guān)鍵作用，在OA病理進(jìn)程中MMPs可直接和間接促進(jìn)軟骨細(xì)胞的凋亡。而軟骨細(xì)胞的退變必然使得細(xì)胞外基質(zhì)合成減少，加速關(guān)節(jié)軟骨的退變。故本研究采用對OA關(guān)節(jié)軟骨退變發(fā)揮關(guān)鍵作用的MMP-3、MMP-9、MMP-13進(jìn)行研究，進(jìn)一步明確MMPs在OA關(guān)節(jié)軟骨退變中的作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：OA關(guān)節(jié)軟骨體外培養(yǎng)液中均有MMP-3、MMP-9、MMP-13分泌，且以MMP-3的分泌量最高，故我們認(rèn)為MMP-3可能是導(dǎo)致OA關(guān)節(jié)軟骨退變的主要細(xì)胞因子之一。

3.2 SDF-1/CXCR4信號通路在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病中的作用

目前研究發(fā)現(xiàn)OA患者血漿和關(guān)節(jié)液中SDF-1的含量較正常人明顯增高，且其含量與骨關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度成正相關(guān)[8]；SDF-1受體有CXCR-4和CXCR-7，人關(guān)節(jié)軟骨和成纖維樣滑膜細(xì)胞中均有大量的CXCR4和CXCR7的表達(dá)[9，10]。在基因水平敲減CXCR4基因后，CXCR4的mRNA的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平受到抑制，MMP-13的表達(dá)水平降低，同時(shí)抗CXCR4抗體可以減少培養(yǎng)液中MMP-13的含量[11]。SDF-1α與其受體結(jié)合后可導(dǎo)致人軟骨細(xì)胞AP-1復(fù)合物（c-Fos和c-Jun）及其mRNA表達(dá)水平上調(diào)和AP-1復(fù)合物的激活，最終使得MMP-13表達(dá)增加，從而導(dǎo)致Ⅱ型膠原蛋白的降解，促使關(guān)節(jié)軟骨的破壞；而通過抑制AP-1復(fù)合物與MMP-13基因啟動子的AP-1結(jié)合位點(diǎn)（-50～-44bp）結(jié)合，從而降低SDF-1α導(dǎo)致的關(guān)節(jié)軟骨的破壞[6]。我們課題組前期研究發(fā)現(xiàn)SDF-1/CXCR4信號通路的活化可促進(jìn)MMP-3、MMP-9、MMP-13的合成和分泌，通過該信號通路抑制劑（AMD3100、T140）可以抑制MMP-3、MMP-9、MMP-13的合成和分泌，延緩骨關(guān)節(jié)炎的病理進(jìn)程?？梢?，探索阻斷SDF-1/CXCR4信號通路的靶向藥物有利于找到治療OA的新途徑。

3.3 TN14003阻斷SDF-1/CXCR4信號通路對OA軟骨組織分泌MMP-3、MMP-9、MMP-13的作用

AMD3100作為SDF-1/CXCR4信號通路的部分阻滯劑，主要通過與CXCR4的第二胞外環(huán)狀區(qū)結(jié)合，特異性阻斷CXCR4與其配體結(jié)合，其阻斷效果不完全。T140是一種由14氨基酸殘基組成的小分子肽，為CXCR4的反向抑制劑，相對于AMD3100，T140對SDF-1/CXCR4信號通路具有更強(qiáng)的阻斷效應(yīng)，但由于T140在血清中其羧基端的Arg容易被降解，血清穩(wěn)定性差，因此本實(shí)驗(yàn)采用T140衍生物TN14003，與T140相比，TN14003具有更好的血清穩(wěn)定性及低細(xì)胞毒性[12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在OA關(guān)節(jié)軟骨組織體外實(shí)驗(yàn)中，TN14003在阻斷SDF-1/CXCR4信號通路導(dǎo)致的OA軟骨組織分泌MMP-3、MMP-9、MMP-13釋放方面有著明顯的優(yōu)勢，其阻斷效應(yīng)比T140和AMD3100更強(qiáng)。MMP-3在OA關(guān)節(jié)軟骨組織體外培養(yǎng)液中呈現(xiàn)高分泌狀態(tài)，通過抑制SDF-1/CXCR4信號通路可以降低MMP-3的分泌，尤其以TN14003的抑制作用最強(qiáng)；且隨著體外培養(yǎng)時(shí)間的延長，A、B、C、D四組中MMP-3的分泌量呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢，我們推測其原因?yàn)椋浩湟唬w外軟骨細(xì)胞培養(yǎng)過程中，軟骨細(xì)胞隨著時(shí)間延長會出現(xiàn)軟骨細(xì)胞去分化[13]，其合成與分泌功能將會下降；其二，我們所選擇的均是老年OA中、晚期行全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)的樣本，其關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的功能明顯降低，各種蛋白的合成和分泌功能均下調(diào)。MMP-9在OA關(guān)節(jié)軟骨體外培養(yǎng)液中分泌量相當(dāng)少，且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長其分泌量呈現(xiàn)逐漸升高趨勢，其原因我們認(rèn)為：SDF-1/CXCR4信號通路可能不是MMP-9合成和分泌的最主要的信號通路，MMP-9的合成和分泌另有其他信號通路或者細(xì)胞因子的參與。MMP-13在OA關(guān)節(jié)軟骨體外培養(yǎng)液中呈現(xiàn)一定量的分泌，通過抑制SDF-1/CXCR4信號通路可以降低MMP-13的表達(dá)，且隨著體外培養(yǎng)時(shí)間的延長，A、B、C、D四組中MMP-13的表達(dá)量在體外培養(yǎng)的前4天內(nèi)有輕微上升的趨勢，之后呈現(xiàn)出緩慢降低的趨勢，其原因可能為我們所選取樣本均是來源于中、晚期OA行全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)者，而MMP-13主要在OA的早、中期表達(dá)，且隨著時(shí)間的延長，MMP-13的表達(dá)量逐漸降低[14]。許多學(xué)者認(rèn)為MMPs的各種亞型在OA病理進(jìn)程的各個時(shí)期呈現(xiàn)動態(tài)變化狀態(tài)，MMP-3主要在OA的早期和晚期增高明顯，MMP-9主要在OA的早期增高明顯，MMP-13在主要在OA的早、中期表達(dá)[14]。MMPs的各個亞型在OA不同時(shí)期表達(dá)的規(guī)律也很好地詮釋了本實(shí)驗(yàn)中MMPs表達(dá)隨時(shí)間變化呈現(xiàn)不同趨勢的結(jié)果。

綜上所述，SDF-1/CXCR4信號通路的活化可促進(jìn)OA軟骨細(xì)胞MMP-3、MMP-9、MMP-13的分泌，通過該信號通路抑制劑（TN14003、T140、AMD3100）可以抑制MMP-3、MMP-9、MMP-13的分泌，且TN14003在阻斷該信號通路降低MMP-3、MMP-9、MMP-13分泌方面具有更好的阻斷效果。

[1]李彥林，王國梁，曹斌，等.AMD3100體外阻斷基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1/趨化因子受體4信號通路對人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶3、9、13水平的影響.中國修復(fù)重建外科雜志，2012，26（6）：652-656.

[2]王坤，趙灃凱，李彥林，等.T140體內(nèi)靶向阻斷SDF-1/CXCR4信號通路對SDF-1及MMPs的影響.實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2015，35（1）：23-26.

[3]馬珂，李曉林，李彥林，等.T140體外阻斷SDF-1/CXCR4信號通路對人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞分泌MMP-3、MMP-9和MMP-13水平的影響.中國運(yùn)動醫(yī)學(xué)雜志，2013，32（9）：807-810.

[4]Burger M，Hartmann T，Krome M，et al.Small peptide inhibitors of the CXCR4 chemokine receptor（CD184）antagonize the activation，migration，and antiapoptotic responses ofCXCL12inchroniclymphocyticleukemiaBcells. Blood，2005，106（5）：1824-1830.

[5]Yoshihara Y，Nakamura H，Obata K，et al.Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in synovial fluids from patients with rheumatoid arthritis or osteoarthritis.Ann Rheum Dis，2000，59（6）：455-461.

[6]Song J，Ahn C，Chun CH，et al.A long non-coding RNA，GAS5，plays a critical role in the regulation of miR-21 during osteoarthritis.J Orthop Res，2014，32（12）：1628-1635.

[7]圣小平，樊天佑.金屬蛋白酶在骨關(guān)節(jié)炎的基質(zhì)退變中的作用.中國骨腫瘤骨病，2009，8（1）：51-55.

[8]He W，Wang M，Wang Y，et al.Plasma and Synovial Fluid CXCL12 Levels Are Correlated With Disease Severity inPatientsWithKneeOsteoarthritis.JArthroplasty，2016，31（2）：373-377.

[9]Wei L，Kanbe K，Lee M，et al.Stimulation of chondrocyte hypertrophy by chemokine stromal cell-derived factor 1 in the chondro-osseous junction during endochondral bone formation.Dev Biol，2010，341（1）：236-245.

[10]Jones SW，Brockbank SM，Mobbs ML，et al.The orphan G-protein coupled receptor RDC1：evidence for a role in chondrocytehypertrophyandarticularcartilagematrix turnover.Osteoarthritis Cartilage，2006，14（6）：597-608.

[11]Wei F，Moore DC，Wei L，et al.Attenuation of osteoarthritis via blockade of the SDF-1/CXCR4 signaling pathway. Arthritis Res Ther，2012，14（4）：R177.

[12]Mori T，Doi R，Koizumi M，et al.CXCR4 antagonist inhibits stromal cell-derived factor 1-induced migration and invasion of human pancreatic cancer.Mol Cancer Ther，2004，3（1）：29-37.

[13]唐新，鄭果，黃強(qiáng)，等.人骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的體外培養(yǎng)及細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析.實(shí)用骨科雜志，2015，21（7）：614-618.

[14]吳宏斌，杜靖遠(yuǎn)，胡勇，等.兔前交叉韌帶切斷骨關(guān)節(jié)炎模型中MMP-1 MMP-13及TIMP-1的mRNA表達(dá)研究.中華風(fēng)濕病學(xué)雜志，2002，6（3）：169-173.

The Influence of Blocking SDF-1/CXCR4 Signaling Pathway with TN14003 In Vitro on the Levels of Matrix Metalloproteinases 3，9 and 13 in Osteoarthritis Cartilages

Li Longteng，Li Yanlin，Wang Kun，Yan Xiangjia，Xiao Yu，Jia Di，Wang Guoliang
The First Affiliated Hospital of Kunming Medical University，Kunming 650032，China Corresponding Author：Li Yanlin，Email：852387873@qq.com

ObjectiveTo explore the influence of blocking the stromal cells derived factor-1/CXC chemokine receptor 4（SDF-1/CXCR4）signaling pathway using TN14003 on matrix metalloproteinases（MMP）3，9 and 13 levels secreted from osteoarthritis（OA）cartilages，so as to clarify the mechanism and effect of TN14003.MethodsArticular cartilage specimens were obtained from 6 OA patients during the total knee arthroplasty（n=6），cut into 140 explants of 3×3×3 mm3and randomly divided into group A，B，C and D，each of 35.Explants in group A，B and C were incubated in the nutrient solution containing SDF-1（100 ng/ml）and TN14003，T140 and AMD3100（1000 nmol/L）respectively，while explants in group D were incubated in the nutrient solution with SDF-1（100 ng/ml）only.The culture medium was collected on the end of the 2nd，4th，6th，8th and 10th day to measure the levels of MMP-3，MMP-9 and MMP-13 using ELISA.ResultsAt the same time points，the average levels of MMP-3，MMP-9 and MMP-13 of group A were significantly lower than group B，those of group B significantly lower than group C，which was significantly lower than group D.In the same group，the average levels of MMP-3 and MMP-13 decreased（P＜0.05）gradually and that of MMP-9 increased gradually as（P＜0.05）the intervention went on.ConclusionsTN14003，T140 and AMD3100 all can decrease the secretion of MMP-3，MMP-9 and MMP-13 through blocking the SDF-1/CXCR4 signaling pathway，with TN14003 showing the best effect.

SDF-1/CXCR4，MMPs，Osteoarthritis，TN14003

2016.11.03

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（編號81460340）；云南省創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（編號2014HC018）；云南省醫(yī)療衛(wèi)生單位內(nèi)設(shè)研究機(jī)構(gòu)項(xiàng)目（編號2014NS161）

李彥林，Email：852387873@qq.com