鮑曼不動桿菌組鑒定方法的研究進展

陳浩俊 綜述 李從榮 審校

(武漢大學人民醫(yī)院檢驗科，湖北 武漢 430060)

鮑曼不動桿菌組鑒定方法的研究進展

陳浩俊 綜述 李從榮 審校

(武漢大學人民醫(yī)院檢驗科，湖北 武漢 430060)

鮑曼不動桿菌、pittii不動桿菌和nosocomialis不動桿菌統(tǒng)稱為鮑曼不動桿菌組。由于表型相近，臨床商品化方法并不能有效地鑒定它們。而準確地鑒定該菌種對臨床診斷、治療、預后相當重要。本文就現(xiàn)有的核酸分子生物學、蛋白分子生物學和免疫學等鑒定方法進行綜述，結果表明分子遺傳學方法對鮑曼不動桿菌組的準確鑒定很有必要。

鮑曼不動桿菌；鑒定；分子生物學；免疫學；基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜

鮑曼不動桿菌(Acinetobacter baumannii)近三十年作為嚴重的醫(yī)院感染病原體在全球流行。由于它擁有一系列復雜的耐藥機制和頑強的生存能力，使之具備潛在的播散能力[1]。據(jù)2005-2014年間中國細菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)數(shù)據(jù)[2]，臨床分離出鮑曼不動桿菌呈上升趨勢。當前，不動桿菌屬已擁有23種被命名和11種未被命名的菌種，但是將其鑒定到種的水平仍然難以把握，特別是某些基因相近的不動桿菌，如：鮑曼不動桿菌、nosocomialis不動桿菌和pittii不動桿菌[統(tǒng)稱為鮑曼不動桿菌組(Acb)]；另一方面，準確地鑒定菌種對臨床診斷、治療、預后相當重要[3]。本文從核酸分子生物學方法，免疫學方法，以及近年來開展的基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry,MALDI TOF MS)等方法進行綜述。

1 PCR擴增法

2006年Turton等[4]首次報道了blaOXA-51基因可作為鑒定鮑曼不動桿菌特有的標志，同時他們還發(fā)現(xiàn)這類鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類抗生素敏感性存在差異。可能的原因是blaOXA-51基因的表達受控于上游的ISAba1插入序列，這種插入序列作為啟動子控制鄰旁的基因轉錄[5]。然而即便擁有ISAba1-blaOXA-51基因也并非是鮑曼不動桿菌產生大量碳青霉烯酶的充分條件[6]，可能是由于基因轉錄水平過低不能完全水解產物?；赽laOXA-51基因的特異性，利用PCR擴增產物就成為快速鑒定鮑曼不動桿菌的首選方法，然而以此為標準會出現(xiàn)假陰性的錯誤。

一方面，Zander等[7]利用PCR檢測OXA-51，結果顯示blaOXA-51擴增產物均大于353 bp片段，按照以往經(jīng)驗提示這些非鮑曼不動桿菌。然而基于gyrB的三重PCR和rpoB基因測序驗證了均為鮑曼不動桿菌，且有一段序列插入到blaOXA-51基因中。另一方面，臺灣的一個研究小組在blaOXA-51-like方面做了一系列深入的研究。2009年Lee等[8]首次提出nosocomialis不動桿菌質粒上也存在blaOXA-51基因。相較于染色體，質粒攜帶的ISAba1-blaOXA-51-like基因對碳青霉烯類抗生素高度耐藥，猜測可能與質粒在菌株里大量自我復制有關[9]。近來Lee等[10]又在nosocomialis不動桿菌和極其相似菌株中檢測到blaOXA-511-like基因的存在?？梢奲laOXA-51-like基因能在鮑曼不動桿菌及其基因相近菌種間播散，從而發(fā)生水平基因轉移。因此，在使用PCR擴增blaOXA-51基因鑒定鮑曼不動桿菌時，需要警惕插入序列的破壞以及nosocomialis不動桿菌和pittii不動桿菌的存在對試驗的干擾。

2 限制酶切法

2.1 核糖分型 核糖分型是一種基于Southern印跡雜交的方法。所有細菌含有各自獨特的rRNA，相當于人的“指紋”。利用這個技術，首先得用特定的限制性內切酶切除細菌的特定位點，將切除的片段進行凝膠電泳并轉運出細胞膜，通過16s或者23s rRNA探針對其片段雜交比對[11]。大多數(shù)細菌的核糖分型圖像存在特異性，因此這種方法能鑒定很多細菌。Gerner-Smidt等[12]最先利用EcoRⅠ、ClaⅠ和AscⅠ限制性酶切Acb rRNA，同時一段反轉錄核苷酸片段探針與之雜交，成功地鑒定了Acb。目前商品化核糖分型檢測系統(tǒng)已被投入使用來鑒定沙門氏菌和大腸埃希菌。然而核糖分型也存在一些缺點，如果rRNA片段較短，那么會出現(xiàn)假陰性的結果。同時相較于目前分子分型較為流行的脈沖場凝膠電泳(pulsed field gel electrophoresis，PFGE)，核糖分型顯得缺乏足夠的分辨率。因此，目前核糖分型漸漸地被PFGE所替代。

2.2 PFGE 盡管基于PCR的方法很常用，但是PFGE仍是細菌分子分型的“金標準”[13]。PFGE的原理大致與核糖分型相似，卻優(yōu)于后者，常用的技術是對夾同源電場電泳技術。相較于核糖分型，PFGE通過特定的限制性內切酶定位細菌基因組核苷酸位點，然后將切除的DNA片段脈沖電泳，利用計算機成像系統(tǒng)對結果解釋。在這個系統(tǒng)里，對PFGE結果影響最大的就是限制性內切酶。在以往的研究中，常用ApaⅠ和SmaⅠ限制酶[14-15]，這兩種限制性內切酶的選擇對試驗結果的影響不大。但隨著PFGE技術的發(fā)展，有學者提出一些罕見高效的限制酶，如AscⅠ和AsiSⅠ。從實驗耗材、分辨率、室間可比性的角度評比，Chang等[16]發(fā)現(xiàn)AscⅠ可作為鮑曼不動桿菌分子分型的首選限制性內切酶。另外，脈沖電泳參數(shù)設置也同樣影響著PFGE結果[17]。PFGE作為細菌分子分型的“金標準”，最大的優(yōu)勢就是該技術具有巨大的分辨率，能對絕大多數(shù)病原微生物分子分型，包括Acb菌株，從而有效的控制醫(yī)源性微生物感染的爆發(fā)。然而缺點也很明顯，由于沒有統(tǒng)一的操作標準和解釋標準，運用PFGE技術監(jiān)測微生物流行病學的實驗室大多是建立自己的標準。因此，室間比對困難。而且PFGE耗時達2～4 d時間，不利于臨床微生物實驗室及時提供克隆菌株流行的證據(jù)。盡管Durmaz等[18]對PFGE出結果時間控制在28 h左右，然而技術人員的熟練程度和儀器設備的昂貴也是限制它發(fā)展的主要因素。而近年由于基因多樣性變化顯著，菌株間常發(fā)生水平基因轉移，相較于多位點序列分型(multilocus sequence typing，MLST)，PFGE可能在一定程度上分辨率弱于MLST[19]。

3 基因測序法

16S rRNA廣泛存在于所有細菌基因組中，序列長度大約1 550 bp，由保守區(qū)和變異區(qū)組成。同時由于它具有高度的保守性和特異性以及足夠長的基因序列，16S rRNA基因擴增測序是目前常用于細菌鑒定的方法[20]。然而堿基替換率緩慢，并非所有的不動桿菌的16S rRNA均存在多態(tài)性，特別是那些16 S rRNA保守序列相似的菌種。Nemec等[21]的研究結果顯示，Acb菌株間的16S rRNA基因相似度高達97%～98.1%，這意味著Acb菌株間可能呈現(xiàn)單態(tài)性現(xiàn)象。而在另一個研究中，Gundi等[22]發(fā)現(xiàn)通過ropB管家基因測序分辨率明顯高于16S rRNA測序結果。因此，在使用16S rRNA測序鑒定鮑曼不動桿菌時需謹慎，最好聯(lián)合其他分子生物學方法一起使用。表1總結了當前鮑曼不動桿菌菌株分子鑒定的常用方法。

表1 鮑曼不動桿菌分子鑒定方法

4 蛋白分子生物學方法

近年來，MALDITOF廣泛應用于臨床微生物快速鑒定[23]。各種類型微生物可被鑒定，包括細菌、真菌、病毒。相較于表型試驗，MALDI TOF快速可靠。相較于分子生物學試驗，MALDI TOF簡單經(jīng)濟[24]。該技術的鑒定原理是通過測試分析物的質量/變化比率，分析微生物內小蛋白分子質量，從而與數(shù)據(jù)庫內的質量波譜對比，得出比較可靠的結論。盡管數(shù)據(jù)庫如此巨大，也并不能包括所有微生物。相較于其他菌種，鏈球菌、非發(fā)酵革蘭陰性菌、厭氧菌等難區(qū)分。

當前可利用的MS有Bruker MS和Vitek MS兩種[25]，然而現(xiàn)有的技術想要區(qū)分Acb還存在一定的問題。在Vitek MS中，有體外診斷模式和科研模式，前者用于常規(guī)檢驗，系統(tǒng)內部本身是一個不可被修改的數(shù)據(jù)庫；而后者適用于科研，系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫可被修改。因此，有學者提出各種改進方法，使它能更好的適用于臨床和科研。Espinal等[26]通過完善數(shù)據(jù)庫，得到更好的鑒定結果。Sedo等[27]通過改變基質組份，大大的提高了鮑曼不動桿菌的信號。同樣的，Sousa等[28]將MALDI TOF和化學計量工具聯(lián)合，校正了鑒定Acb可能發(fā)生的錯誤。通過方法的改進，使得MALDI TOF在快速確證鮑曼不動桿菌的道路上更加完善。

5 免疫學

免疫學方法鑒定鮑曼不動桿菌鮮有被提及。目前集中討論的方向大多與細菌生物膜相關蛋白有關，而他們通常是細菌定植、耐藥、毒力的關鍵因素。通過鑒定這些生物膜蛋白，開啟鑒定鮑曼不動桿菌的新思路。Rahbar等[29]利用生物信息學工具設計了一段鮑曼不動桿菌的生物膜蛋白保守序列，基于抗原抗體反應的免疫學方法可以最大程度上降低鑒定的出錯率，然而免疫學法能否準確鑒定Acb，需要更多證據(jù)來評價其可靠性。

6 展 望

作為重要的醫(yī)院感染病原體，鮑曼不動桿菌的檢出率逐年上升。鑒于表型試驗并不能準確地鑒定鮑曼不動桿菌組，且它們的臨床意義、耐藥模式、治療方案均不相同。因此，本文系統(tǒng)地總結了鮑曼不動桿菌鑒定的各種類型的方法，并指出其優(yōu)缺點，將為今后的鮑曼不動桿菌研究工作提供一定幫助。

考慮到不同的國家和不同的流行區(qū)域，ISA-ba1-blaOXA-51-like基因在鮑曼不動桿菌中有一定差異，擴增blaOXA-51基因作為鑒定標準存在一定的局限性。相較于普通PCR，三重PCR能更好地鑒定鮑曼不動桿菌。由于核糖分型逐漸被PFGE所替代，目前也很少用于區(qū)分Acb。MALDI TOF作為新近方法，通過完善數(shù)據(jù)庫可以作為快速確證鮑曼不動桿菌的首選方法。免疫學的方法可能會是以后的一個發(fā)展方向，然而更多的研究需要去證實觀點。PFGE和MLST仍是值得信賴的分子分型方法。

總之，隨著一些新型鑒定思路的打開，更多快速高效的鑒定鮑曼不動桿菌的方法將被臨床微生物實驗室使用，這必將推動人們對鮑曼不動桿菌的重新認識。

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Research update on detection of Acinetobacter calcoaceticus-baumannii complex.

CHEN Hao-jun,LI Cong-rong. Department of Laboratory Medicine,Renmin Hospital of Wuhan University,Wuhan 430060,Hubei,CHINA

Acinetobacter baumannii belongs to the Acinetobacter calcoaceticus-baumannii(Acb)complex,which includes two other species:Acinetobacter nosocomialis and Acinetobacter pittii.Unfortunately,phenotypic tests commonly used in diagnostic laboratories are unable to differentiate species of the Acb.However,precise identification of Acb plays a significant role in clinical diagnosis,chemotherapy and prognosis.Therefore,this review based on molecular biological method and immunological method is to be discussed.In conclusion,it was suggested that molecular genetic methods were so indispensable for precise identification ofAcb.

Acinetobacter baumannii;Identification;Molecular biology;Immunology;Matrix-assisted laser desorption-ionization

R378

A

1003—6350（2017）01—0116—04

2016-04-24)

國家重點專科建設項目(編號：財社[2010]305)

李從榮。E-mail：congrongLi33@hotmail.com

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.01.036