檳榔內(nèi)生細(xì)菌BLG1的抗菌活性及其對(duì)水稻紋枯病的防效

韓丹丹，駱焱平，侯文成，王蘭英

(海南大學(xué) 環(huán)境與植物保護(hù)學(xué)院，海南 ?？?570228)

檳榔內(nèi)生細(xì)菌BLG1的抗菌活性及其對(duì)水稻紋枯病的防效

韓丹丹，駱焱平，侯文成，王蘭英*

(海南大學(xué) 環(huán)境與植物保護(hù)學(xué)院，海南 ?？?570228)

為獲得具有生防潛力的內(nèi)生細(xì)菌，采用常規(guī)組織表面消毒法對(duì)檳榔進(jìn)行內(nèi)生細(xì)菌分離，共獲得16株內(nèi)生細(xì)菌。經(jīng)篩選發(fā)現(xiàn),菌株BLG1抑菌譜較廣，尤其對(duì)水稻紋枯病菌的皿內(nèi)抑菌率可達(dá)95.00%。進(jìn)一步研究該菌株胞內(nèi)及胞外粗提物的抑菌活性發(fā)現(xiàn)，該菌株活性物質(zhì)主要分布在胞外正丁醇相中。盆栽試驗(yàn)表明，該菌株發(fā)酵液對(duì)水稻紋枯病有很好的防效，可達(dá)67.05%，與對(duì)照藥劑10%井岡霉素水劑效果(66.47%)相當(dāng)。因此，BLG1菌株具有深入研究和開發(fā)的價(jià)值。

檳榔； 內(nèi)生細(xì)菌； 抗菌活性； 盆栽試驗(yàn)； 水稻紋枯?。?防效

植物內(nèi)生菌(endophyte)是指長期寄居在植物組織或器官內(nèi)，但對(duì)寄生植物不造成任何傷害的一類微生物。其作為植物微生態(tài)系統(tǒng)重要的組成部分，能在植物組織中定殖與運(yùn)轉(zhuǎn)，對(duì)植物無害甚至有益。其在植物體內(nèi)有穩(wěn)定的生存空間，能產(chǎn)生與宿主植物代謝相同或相似的生理活性物質(zhì)，并能有效地抑制病原菌的侵染或提高宿主植物的抗病性[1]。植物內(nèi)生菌作為生防因子的優(yōu)勢(shì)主要表現(xiàn)在其能定殖于植物體內(nèi)，相對(duì)于其他環(huán)境微生物而言，避免了多種外界壓力的干擾，更有利于發(fā)揮生防效果[2]。因此，內(nèi)生菌在當(dāng)今植物病害生物防治中占據(jù)極其重要的位置[3-4]。藥用植物因其生境獨(dú)特，所含內(nèi)生菌不僅種類多樣，產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)通常也較為新穎。近年來,關(guān)于藥用植物內(nèi)生菌及其活性成分的研究逐漸成為新藥物研發(fā)的熱點(diǎn)[5-6]，但迄今研究過的藥用植物不過數(shù)百種，因此，繼續(xù)開展藥用植物內(nèi)生菌的研究具有重要意義。檳榔(ArecacatechuL.)屬棕櫚科植物，又名仁頻、賓門、橄欖子，原產(chǎn)馬來西亞，在我國海南、福建、臺(tái)灣等地均有栽培。檳榔位列五大南藥之首，具有殺蟲、消積、降氣等功效。目前，關(guān)于檳榔的研究主要集中于其活性成分和藥理方面[7-8]，鮮見其內(nèi)生菌的報(bào)道。為此，以檳榔為供試植物材料，采用常規(guī)組織表面消毒法進(jìn)行內(nèi)生細(xì)菌的分離，以水稻紋枯病菌、香蕉炭疽病菌、芒果炭疽病菌等10種常見熱帶植物病原菌為靶標(biāo)菌對(duì)獲得菌株進(jìn)行篩選，并對(duì)高拮抗菌株進(jìn)行盆栽防效測(cè)定，旨在發(fā)現(xiàn)具有生防潛力的內(nèi)生細(xì)菌，為植物病害生物防治奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試植物樣品 檳榔采自海南大學(xué)海甸校區(qū)。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 分離培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基；發(fā)酵培養(yǎng)液為LB培養(yǎng)液；病原菌培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基。

1.1.3 供試菌株 香蕉炭疽病菌(Colletotrichummusae)、芒果炭疽病菌(C.gloeosporiordesPenz)、橡膠炭疽病菌(C.gloeosporioides)、芒果蒂腐病菌(BotryodiplodiatheobromaePat)、香蕉枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.cubense)、西瓜枯萎病菌(F.oxysporumf.sp.niveum)、橡膠落葉棒孢霉(CorynesporacassiicolaC.T.Wei)、椰子灰斑病菌(PestalotiapalmarumCooke)、水稻紋枯病菌(RhizoctoniasolaniKühn)、橡膠黑團(tuán)孢病菌(PericoniaheveaeStevenson & Imle)等10種病原菌菌種均由海南大學(xué)環(huán)境與植物保護(hù)學(xué)院農(nóng)藥實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 方法

1.2.1 內(nèi)生細(xì)菌的分離及純化 將采集的檳榔根、莖、葉用自來水沖洗干凈，室內(nèi)晾干。根、莖、葉的表面消毒程序如下：首先用75%的乙醇浸泡(其中，根浸泡8 min、莖浸泡5 min、葉浸泡1 min)，無菌水沖洗3次，然后用0.1%升汞浸泡3 min，無菌水沖洗5次。將最后一次沖洗的無菌水涂抹于分離平板上，檢查表面消毒是否徹底。

取消毒好的植物組織(根、莖去除表皮)，用無菌刀片切成極其細(xì)小的組織片，加入少量無菌水進(jìn)行研磨，取50 μL研磨液涂抹于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)2～3 d，采用多次劃線法純化所獲得菌株。

1.2.2 內(nèi)生細(xì)菌拮抗作用測(cè)定 采用對(duì)峙劃線法測(cè)定。將供試靶標(biāo)菌接種于PDA平板上，25 ℃恒溫培養(yǎng)5 d，用打孔器打取5 mm的菌餅，菌絲面向下接種于PDA平板中央。用接種環(huán)挑取少量內(nèi)生細(xì)菌，在距離菌餅20 mm處左右各劃1條直線，以只接種靶標(biāo)菌為對(duì)照，每處理重復(fù)3次，28 ℃培養(yǎng)5 d，十字交叉法測(cè)量菌落直徑。按照下列公式計(jì)算抑菌率：抑菌率=(對(duì)照組菌落直徑-處理組菌落直徑)/(對(duì)照組菌落直徑-5)×100%。

1.2.3 內(nèi)生細(xì)菌BLG1胞內(nèi)及胞外分泌物的提取 配制LB培養(yǎng)液，分裝于500 mL的三角瓶中，每瓶裝樣量為200 mL，121 ℃高溫高壓滅菌，備用。將BLG1菌株制成菌懸液接種于已滅菌的LB培養(yǎng)液中，180 r/min、28 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)3 d，獲得菌株發(fā)酵液。將發(fā)酵液以5 000 r/min離心10 min，分別收集菌體沉淀和上清液。

菌體沉淀于20 kHz超聲波中破碎細(xì)胞壁20 min，一部分浸泡于無菌水中，充分振蕩后用水相濾膜除去菌體作為胞內(nèi)水相檢測(cè)物，另一部分用等體積丙酮、乙酸乙酯、石油醚、氯仿、正丁醇依次浸提，作為胞內(nèi)有機(jī)相浸提物；上清液一部分用水相濾膜過濾除去菌體作為胞外水相檢測(cè)物，另一部分用等體積的乙酸乙酯、石油醚、氯仿、正丁醇萃取作為胞外有機(jī)相萃取物。有機(jī)相浸提液和萃取液均在45 ℃蒸發(fā)濃縮至干，用少量丙酮溶解，備用。

1.2.4 內(nèi)生細(xì)菌BLG1胞內(nèi)及胞外粗提物抑菌活性測(cè)定 采用孔碟法測(cè)定BLG1菌株胞內(nèi)及胞外粗提物的抑菌活性。制備香蕉枯萎病菌、香蕉炭疽病菌以及水稻紋枯病菌孢子懸浮液，取少量涂抹于PDA平板。用5 mm打孔器在皿內(nèi)打取等距離的3個(gè)孔，每孔注入50 μL上述粗提液，并以相同體積無菌水或丙酮作對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3皿。25 ℃恒溫培養(yǎng)3 d，十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑。

1.2.5 內(nèi)生細(xì)菌BLG1發(fā)酵液對(duì)水稻紋枯病的盆栽防效測(cè)定 按照1.2.3方法制備內(nèi)生細(xì)菌BLG1發(fā)酵液，備用。育無病水稻苗，待水稻生長至20 d時(shí)，移栽到無菌的花盆中，每盆3叢，每叢10株。在水稻分蘗盛期，將培養(yǎng)好的水稻紋枯病菌秸稈取幾根夾在每叢植株間，第2天噴濃度為108cfu/mL的拮抗菌株BLG1發(fā)酵液，每叢20 mL菌液，設(shè)無菌水為空白對(duì)照，10%井岡霉素水劑稀釋250倍液為藥劑對(duì)照。每個(gè)處理重復(fù)4次。15 d后統(tǒng)計(jì)發(fā)病率、病情指數(shù)及防效。水稻紋枯病害分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)如下[9]：0級(jí)，全株無病；1級(jí)，第4葉及其以下各葉鞘、葉片發(fā)病(以頂葉為第1片葉)；3級(jí)，第3葉片及其以下各葉鞘、葉片發(fā)??；5級(jí)，第2葉片及其以下各葉鞘、葉片發(fā)病；7級(jí)，劍葉葉片及其以下各葉鞘、葉片發(fā)??；9級(jí)，全株發(fā)病，提早枯死。所調(diào)查的數(shù)據(jù)用SAS軟件以Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較。

發(fā)病率=發(fā)病株數(shù)/總株數(shù)×100%；

病情指數(shù)=∑(各級(jí)病株數(shù)×各級(jí)代表值)/(調(diào)查總株數(shù)×9)×100；

防效=(對(duì)照病情指數(shù)-處理病情指數(shù))/對(duì)照病情指數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 檳榔內(nèi)生細(xì)菌的分離結(jié)果

采用組織表面消毒法從檳榔中共分離得到16株內(nèi)生細(xì)菌(表1)，其中,從檳榔根部分離獲得7株，葉部獲得6株，莖部獲得3株。

表1 檳榔內(nèi)生細(xì)菌分離結(jié)果

2.2 檳榔內(nèi)生細(xì)菌拮抗作用測(cè)定結(jié)果

以10種常見熱帶植物病原菌作為靶標(biāo)菌，測(cè)定檳榔內(nèi)生細(xì)菌的皿內(nèi)抑菌活性，其中,有抑菌活性的菌株見表2。分離自檳榔根部的BLG1抑菌活性最強(qiáng)，對(duì)供試靶標(biāo)菌抑菌率均大于50%，尤其對(duì)水稻紋枯病菌抑菌率可達(dá)95.00%，其次，該菌株對(duì)香蕉炭疽病菌、香蕉枯萎病菌抑菌率也在70%以上。除此之外， 僅BLJ2對(duì)水稻紋枯病菌抑菌率超過70%，表現(xiàn)出相對(duì)較好的抑菌效果，其余菌株的抑菌率均低于50%，可見其他菌株抑菌活性不高。

表2 檳榔內(nèi)生細(xì)菌對(duì)植物病原菌的抑菌率 %

2.3 檳榔內(nèi)生細(xì)菌BLG1胞內(nèi)及胞外粗提物的抑菌活性

采用孔碟法測(cè)定BLG1胞內(nèi)及胞外粗提物對(duì)香蕉枯萎病菌、香蕉炭疽病菌以及水稻紋枯病菌的抑菌活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該菌株6種胞內(nèi)粗提物對(duì)供試靶標(biāo)菌均無抑菌活性；胞外粗提物除石油醚相無抑菌活性外，其余均有一定的抑菌活性(表3)。其中，正丁醇相抑菌活性最高，其對(duì)水稻紋枯病菌的抑菌圈達(dá)22 mm，其次是對(duì)香蕉枯萎病菌，抑菌圈達(dá)16 mm。另外，水相也有很好的抑菌活性，其對(duì)水稻紋枯病菌和香蕉枯萎病菌的抑菌圈分別為10 mm和11 mm。

表3 檳榔內(nèi)生細(xì)菌BLG1胞外粗提物的抑菌活性

2.4 檳榔內(nèi)生細(xì)菌BLG1發(fā)酵液對(duì)水稻紋枯病的盆栽防效

采用盆栽法測(cè)定內(nèi)生細(xì)菌BLG1對(duì)水稻紋枯病的防治效果，結(jié)果(表4)表明，經(jīng)該菌株發(fā)酵液處理后，水稻紋枯病發(fā)病率極顯著降低，與對(duì)照藥劑10%井岡霉素水劑處理發(fā)病率相當(dāng)；該菌株發(fā)酵液對(duì)水稻紋枯病的防治效果可達(dá)67.05%，略高于對(duì)照藥劑10%井岡霉素水劑，二者差異不顯著。

表4 檳榔內(nèi)生細(xì)菌BLG1對(duì)水稻紋枯病的盆栽防效

注：同列不同小寫英文字母表示在0.05水平差異顯著，不同大寫字母表示在0.01水平差異極顯著。

3 結(jié)論與討論

Strobel等[10]指出，藥用植物的內(nèi)生菌次生代謝產(chǎn)物種類多樣，是當(dāng)今新藥開發(fā)的潛在資源。作為重要南藥植物之一的檳榔，一直以來都是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，但是關(guān)于該種植物內(nèi)生菌的研究尚未見報(bào)道。本研究采用常規(guī)組織表面消毒法從檳榔中分離獲得16株內(nèi)生細(xì)菌，其中，分離自根部的內(nèi)生細(xì)菌BLG1對(duì)供試的10株熱帶植物病原真菌抑菌率均在50%以上，可見該菌株抑菌譜較廣。研究其發(fā)酵液抑菌活性發(fā)現(xiàn)，菌株胞內(nèi)粗提物無抑菌活性，而胞外除石油醚相外，其他相均有一定的抑菌活性，說明該菌株的主要抑菌活性物質(zhì)分布在細(xì)胞外。將其發(fā)酵液應(yīng)用于水稻紋枯病的防治，發(fā)現(xiàn)該菌發(fā)酵液防病效果突出，可達(dá)67.05%，略高于對(duì)照藥劑10%井岡霉素水劑，進(jìn)一步證明了該菌株可分泌具有抑菌活性的次生代謝產(chǎn)物于環(huán)境中，控制病原菌的生長。同時(shí)，測(cè)定菌株粗提物的抑菌活性時(shí)還發(fā)現(xiàn)，該菌株對(duì)供試靶標(biāo)菌的抑菌活性物質(zhì)分布在多個(gè)溶劑相中，可見，該菌株的抑菌活性物質(zhì)不止1種。因此，有必要對(duì)其次生代謝產(chǎn)物做進(jìn)一步分析，有望得到多種有活性的抑菌物質(zhì)。

水稻紋枯病又稱爛腳病、富貴病，主要是由禾谷絲核菌(RhizoctoniacerealisVan der Hoeven)引起的一種土傳真菌病害，該病在世界主要水稻產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，植株發(fā)病嚴(yán)重時(shí)減產(chǎn)可達(dá)到50%以上。對(duì)于該病的防治，一直以來主要采用化學(xué)措施，但近年來病原菌抗藥性問題日益嚴(yán)重[11-14]。王奎萍等[15]研究證實(shí)，將拮抗細(xì)菌應(yīng)用于水稻紋枯病防治切實(shí)可行，并指出所施加的細(xì)菌對(duì)水稻有一定促生作用。另外，由于內(nèi)生細(xì)菌一般都能很好地定殖在植物體或根際周圍，被認(rèn)為是潛在的土傳病害生物控制劑[16-17]。因此，本研究所獲得菌株對(duì)水稻紋枯病具有很好的生防價(jià)值，在后續(xù)試驗(yàn)中可對(duì)其田間防病及促生作用開展全面研究，有望開發(fā)出防治水稻紋枯病的生防菌劑。

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Determination of Antimicrobial Activity and Control Effect on Rhizoctonia solani of Endophytic Bacterium BLG1 from Areca catechu L.

HAN Dandan,LUO Yanping,HOU Wencheng,WANG Lanying*

(College of Environment and Plant Protection,Hainan University,Haikou 570228,China)

In order to obtain bio-control endophytic bacteria,sixteen endophytic bacteria were isolated fromArecacatechuL.by conventional surface disinfection method.The strain BLG1 showed excellent antimicrobial activities,especially,the inhibition rate againstRhizoctoniasolanireached 95.00%.Crude extracts from endo- and extra-cell of the strain were tested,and the result showed that the active components mainly were distributed in extracellular part extracted by n-butyl alcohol.Pot experiment test showed that the strain BLG1 had good control effect (67.05%) againstRhizoctoniasolani,which was the same as 10% Jinggangmycin aqueous solution (66.47%).Therefore,the strain BLG1 has values of further research and development.

ArecacatechuL.; endophytic bacterium; antimicrobial activity; pot experiment;Rhizoctoniasolani; control effect

2016-07-30

海南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(314054，311028)

韓丹丹(1991-)，女，山西長治人，在讀碩士研究生，研究方向：生物防治。E-mail：66handandan@sina.com

*通訊作者：王蘭英(1976-)，女，山東鄆城人，副教授，在讀博士研究生，主要從事生物防治研究。E-mail：daivemuwly@126.com

S476.1

A

1004-3268(2017)02-0060-04