p—ERK在COPD大鼠肺氣腫形成中的表達(dá)研究

漆勇+戴志輝+廖曉斌

摘要：目的 探討在COPD大鼠肺氣腫形成過(guò)程中肺組織磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（p-ERK）的表達(dá)變化。方法 30只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、21d組、28d組，每只各10只。采用香煙煙熏聯(lián)合氣管內(nèi)注入脂多糖的方法建立COPD模型。分別于21d、28d用圖像分析系統(tǒng)測(cè)定肺泡平均內(nèi)襯間隔（MLI）、平均肺泡數(shù)（MAN），用免疫組化法測(cè)定肺組織中p-ERK的表達(dá)。結(jié)果 MLI、MAN、肺組織p-ERK表達(dá)在21d組（70.38±7.14×10-6m，125.64±5.41個(gè)/m2，0.245±0.020）、28d組（96.76±9.07×10-6m，91.02±9.22個(gè)/m2，0.341±0.038）分別與對(duì)照組（47.76±4.27×10-6m，154.61±6.40個(gè)/m2，0.120±0.021）相比有顯著性差異（P<0.01）；21d組、28d組MLI與肺組織p-ERK呈正相關(guān)（分別r=0.770，P<0.01）；21d組、28d組MAN與肺組織p-ERK呈負(fù)相關(guān)（分別r=-0.753，P<0.01）。結(jié)論 p-ERK在肺組織表達(dá)的增高，可能是COPD肺氣腫形成的重要因素之一。

關(guān)鍵詞：磷酸化的細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶；肺疾??；阻塞性；肺氣腫

肺氣腫是慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）重要的病理特征之一，其發(fā)病機(jī)制不完全明確，與炎癥反應(yīng)、蛋白酶-抗蛋白酶失衡等密切相關(guān)[1]。細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ertracellular-signal regulated kinase，ERK）屬于絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）家族，是體內(nèi)多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的匯集點(diǎn)[2]，可以介導(dǎo)氧化應(yīng)激的發(fā)生，炎癥細(xì)胞、炎性介質(zhì)的產(chǎn)生以及蛋白酶的增加等。p-ERK作為ERK的活化形式，目前還未見(jiàn)與COPD肺氣腫關(guān)系的相關(guān)報(bào)道。因此，觀察在COPD大鼠肺氣腫形成過(guò)程中肺組織p-ERK的表達(dá)，可能為防治COPD肺氣腫形成提供新的研究思路。

1 資料與方法

1.1一般資料 脂多糖（LPS）（菌屬O55：B5），北京博奧森生物技術(shù)有限公司；"天下秀"牌香煙（焦油量：11mg，煙氣煙堿量：1.0mg），川渝中煙工業(yè)有限責(zé)任公司；Rabbit Anti-phospho-ERK1/2（Thr202+Tyr204）antibody（bs-3016R），北京博奧森生物技術(shù)有限公司；雄性SD大鼠30只，體重（210±20）g，西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；有機(jī)玻璃煙熏箱，自制；真彩色醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)BI-2000，成都泰盟電子有限公司。

1.2方法 選取30只雄性SD大鼠隨機(jī)分為三組，對(duì)照組：10只，呼吸正常空氣及飼養(yǎng)4w，于第1、15d氣管內(nèi)注入生理鹽水200μl。28d組參照顧延會(huì)[3]的造模方法，在第1、15d經(jīng)氣管注入200μl LPS（200μg/200μl），其余時(shí)間將大鼠放入機(jī)玻璃煙熏箱內(nèi)煙熏天下秀牌香煙，2次/d，30 min/次，香煙12支/次，煙熏至少間隔2 h/次。21d組制備方法同28d組。

1.3肺組織標(biāo)本處理 分別處死各組大鼠，取左肺下葉，用4%多聚甲醛溶液固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片，分別行HE染色、免疫組化染色。在顯微鏡200倍下觀察HE染色的肺組織切片，隨機(jī)選取左、中、右、上、下五個(gè)視野進(jìn)行測(cè)量。標(biāo)記通過(guò)各個(gè)視野中央"十"字交叉線的肺泡間隔數(shù)（Ns），測(cè)出十字交叉線的總長(zhǎng)度（L），采用L/Ns表示各個(gè)視野肺泡平均內(nèi)襯間隔（MLI），反映肺泡的直徑大小。標(biāo)記出每個(gè)視野內(nèi)的肺泡數(shù)（Na），測(cè)出各個(gè)視野的面積（S），采用Na/S表示各個(gè)視野的平均肺泡數(shù)（MAN），反映肺泡的密度改變。檢測(cè)免疫組化染色切片的隨機(jī)3個(gè)視野肺組織p-ERK相對(duì)陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度，計(jì)算p-ERK平均吸光度值（A值）。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組均數(shù)采用單因素方差檢驗(yàn)。Pearson直線相關(guān)分析數(shù)據(jù)相關(guān)性，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HE染色結(jié)果 由圖1～3可見(jiàn)，對(duì)照組（圖1）肺泡結(jié)構(gòu)正常。21d組（圖2）肺泡腔大小不一，少許肺泡壁斷裂，周?chē)梢?jiàn)部分炎細(xì)胞浸潤(rùn)。28d組（圖3）肺泡壁斷裂、肺泡融合、肺泡腔不規(guī)則的擴(kuò)大，周?chē)梢?jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。由表1可見(jiàn)，28d組與對(duì)照組比較，MLI明顯升高，MAN明顯降低（均P<0.01）；21d組與28d組比較，MLI明顯降低，MAN明顯升高（均P<0.01）。

圖1～3大鼠肺泡病理學(xué)改變（HE×200）：對(duì)照組（圖1）、21d組（圖2）、28d組（圖3）。

2.2免疫組化結(jié)果 由圖4～6可見(jiàn)，p-ERK主要表達(dá)在支氣管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞以及肺間質(zhì)細(xì)胞，對(duì)照組（圖4）p-ERK呈低表達(dá)，21d組（圖5）p-ERK表達(dá)較28d組減少，28d組（圖6）p-ERK呈高表達(dá)。由表2可見(jiàn)，28d組與對(duì)照組比較，p-ERK表達(dá)明顯增加（均P<0.01）；21d組與28d組比較，p-ERK表達(dá)明顯減低（均P<0.01）。

圖4～6肺組織中p-ERK表達(dá) （免疫組化×200） 對(duì)照組（圖4）、21d組（圖5）、干預(yù)組（圖6）。

2.3相關(guān)性分析21d組、28d組MLI與肺組織p-ERK呈正相關(guān)（r=0.770，均P<0.01）；21d組、28d組MAN與肺組織p-ERK呈負(fù)相關(guān)（r=-0.753均P<0.01）。

3 討論

COPD的發(fā)病率、死亡率逐漸升高，與肺組織對(duì)香煙煙霧等有害氣體或有害顆粒的異常慢性炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。肺氣腫是COPD的重要病理特征，因此，研究肺氣腫形成機(jī)制成為了當(dāng)今醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)。目前發(fā)現(xiàn)COPD肺氣腫的發(fā)病與炎癥損傷、蛋白酶抗蛋白酶失衡、氧化應(yīng)激、自身免疫反應(yīng)等有關(guān)，但具體發(fā)病機(jī)制并不完全明確，涉及信號(hào)通路的相關(guān)性研究甚少。

ERK家族有5個(gè)亞族，包括ERK1-ERK5，ERK1和ERK2是將信號(hào)從表面受體傳導(dǎo)至細(xì)胞核的關(guān)鍵激酶，p-ERK作為ERK的活化形式，參與細(xì)胞增殖、應(yīng)激反應(yīng)、凋亡等調(diào)控?；罨腅RK可以提高肺內(nèi)中性粒細(xì)胞、白介素-8（IL-8）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的水平[4]，促進(jìn)肺成纖維細(xì)胞對(duì)基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）、MMP-1、MMP-2的分泌[5-6]，介導(dǎo)氧化應(yīng)激的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)顯示，21d組和28d組MLI、MAN、肺組織p-ERK表達(dá)分別與對(duì)照組比較，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。21d組、28d組MLI與肺組織p-ERK呈正相關(guān)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而21d組、28d組MAN與肺組織p-ERK呈負(fù)相關(guān)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明在COPD肺氣腫形成過(guò)程中，p-ERK在肺組織中的表達(dá)增高，提示肺組織p-ERK的表達(dá)在COPD肺氣腫形成過(guò)程中起著重要作用。

綜上所述，p-ERK在肺組織中表達(dá)增高，可能是COPD肺氣腫發(fā)病機(jī)制中重要因素，進(jìn)一步研究p-ERK在COPD在肺氣腫的作用，可能為防治COPD提供新的研究思路。

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編輯/蔡睿琳