重慶中國三峽博物館小環(huán)境空氣微生物種屬與數(shù)量的動(dòng)態(tài)研究

唐 歡，范文奇，王 春，張麗龍

(1. 重慶中國三峽博物館，重慶 400015； 2． 重慶市疾病預(yù)防控制中心，重慶 400042)

重慶中國三峽博物館小環(huán)境空氣微生物種屬與數(shù)量的動(dòng)態(tài)研究

唐 歡1，范文奇1，王 春1，張麗龍2

(1. 重慶中國三峽博物館，重慶 400015； 2． 重慶市疾病預(yù)防控制中心，重慶 400042)

為了發(fā)現(xiàn)文物展陳環(huán)境中潛在的微生物病害，為館藏文物的預(yù)防性保護(hù)提供科學(xué)依據(jù)，結(jié)合傳統(tǒng)的純培養(yǎng)技術(shù)和基于細(xì)菌16SrRNA基因的PCR-DGGE(PCR-Denaturing gradient gel electrophoresis)技術(shù)，綜合分析博物館小環(huán)境中可培養(yǎng)細(xì)菌的種屬、數(shù)量及其時(shí)空動(dòng)態(tài)變化特征。結(jié)果表明，博物館小環(huán)境內(nèi)可培養(yǎng)的空氣微生物存在季節(jié)差異，在數(shù)量和多樣性上均表現(xiàn)為夏季顯著高于冬季，其主要優(yōu)勢菌群包括Acinetobactersp.、Staphylococcussp.、Pseudomonassp.和Advenellasp.。此外，夏季空氣的特征菌屬為Acinetobactersp.和Micrococcussp.，冬季典型菌種為Bacillussp.。

博物館環(huán)境;預(yù)防性保護(hù);PCR-DGGE;空氣微生物

0 引 言

博物館環(huán)境是指收藏與展示各類可移動(dòng)文物的相對(duì)密閉空間的總體[1]，主要包括以囊匣、展柜為代表的微環(huán)境，以展廳、庫房為代表的小環(huán)境，整個(gè)博物館建筑空間為代表的大環(huán)境以及博物館外部環(huán)境[2]。除了溫濕度、光照、污染氣體等常見環(huán)境因素之外，微生物、昆蟲等生物因素亦是博物館環(huán)境研究的重要內(nèi)容之一。隨著文物預(yù)防性保護(hù)理念的日益深入，監(jiān)測文物展陳環(huán)境中的空氣微生物組成、控制博物館小微環(huán)境中的微生物污染已成為近年來文物預(yù)防性保護(hù)研究的一個(gè)新方向，比利時(shí)、法國、波蘭以及國內(nèi)部分博物館均開展了博物館內(nèi)空氣微生物的研究[3-6]。

以往對(duì)博物館展廳內(nèi)空氣微生物開展的研究主要聚焦于特定時(shí)間點(diǎn)的微生物數(shù)量和種類，但空氣微生物是動(dòng)態(tài)變化的，會(huì)隨著時(shí)間、季節(jié)和參觀人流量等因素的變化而發(fā)生改變，因此，對(duì)其進(jìn)行連續(xù)動(dòng)態(tài)的監(jiān)測才能更好地發(fā)現(xiàn)其數(shù)量和種屬的演替規(guī)律，為潛在的文物微生物病害提供科學(xué)的預(yù)判依據(jù)。

變性梯度凝膠電泳(Denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)技術(shù)自1993年被Muyzer引入微生物生態(tài)學(xué)研究以來，現(xiàn)已被廣泛地應(yīng)用于環(huán)境微生物群落的多樣性和動(dòng)態(tài)性分析。該技術(shù)不僅可以研究微生物結(jié)構(gòu)的時(shí)間空間變化特征，還可以通過對(duì)凝膠上的特定條帶進(jìn)行回收并測序，進(jìn)而鑒定條帶對(duì)應(yīng)的菌落種屬[7]。本研究通過傳統(tǒng)的菌落培養(yǎng)檢測博物館小環(huán)境中的空氣微生物數(shù)量，結(jié)合PCR-DGGE技術(shù)研究菌落的結(jié)構(gòu)和組成，對(duì)博物館小環(huán)境中冬季和夏季的空氣微生物數(shù)量與種類進(jìn)行了時(shí)空動(dòng)態(tài)分析。

1 材料與方法

1.1 主要設(shè)備及試劑

空氣浮游菌采樣器型號(hào)為ZR2050型(青島眾瑞)；手持式溫度/相對(duì)濕度采集器型號(hào)為U12-011型(HOBO)；細(xì)菌培養(yǎng)用生化培養(yǎng)箱為SPX-250B型(上海躍進(jìn))；PCR儀為C1000型(Bio-Rad)；核酸定量儀為Nano Drop 2000型(Thermo)；凝膠成像系統(tǒng)為Gel Doc XR+(Bio-Rad)；變性梯度凝膠電泳儀為DCodeTMUniversal Mutation Detection System(Bio-Rad)。細(xì)菌總數(shù)檢測用營養(yǎng)瓊脂平板購自重慶龐通醫(yī)療器械有限公司，細(xì)菌總菌DNA提取試劑盒為QIAGEN(51604, QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit)；EXTaq DNA聚合酶購自TaKaRa。

1.2 空氣微生物采樣、培養(yǎng)及計(jì)數(shù)

采樣展廳為位于博物館一樓的壯麗三峽展廳，該展廳是博物館參觀人流量最大的展廳。本研究在該展廳設(shè)置了4個(gè)采樣點(diǎn)，分別編號(hào)為ZL1、ZL2、ZL3、ZL4，采樣點(diǎn)在展廳中的位置如圖1所示。整個(gè)展廳做了大量隔斷，布局較為復(fù)雜。ZL1采樣點(diǎn)靠近展廳入口處，該處為開放式陳列，空間寬敞，存放動(dòng)物標(biāo)本等有機(jī)質(zhì)藏品；ZL2采樣點(diǎn)位于展廳最內(nèi)側(cè)，展示刺繡等有機(jī)質(zhì)文物，同時(shí)是該展廳全年平均濕度最大的檢測位點(diǎn)；ZL3號(hào)采樣點(diǎn)位于展廳內(nèi)側(cè)，展示有紡織品、皮革制品等文物； ZL4號(hào)采樣點(diǎn)位于展廳出口附近，展示竹木制品、刺繡等民族文物。可見，四個(gè)采樣點(diǎn)處展覽的文物均以有機(jī)質(zhì)文物為主，對(duì)于文物的微生物病害較為敏感。

圖1 采樣點(diǎn)位置布局圖

本研究于夏季(2013年6、7、8月)和冬季(2013年11、12月及2014年1月)對(duì)該展廳進(jìn)行了空氣微生物樣品的采集。具體采樣時(shí)間分別為2013年6月24日，7月23日，8月22日，11月29日，12月25日及2014年1月15日。

采樣方法參照我國《室內(nèi)空氣質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(GB/T18883—2002)的相關(guān)要求進(jìn)行?？諝飧∮尉蓸悠髦糜诰嗟孛?.2m高處進(jìn)行空氣樣本采集，采樣流量參數(shù)設(shè)置為10 L/min，采樣時(shí)長設(shè)置為5min。采集后的培養(yǎng)皿放入生化培養(yǎng)箱中，37 ℃條件下倒置培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)完成后，營養(yǎng)瓊脂上的全部菌落經(jīng)無菌去離子水充分沖洗后凍存，進(jìn)行空氣微生物細(xì)菌總DNA提取。

1.3 空氣微生物總菌DNA的提取

細(xì)菌總菌DNA的提取按照QIAGEN試劑盒提供的protocol進(jìn)行。 提取后的DNA經(jīng)Nano Drop 2000測定樣品的濃度及純度，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳(1%)檢測樣品的完整性。

1.4 PCR擴(kuò)增[8]

細(xì)菌16SrRNA基因 V3區(qū)的擴(kuò)增引物由Takara公司合成， 序列分別為V3-357f-GC (5’-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGTACGGGAGGCAGCAG-3′)和 V3-518r (5′-ATTACC GCGGCTGCTGG-3′)， PCR產(chǎn)物長度大小預(yù)計(jì)為217bp。PCR反應(yīng)體系為25μL，其中模板DNA量為20ng，10×EXTaq buffer 2.5μL，dNTP用量為2.5μL，ExTaq酶0.25μL，引物357f-GC、518r各0.5μL，添加無菌雙蒸水至終體積25μL。PCR循環(huán)條件為94℃預(yù)變性5min；94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 1min，30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。

按照Thompson和Xiong等的方法[9,10]進(jìn)行Reconditioning PCR，以此去除PCR引物二聚體對(duì)DGGE進(jìn)行的影響。Reconditioning PCR的模板為第一次PCR的產(chǎn)物(用量為5μL)，終體系為25μL，循環(huán)次數(shù)減少至5個(gè)循環(huán)，其他條件均與第一次PCR的條件相同。

1.5 DGGE電泳及特殊條帶鑒定

按照DCode System的說明書，參照Muyzer[11]和Walter[12]等報(bào)道的DGGE條件和方法，對(duì)16SrRNA基因V3區(qū)序列擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DGGE電泳。DGGE使用8%的聚丙烯酰胺，變性梯度為35%～65%，電泳緩沖液為1×TAE(pH=8.4)。220V條件下預(yù)電泳10min后，130V的固定電壓電泳4.5h。電泳結(jié)束后的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行EB染色，由凝膠成像系統(tǒng)捕捉圖像后，用Quantity One軟件(BioRad，Hercules，California，USA)進(jìn)行條帶數(shù)量、位置、亮度等信息的統(tǒng)計(jì)分析，并通過軟件獲取的數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行UPGMA相似性聚類分析。

用無菌刀片將凝膠上的特定條帶切割下來，使用1×EXTaq buffer 漂洗2次，將其搗碎，加入40μL×EXTaq buffer，4℃條件下浸泡過夜。以浸泡液作為模板，重新進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列為357f(5′-TACGGGAGGCAGCAG-3′)和518r(5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′)，PCR條件同1.4[13]。PCR產(chǎn)物經(jīng)二次DGGE跑膠后， 確認(rèn)與原切割條帶位置一致的，經(jīng)T-A克隆后進(jìn)行測序[14,15]，返回序列在Genbank進(jìn)行BLAST比對(duì)，網(wǎng)址為www.ncbi.nlm.nih.com。

1.6 數(shù)據(jù)分析

1.6.1 多樣性分析 通過DGGE圖譜進(jìn)行的微生物群落多樣性分析包括：豐富度(richness，S)，即 圖譜上每條泳道內(nèi)的條帶數(shù)；微生物區(qū)系的Shannon-Wiener 指數(shù)(H′)，計(jì)算方法為H′=-∑Pi lnPi，其中， Pi為第i條帶的吸光度與該泳道所有條帶吸光度總和的比值[16,17]。

圖2 展廳冬夏兩季的溫濕度和菌落總數(shù)檢測結(jié)果

表1是對(duì)于該展廳內(nèi)四個(gè)不同的采樣點(diǎn)進(jìn)行的數(shù)據(jù)分析。結(jié)果顯示，雖然博物館大環(huán)境受中央空調(diào)的調(diào)控，但四個(gè)采樣點(diǎn)夏季的溫度仍然極顯著高于冬季(p<0.01)，濕度在不同的采樣位置中未見明顯變化(p>0.05)。在檢測數(shù)據(jù)中，最高溫度25.5℃，最低溫度14.1℃，最大濕度74%RH，均出現(xiàn)于ZL1采樣點(diǎn)；濕度最低為50%RH，出現(xiàn)于ZL4采樣點(diǎn)。1號(hào)及4號(hào)采樣點(diǎn)分別接近展廳的入口與出口，溫濕度變化可能更易受博物館大環(huán)境和參觀人流的影響，因此波動(dòng)較大。此外，所有采樣點(diǎn)的濕度幾乎均在60%RH以上，這與重慶市本身年均濕度超過70%有關(guān)。

空氣微生物總數(shù)最高檢出點(diǎn)為ZL3號(hào)采樣點(diǎn)，其次為ZL2采樣點(diǎn)。這兩個(gè)采樣點(diǎn)均位于展廳中部，展廳蜿蜒的設(shè)計(jì)使其空氣流動(dòng)性較差，因此容易滋生微生物。此外，這兩個(gè)采樣點(diǎn)的菌落總數(shù)也表現(xiàn)出了季節(jié)性差異(p<0.01)，即在這兩個(gè)地點(diǎn)，夏季空氣中的微生物總量極顯著地高于冬季。

表1 4個(gè)采樣點(diǎn)冬夏兩季的溫濕度和菌落總數(shù)檢測結(jié)果

注：**，與夏季數(shù)據(jù)相比，p<0.01

2 冬夏兩季博物館小環(huán)境空氣微生物多樣性的比較

首先，從圖3 ①的微生物純培養(yǎng)結(jié)果可直觀看出，夏季(6～8月)2號(hào)采樣點(diǎn)的采樣平板上菌落密布，數(shù)量明顯多于冬季三個(gè)月(11～1月)的采樣平板。如果對(duì)如此之多的菌落分別單獨(dú)進(jìn)行種屬鑒定，不僅工作量龐大，而且可能存在大量相同結(jié)果。因此，使用DGGE的方法對(duì)細(xì)菌種類進(jìn)行分析就顯得尤為方便高效了。

圖3 利用PCR-DGGE對(duì)采集的空氣微生物樣品進(jìn)行種屬鑒定的過程

利用PCR-DGGE技術(shù)對(duì)采集的空氣微生物樣品種屬進(jìn)行鑒定的過程如圖3所示：將不同平板上的所有細(xì)菌菌落混合沖洗下來作為獨(dú)立的總DNA進(jìn)行提取，接下來對(duì)這個(gè)總DNA樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增并進(jìn)一步實(shí)施變性梯度電泳后，一個(gè)平板上所有細(xì)菌的信息就轉(zhuǎn)化到圖3②中每一個(gè)單獨(dú)的泳道內(nèi)。根據(jù)DGGE的原理，泳道內(nèi)的每一個(gè)條帶理論上分別對(duì)應(yīng)了一種細(xì)菌，而不同泳道間同一水平位置的條帶代表相同種類的細(xì)菌[11,18,19]。條帶越粗越亮，則代表該樣品中，這個(gè)條帶對(duì)應(yīng)的某種細(xì)菌數(shù)量越多。為了了解不同條帶究竟是哪一種細(xì)菌，需要對(duì)目的條帶進(jìn)行切膠回收以收集其DNA，通過二次PCR后，進(jìn)一步測序比對(duì)而明確細(xì)菌種屬[20-22]。

首先， 從本實(shí)驗(yàn)獲得的DGGE圖譜(圖4)上可以明顯看到，在四個(gè)采樣點(diǎn)夏季與冬季的24個(gè)空氣微生物樣品中，大部分樣品泳道中具有共同的條帶C、D、E、H、J和K。經(jīng)過對(duì)條帶回收并測序后發(fā)現(xiàn)，對(duì)應(yīng)的微生物分別為Acinetobacterlwoffii(相似性99%)、Staphylococcushominis(相似性99%)、Advenellasp.(相似性100%)、Staphylococcussp.(相似性100%)、Pseudomonassp.(相似性100%)和Staphylococcuswarneri(相似性100%)。由此可見，在壯麗三峽展廳這個(gè)博物館小環(huán)境中，全年空氣微生物的主要群落為不動(dòng)桿菌屬、葡萄球菌屬、銅綠假單胞菌和Advenella屬，其中又以葡萄球菌屬最為優(yōu)勢。雖然C和D條帶分別對(duì)應(yīng)的Acinetobacterlwoffii和Staphylococcushominis幾乎貫穿了24個(gè)泳道，既24個(gè)樣品中都有檢出，但從條帶的亮度可見，代表夏季月份的泳道1～3中，這兩個(gè)條帶的亮度基本都比代表冬季的4～6號(hào)泳道亮度高，從側(cè)面說明這兩種菌的數(shù)量在夏季比在冬季數(shù)量多。

圖4 四個(gè)采樣點(diǎn)冬夏季空氣微生物的PCR-DGGE譜圖

與上述條帶不同的是，A、B和I條帶較多的出現(xiàn)在夏季空氣微生物的樣品中，而在冬季樣品中很少出現(xiàn)。經(jīng)過比對(duì)發(fā)現(xiàn)，它們分別為Acinetobacterbaumannii.(相似性99%)、Acinetobacterbaumannii. (相似性100%)和Micrococcussp. (相似性100%)；條帶F和G則在ZL1、2、3號(hào)采樣點(diǎn)的冬季樣品中出現(xiàn)，夏季樣品中條帶極其微弱或未檢出，它們經(jīng)測序發(fā)現(xiàn)均為Bacillusthuringiensis.(相似性分別為99%和100%)。這些結(jié)果表明：在該展廳的空氣微生物組成中，除了擁有共同的優(yōu)勢菌群之外，冬夏兩個(gè)季節(jié)各自具有不同的典型菌種：夏季的特征菌屬為不動(dòng)桿菌屬和微球菌屬，而冬季芽孢桿菌屬更為活躍。特征條帶的測序結(jié)果見表2。

表2 DGGE條帶測序比對(duì)結(jié)果

此外，DGGE電泳圖中還可以直觀看出夏季樣品條帶的數(shù)量多于冬季樣品，說明夏季空氣微生物的種類要多于冬季。對(duì)24個(gè)泳道的條帶數(shù)量和亮度進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，夏季樣品的微生物種類顯著高于冬季樣品(p<0.05)(圖5)，且夏季空氣微生物的多樣性指數(shù)極顯著地高于冬季(p<0.01)(圖6)。詳細(xì)對(duì)4個(gè)采樣點(diǎn)進(jìn)行分析可以看出，豐富度和多樣性指數(shù)最高的采樣點(diǎn)為ZL2號(hào)位置，且與3號(hào)采樣點(diǎn)差異不顯著，該結(jié)果與微生物數(shù)量統(tǒng)計(jì)結(jié)果類似。同時(shí)，1、2、3號(hào)采樣點(diǎn)的微生物豐富度和多樣性指數(shù)在冬夏兩季均高于4號(hào)采樣點(diǎn)(p<0.01)(表3)。

圖5 冬夏兩季空氣微生物豐富度的比較

圖6 冬夏兩季空氣微生物多樣性指數(shù)的比較

ZL1夏季ZL1冬季ZL2夏季ZL2冬季ZL3夏季ZL3冬季ZL4夏季ZL4冬季豐富度21．00±2．6518．67±3．5121．33±4．1617．33±2．5321．67±3．7917．33±6．0315．67±3．06??13．00±2．65??多樣性指數(shù)2．66±0．112．43±0．172．80±0．142．51±0．072．74±0．182．53±0．462．53±0．21??2．22±0．08??

注：**，與夏季相比，p<0.01

從UPGMA聚類分析的結(jié)果可以看出(圖7)，每個(gè)采樣點(diǎn)的數(shù)據(jù)基本能夠較好地聚為一簇，表明各個(gè)采樣點(diǎn)在可培養(yǎng)空氣微生物的組成上分別具有較大的相似性。在3號(hào)采樣點(diǎn)，6、7、8三個(gè)夏季月份空氣微生物在組成上的相似程度為61%，說明整個(gè)夏季該采樣位置的空氣微生物種類較為穩(wěn)定。4號(hào)采樣點(diǎn)在11、12及1月三個(gè)月中，空氣微生物的種類相似性達(dá)到70%，說明整個(gè)冬季該采樣點(diǎn)的空氣中，微生物種類未發(fā)生明顯波動(dòng)。

圖7 DGGE圖譜UPGMA聚類分析結(jié)果

3 討 論

1) PCR-DGGE分析技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)。從技術(shù)上看，PCR-DGGE本身是建立在不依賴于培養(yǎng)的條件下，對(duì)微生物群落多樣性和群落變化動(dòng)態(tài)開展檢測分析的技術(shù)，廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、環(huán)境、農(nóng)業(yè)、林業(yè)及食品研究等領(lǐng)域[23-25]。在文博行業(yè)，2015年，Lech T等應(yīng)用PCR-DGGE技術(shù)研究了波蘭國家檔案館及國內(nèi)最大的博物館Krakow博物館庫房及展廳內(nèi)空氣微生物菌群的組成[4]。除了對(duì)多樣性進(jìn)行分析外，PCR-DGGE技術(shù)還可以直接鑒定微生物群落組成，研究者可對(duì)DGGE圖譜上感興趣的特定條帶切割回收并進(jìn)行菌種鑒定。因此，在微生物的種屬分析方面DGGE具有直觀、快速的獨(dú)特優(yōu)勢。利用其一個(gè)條帶對(duì)應(yīng)一種微生物的特點(diǎn)，但國蓉等利用可培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)菌株制備成marker，對(duì)微生態(tài)藥品中的益生菌進(jìn)行了PCR-DGGE的種屬分類[26]， Shanqimuge等結(jié)合純培養(yǎng)技術(shù)和PCR-DGGE技術(shù)對(duì)大曲的菌種進(jìn)行直接快速的鑒定[27]。以本研究為例，若夏季樣品中培養(yǎng)菌落數(shù)大于200CFU，如果分別挑取單個(gè)克隆進(jìn)行菌落PCR再進(jìn)行測序比對(duì)，工作量非常巨大，效率明顯較低。本研究借鑒不依賴培養(yǎng)的微生物的研究方法，以一個(gè)混合樣作為一個(gè)整體，進(jìn)行混合菌落的總DNA提取，再通過DGGE的條帶分割將混合信息直觀呈現(xiàn)于膠上，選取具有特征或研究意義的條帶進(jìn)行切割、測序、比對(duì)，大大提高了工作效率，且更容易發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢菌群，如該小環(huán)境中冬夏兩季的樣品泳道中均出現(xiàn)了C、D、E、H、J和K條帶，則直觀說明這些條帶所對(duì)應(yīng)的微生物菌落為貫穿整個(gè)小環(huán)境的冬夏兩季的優(yōu)勢菌群。

2) 博物館環(huán)境內(nèi)空氣微生物的主要種類。在組成上，對(duì)于博物館小環(huán)境中空氣微生物種類的研究中，武望婷等曾報(bào)道首都博物館內(nèi)空氣微生物細(xì)菌組成以微球菌為主，還包括桿菌、芽孢桿菌、考克氏菌和假單胞菌[28]；Gaüzère等對(duì)于盧浮宮內(nèi)的空氣微生物進(jìn)行了連續(xù)6個(gè)月的監(jiān)測，經(jīng)過高通量測序顯示其空氣微生物的優(yōu)勢菌屬分別為副球菌屬、不動(dòng)桿菌屬、銅綠假單胞菌、棲水菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、鏈球菌屬和葡萄球菌屬等[5]。本研究通過對(duì)DGGE條帶的割膠測序發(fā)現(xiàn)，展廳內(nèi)樣品可培養(yǎng)的空氣微生物主要優(yōu)勢菌群為不動(dòng)桿菌屬、銅綠假單胞菌、葡萄球菌屬及Advenellasp.，與Gaüzère等的研究基本相吻合。高通量測序雖然獲得了更豐富的多樣性數(shù)據(jù)，但對(duì)于微生物組成的季節(jié)性演替和組成特征卻不如DGGE圖譜直觀，如本研究的圖譜分析可見夏季空氣的特征菌屬為Acinetobactersp.和Micrococcussp.，冬季典型菌種為Bacillussp.。另外，關(guān)于類似博物館這一密閉空間中空氣真菌的研究，馬燕天等對(duì)于莫高窟洞窟空氣微生物的研究發(fā)現(xiàn)，在9月份窟外真菌數(shù)量檢出在24～32CFU/m3，在密閉的洞窟內(nèi)，真菌數(shù)量比窟外更少[29]；本課題組也曾對(duì)臨時(shí)展廳中空氣微生物真菌進(jìn)行計(jì)數(shù)，可培養(yǎng)的真菌數(shù)量較少，5～8月真菌平均數(shù)量低于15CFU/m3[30]。在本實(shí)驗(yàn)中部分采樣位點(diǎn)甚至未檢出(數(shù)據(jù)未給出)，因此在本研究中并未對(duì)真菌進(jìn)行數(shù)量統(tǒng)計(jì)和多樣性分析。

3) 影響空氣微生物穩(wěn)定性的因素。在空氣微生物的穩(wěn)定性上，Tringe等的研究結(jié)果給予的提示是，與戶外環(huán)境不同，影響密閉的室內(nèi)環(huán)境中空氣微生物組成的主要原因可能是由于小環(huán)境空氣中的選擇性抗力，氧化損傷及干燥過程、鐵限制等均會(huì)影響微生物群落的構(gòu)成，也可能與人流活動(dòng)有關(guān)[31]。而本實(shí)驗(yàn)DGGE圖譜UPGMA聚類分析結(jié)果顯示，ZL3采樣點(diǎn)冬季空氣微生物的種類相似程度最高達(dá)到73%，ZL1和ZL2號(hào)采樣點(diǎn)的夏季空氣微生物組成相似性最高甚至達(dá)到83%。類似的研究結(jié)果還見于馬燕天等對(duì)莫高窟窟內(nèi)環(huán)境微生物的調(diào)查[29]。其結(jié)果顯示，游客人數(shù)只對(duì)窟外環(huán)境有影響，而對(duì)封閉的洞窟內(nèi)的微生物無影響?？梢姡趨⒂^人員不斷發(fā)生改變的情況下，微生物組成并未發(fā)生較大變化。因此，影響博物館內(nèi)空氣微生物多樣性的主要原因還是小環(huán)境本身，季節(jié)的變化和參觀者的擾動(dòng)，對(duì)于封閉環(huán)境的穩(wěn)態(tài)影響不大。

綜合展廳這一博物館小環(huán)境的空氣微生物數(shù)量及種類分析結(jié)果，濕度的穩(wěn)定對(duì)于微生物組成可能具有一定影響，而溫度則可能影響其數(shù)量，因此對(duì)于小環(huán)境內(nèi)的溫濕度控制仍然是控制室內(nèi)微生物的重要措施[32]。此外，博物館中央空調(diào)系統(tǒng)的濕潤器、濾網(wǎng)等組件上往往是微生物積存和繁殖的場所，可通過管網(wǎng)向通風(fēng)下游散播，因此也不能忽視博物館小環(huán)境中的空調(diào)送風(fēng)系統(tǒng)對(duì)空氣微生物的影響，需定期進(jìn)行空調(diào)系統(tǒng)的維護(hù)。

4 結(jié) 論

1) 在博物館小環(huán)境微生物數(shù)量上，在全年濕度較為穩(wěn)定，而夏季溫度極其顯著高于冬季的條件下，該展廳內(nèi)空氣微生物菌落總數(shù)在夏季顯著高于冬季。

2) 在微生物組成上，該展廳冬夏兩個(gè)季節(jié)的可培養(yǎng)空氣微生物組成穩(wěn)定性高于39%，且夏季樣品中的微生物種類顯著高于冬季樣品。不動(dòng)桿菌屬、葡萄球菌屬、銅綠假單胞菌和Advenella屬的微生物在冬夏兩季都是整個(gè)展廳空氣內(nèi)的優(yōu)勢菌群，在展廳的4個(gè)采樣點(diǎn)均可采集到。此外，夏季空氣的特征菌屬為不動(dòng)桿菌屬和微球菌屬，冬季典型菌種為芽孢桿菌屬。

3) 保持展廳內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)有助于保持微生物組成的穩(wěn)定，恒溫恒濕、加強(qiáng)展廳空調(diào)送風(fēng)系統(tǒng)的微生物控制工作對(duì)控制博物館小環(huán)境的微生物污染具有重要作用。

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(責(zé)任編輯 潘小倫)

A dynamic study on the species and quantity of microorganisms in the micro-environment, Chongqing China Three Gorges Museum

TANG Huan1, FAN Wen-qi1, WANG Chun1， ZHANG Li-long2

(1.ChongqingChinaThreeGorgesMuseum,Chongqing400015,China; 2.Chongqingcenterfordiseasecontrolandprevention,Chongqing400042,China)

In this study, both traditional colony counting and PCR-DGGE (PCR-Denaturing gradient gel electrophoresis) technology were used to analyze the quantity and species characteristics of microorganisms in the micro-environment, Chongqing China Three Gorges Museum. The results showed that the species and quantity of cultivable microorganism in the air of the museum micro-environment was significantly higher in summer than in winter. Species ofAcinetobacter,Staphylococcus、PseudomonasandAdvenellawere found to predominate. In addition,Acinetobactersp. andMicrococcussp. were dominant in summer whileBacillussp. predominated in winter. The results were helpful in terms of evaluating potential microbial pollution and to providing scientific evidence for preventive protection of exhibited or collected cultural relics in museums.

Museum environment; Preventive conservation; PCR-DGGE; Air microorganisms

2016-01-19；

2016-07-11

重慶中國三峽博物館項(xiàng)目資助(3GM2013-KTZ03)

唐 歡(1979—)，女，2001年畢業(yè)于西南師范大學(xué)生物教育專業(yè)，副研究館員，研究方向?yàn)槲奈镂⑸锊『Ψ乐?，E-mail： tanghuan3gm@163.com

張麗龍，E-mail： tmmulong@sina.com

1005-1538(2017)01-0035-09

K879.2

A