1型鴨肝炎病毒RT-PCR快速檢測方法的建立

王永娟，朱善元，王安平，吳 雙，洪偉鳴，左偉勇

(江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院/江蘇省獸用生物制藥高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 泰州 225300)

1型鴨肝炎病毒RT-PCR快速檢測方法的建立

王永娟，朱善元，王安平，吳 雙，洪偉鳴，左偉勇*

(江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院/江蘇省獸用生物制藥高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 泰州 225300)

為建立快速檢測臨床1型鴨肝炎病毒(DHAV-1)感染的方法，根據(jù)DHAV-1的vp1基因序列設(shè)計(jì)1對引物，以DHAV-1及其他常見的感染鴨的病毒基因組為模板，建立了DHAV-1的特異性RT-PCR檢測方法；以10倍梯度稀釋的DHAV-1 RNA為模板，測定該方法的靈敏度；采集江蘇多地的疑似DHAV-1感染病料，提取基因組進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)測序鑒定后判斷所建立方法的檢測率。結(jié)果顯示，建立的方法可以特異性擴(kuò)增DHAV-1vp1基因保守區(qū)360 bp的序列，最低可檢測1 fg基因組模板，對臨床樣品檢測率為100%。表明，成功建立了特異性強(qiáng)、靈敏度高且可以用于臨床快速診斷DHAV-1感染的方法。

鴨； 1型鴨肝炎病毒； 反轉(zhuǎn)錄PCR； 檢測

1型鴨病毒性肝炎是由1型鴨肝炎病毒 (duck hepatitis virus type 1,DHAV-1)引起的一種以雛鴨肝臟為主要病理變化的急性高度致死性傳染病，死亡率可達(dá)90%以上，是危害養(yǎng)鴨業(yè)的主要傳染病之一，呈世界性分布[1]。該病毒于2004年被Tseng等[2]首次分離并確定，2006年Kim等[3]首次報(bào)道其全基因組序列，2012年其被國際病毒分類委員會(ICTV)列為小核糖核酸病毒科、禽肝炎病毒屬[4]。該病毒全基因組編碼2 249 個氨基酸，編碼蛋白質(zhì)順序?yàn)?′-UTR-VP0-VP3-VP1-2A1-2A2-2A3-2B-2C-3A-3B-3C-3D-3′[3]。vp1基因 ORF 由714 個堿基組成，編碼26.4 ku的VP1蛋白，為DHAV-1的結(jié)構(gòu)蛋白之一。任邵娜等[5]對12株DHAV-1臨床分離株的vp1基因進(jìn)行測序發(fā)現(xiàn)，不同毒株vp1基因的核苷酸序列同源性為99.2%～100%，保守性較高，可作為建立DHAV-1檢測方法的候選基因。

目前，臨床上檢測DHAV-1的方法有病毒分離鑒定[6]、病毒中和試驗(yàn)[7]、免疫電鏡[8]、ELISA[9-11]等。PCR檢測技術(shù)具有靈敏度高、簡便、快速、安全等特點(diǎn)，易于推廣；對標(biāo)本的純度要求較低，無需分離病毒即可檢測[12]，已在多種病毒的診斷檢測中被應(yīng)用，在鴨病毒性肝炎的檢測中也有報(bào)道，但均未研制成商品化試劑盒。為此，以病毒vp1基因?yàn)槟繕?biāo)基因，建立快速、敏感、廉價的RT-PCR檢測方法，以期在臨床上推廣應(yīng)用。

1 材料和方法

1.1 材料

1型鴨肝炎病毒、鴨瘟病毒、鴨坦布蘇病毒、番鴨細(xì)小病毒均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所饋贈，鴨呼腸孤病毒由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院惠贈，鴨低致病性禽流感病毒由揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院饋贈；9日齡SPF雞胚購自揚(yáng)州朝天歌農(nóng)牧科技有限公司。

主要試劑：dNTP、RNA酶抑制劑、DNA聚合酶、DNA Marker、病毒基因組提取試劑盒均購自TaKaRa公司；M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自BBI公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病毒擴(kuò)增 將DHAV-1原液用PBS緩沖液按照1︰10、1︰100、1︰1 000比例稀釋，尿囊腔無菌接種9日齡SPF雞胚，每個胚體接種0.1 mL。無菌收取接毒24～120 h死亡或未死亡的胚體，觀察病變情況。剪碎研磨后加適量PBS緩沖液制成勻漿，反復(fù)凍融3次后，5 000 r/min離心10 min吸取上清液，-80 ℃保存。

1.2.2 病毒基因組RNA提取 取收集的病毒液100 μL，按照病毒基因組提取試劑盒說明書進(jìn)行病毒基因組RNA提取，提取時未加入Carrier RNA。最后將病毒基因組RNA溶解于40 μL的無RNase酶 dH2O中，用分光光度儀測定病毒基因組RNA的純度與含量。

1.2.3 RT-PCR方法的建立 根據(jù)已發(fā)表的vp1基因序列(登錄號EU621879.1)設(shè)計(jì)1對引物，上游引物F：5′- GTTTGGGAGGCAATGGTT -3′，下游引物R:5′- ATTGAGTCCACATGAACAG -3′。設(shè)置25 μL反應(yīng)體系進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，包括反轉(zhuǎn)錄酶1 μL、dNTPs 2 μL、隨機(jī)引物2 μL、5×RT Buffer 5 μL、抑制劑0.5 μL和RNA模板14.5 μL，反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 10 min，42 ℃ 60 min，70 ℃ 10 min。

反應(yīng)體系為50 μL，包括cDNA產(chǎn)物5 μL,上、下游引物各1 μL，2×TaqMix酶25 μL，dH2O 18 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，52 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，25個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后取5 μL產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，并用凝膠成像系統(tǒng)拍照分析。同時設(shè)無RNA的空白對照組。

1.2.4 特異性測定 參照病毒基因組提取試劑盒說明書，分別提取1型鴨肝炎病毒、鴨瘟病毒、呼腸孤病毒、鴨坦布蘇病毒、番鴨細(xì)小病毒和鴨低致病性禽流感病毒基因組，按上述RT-PCR方法，分別以DHAV-1上、下游引物進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。

1.2.5 靈敏度測定 以提取的1 μL RNA為模板進(jìn)行10倍梯度稀釋，按照上述反轉(zhuǎn)錄及PCR程序進(jìn)行擴(kuò)增，然后取擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，并用凝膠成像系統(tǒng)拍照分析。

1.2.6 臨床樣品檢測 從江蘇省泰州、揚(yáng)州、射陽和徐州等地采集7份疑似DHAV-1感染的番鴨肝臟組織，分別取1 g左右，按照病毒基因組提取試劑盒說明書提取病毒基因組RNA,再按上述方法進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，設(shè)不加RNA的空白對照組及DHAV-1陽性對照組，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂凝膠電泳分析，特異性擴(kuò)增條帶切膠回收后，送上海英俊公司測序。

2 結(jié)果與分析

2.1 DHAV-1病毒擴(kuò)增結(jié)果

雞胚在接種DHAV-1后，于第2天開始出現(xiàn)死亡，至第5天時各稀釋度處理的雞胚全部死亡。取出胚體后發(fā)現(xiàn)，胚體體積明顯小于同日齡未接毒的雞胚，胚體水腫、肝臟及全身出血明顯。

2.2 DHAV-1 RT-PCR檢測方法的建立

提取DHAV-1病毒基因組RNA，分光光度計(jì)測得質(zhì)量濃度為10.9 ng/μL。病毒基因組經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，可見清晰條帶(圖1)，與預(yù)期360 bp目的片段相符。

M.100 bp DNA Ladder Marker； 1.空白對照； 2.DHAV-1圖1 DHAV-1的RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.3 DHAV-1 RT-PCR特異性檢測結(jié)果

在同等反應(yīng)條件下，應(yīng)用 DHAV-1上、下游引物對1型鴨肝炎病毒、鴨瘟病毒、鴨呼腸孤病毒、鴨坦布蘇病毒、番鴨細(xì)小病毒和鴨低致病性禽流感病毒基因組進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析(圖2)可見，除DHAV-1有特異性360 bp條帶外，其他病毒均未擴(kuò)增出任何條帶。

M.100 bp DNA Ladder Marker； 1—6分別為鴨瘟病毒、鴨呼腸孤病毒、 鴨坦布蘇病毒、番鴨細(xì)小病毒、鴨低致病性禽流感病毒、1型鴨肝炎病毒圖2 RT-PCR檢測DHAV-1的特異性擴(kuò)增結(jié)果

2.4 DHAV-1 RT-PCR靈敏度檢測結(jié)果

在同等反應(yīng)條件下，改變基因組RNA的劑量，以10.9 ng/μL的RNA 1 μL為起始劑量，10倍梯度稀釋，在10-7稀釋度之后，無特異性條帶擴(kuò)增(圖3)，對應(yīng) RNA約為1 fg。

M.100 bp DNA Ladder Marker； 1—10.109～100稀釋的DHAV-1圖3 RT-PCR檢測DHAV-1的靈敏度擴(kuò)增結(jié)果

2.5 臨床樣品DHAV-1 的RT-PCR檢測結(jié)果

用建立的方法檢測臨床采集的7份疑似病料，檢測結(jié)果如圖4所示，均在預(yù)期360 bp處有特異性擴(kuò)增，而空白對照組無擴(kuò)增，檢出率為100%。7個擴(kuò)增產(chǎn)物的測序結(jié)果與vp1基因序列(登錄號EU621879.1)同源性為100%。

M.100 bp DNA Ladder Marker； 1.空白對照； 2—8.臨床樣品； 9.陽性對照圖4 臨床樣品DHAV-1的 RT-PCR檢測結(jié)果

3 結(jié)論與討論

1型鴨肝炎病毒的初代分離一般使用鴨胚，經(jīng)鴨胚盲傳若干代后可形成雞胚適應(yīng)毒，可在9～11日齡雞胚或10～14日齡鴨胚中增殖，但是鴨胚接種的敏感性與病毒產(chǎn)生量明顯高于雞胚[13]。盡管如此，由于國內(nèi)SPF鴨胚的局限性，大多數(shù)試驗(yàn)仍然選擇SPF雞胚進(jìn)行病毒增殖。本試驗(yàn)將DHAV-1毒株經(jīng)尿囊腔接種9日齡雞胚，雞胚在24 h后出現(xiàn)死亡，到第5天時全部死亡，死亡率達(dá)100%，雞胚病變明顯；同時，以這些胚體毒的基因組為模板建立了RT-PCR檢測方法，證實(shí)了該病毒樣本接種雞胚的有效性。

VP1蛋白為DHAV-1的結(jié)構(gòu)蛋白之一，任邵娜等[5]的研究結(jié)果表明，DHAV-1臨床分離株的vp1基因序列同源性高達(dá)99.2%～100%，可作為建立檢測方法的候選基因。本研究通過DNAstar軟件分析了5條GenBank中已登錄的vp1基因序列(登錄號EU621879.1、EU621875.1、EU621876.1、EF151312.1、JQ316452.1)確定保守區(qū)域，同時，比對鴨瘟病毒、鴨呼腸孤病毒、鴨坦布蘇病毒、番鴨細(xì)小病毒和鴨低致病性禽流感病毒相關(guān)基因的序列，最終根據(jù)EU621879.1序列設(shè)計(jì)能夠特異性擴(kuò)增360 bp條帶的引物，建立RT-PCR檢測方法，以便普遍適用于臨床上DHAV-1感染樣品的快速檢測。利用建立的方法檢測江蘇地區(qū)的7例疑似DHAV-1感染病例，檢出率和準(zhǔn)確性達(dá)100%，進(jìn)一步證實(shí)了所用引物和建立方法的正確性。該方法與程安春等[8]的方法相比，在確保檢出率的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步提高了靈敏度，而且廉價、快捷、準(zhǔn)確，對采樣要求較低，適于在臨床推廣應(yīng)用，為DHAV-1快速檢測試劑盒研制奠定了基礎(chǔ)，對DHAV-1感染病例的快速檢測、疫情控制具有指導(dǎo)意義。

[1] Liu M,Zhang T,Zhang Y,etal. Development and e valuation of a VP1-ELISA for detection of antibodies to duck hepatitis type 1 virus[J].Journal of Virological Methods,2010,169(1):66-69.

[2] Tseng C H,Knowles N J,Tsai H J.Molecular analysis of duck hepatitis virus type 1 indicates that it should be assigned to a new genus[J].Virus Res,2007,123(2):190-203.

[3] Kim M C,Kwon Y K,Joh S J,etal.Molecular analysis of duck hepatitis virus type 1 reveals a novel lineage close to the genus Parechovirus in the family Picornaviridae [J].J Gen Virol,2006,87:3307-3316.

[4] 張忠信.ICTV第九次報(bào)告對病毒分類系統(tǒng)的一些修改[J].病毒學(xué)報(bào),2012,28(5):595-599.

[5] 任邵娜,袁生,蒲文珺,等.Ⅰ型鴨肝炎病毒VP1基因克隆與序列分析[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2014,53(21):5208-5212,5216.

[6] Swayne D E,Glisson J R,Jackwood M W,etal.A laboratory manual for theisolation and identification of avian pathogens[M].4th ed.Dubuque:International Book Distributing Co.,2006.

[7] 汪銘書,程安春,陳孝躍.鴨病毒性肝炎的研究——強(qiáng)毒在雛鴨體內(nèi)的分布及排泄[J].中國獸醫(yī)學(xué)報(bào),1997,17(3):254-257.

[8] 程安春,汪銘書,廖得惠,等.應(yīng)用膠體金免疫電鏡技術(shù)檢測鴨肝炎病毒[J].中國獸醫(yī)雜志,1994,20(6):3-4.

[9] 馬秀麗,宋敏訓(xùn),于可響,等.鴨病毒性肝炎病毒vp1 基因表達(dá)及其抗體檢測ELISA方法的建立[J].微生物學(xué)報(bào),2008,48(8):1110-1114.

[10] Liu M,Zhang T ,Zhang Y.Development and evaluation of a VP1-ELISA for detection of antibodies to duck hepatitis type 1 virus[J].J Virol Methods,2010,169:66-69.

[11] 董井泉,張蕾,馬波,等.1型鴨肝炎病毒VP1 蛋白優(yōu)勢抗原區(qū)的鑒定及抗體檢測ELISA 方法的建立[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2014,36(7):542-546.

[12] 胡成,朱善元,左偉勇,等.鴨I型肝炎病毒一步法RT-LAMP可視化快速檢測方法的建立[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2015,31(3):613-618.

[13] Ding C Y,Zhang D B.Molecular analysis of duck hepatitis virus type 1[J].Virology,2007,361:9-17.

Establishment of RT-PCR Method for Detection of
Duck Hepatitis Virus Type 1

WANG Yongjuan,ZHU Shanyuan,WANG Anping,WU Shuang,HONG Weiming,ZUO Weiyong*

(Jiangsu Agri-animal Husbandry Vocational College/Jiangsu Provincial Key Laboratory of Veterinary Bio-pharmaceutical High Tech Research,Taizhou 225300,China)

In order to establish a rapid detection method for dicnical duck hepatitis virus type 1(DHAV-1) infection,a pair of primers based onvp1 gene sequence was designed.Using DHAV-1 or other common disease virus genome as template,a specificity RT-PCR method was established.The template was ten times diluted for sensitivity detection.Some suspected DHAV-1 infected epidemic materials were collected from Jiangsu province.Genome of the materials were extracted and detected followed with sequence determination.The results showed that the established method could specifically amplifyvp1 conservative region 360 bp sequence.The sensitivity and specificity results showed that the detection limitation was 1 fg,and there was no cross reactions with other duch virused.The detection rate of clinical samples was 100%.The results showed that a high specificity and high sensitivity RT-PCR method for rapid clinical diagnosis of duck DHAV-1 infection was successfully established.

duck; duck hepatitis virus type 1; RT-PCR; detection

2016-08-22

江蘇省高校自然科學(xué)研究面上項(xiàng)目(16KJB230004)；江蘇省“六大人才”高峰資助項(xiàng)目(NY-023，10410015002)；江蘇農(nóng)牧科技學(xué)院“鳳凰人才工程”項(xiàng)目；江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院重點(diǎn)支持項(xiàng)目(NSFZD1405,NSFPT201510，NSFPT201512)

王永娟(1980-)，女，江蘇海門人，副教授，博士，主要從事動物傳染病防治研究。E-mail:43088591@qq.com

*通訊作者：左偉勇(1978-)，男，山東泰安人，教授，博士，主要從事動物疫病防控研究。E-mail:979490023@qq.com

S855.3

A

1004-3268(2017)02-0116-04