TCT聯(lián)合HPV E6/E7 mRNA定量檢測(cè)宮頸上皮內(nèi)瘤變的臨床應(yīng)用價(jià)值

任美英+王翠峰+菅建國(guó)

【摘要】 目的：探討利用HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)婦科子宮頸上皮內(nèi)瘤變的臨床應(yīng)用價(jià)值。方法：對(duì)69例TCT檢查結(jié)果為宮頸上皮內(nèi)瘤變的患者，應(yīng)用HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)技術(shù)對(duì)感染HPV病毒中的癌基因片段E6、E7轉(zhuǎn)錄子做出定量檢測(cè)。結(jié)果：>ASC-H組E6/E7 mRNA轉(zhuǎn)錄陽性率、轉(zhuǎn)錄數(shù)分別為60.6%、（18 285.42±1487.71），均高于≤ASC-H組的33.3%、（2668.43±681.39），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；宮頸細(xì)胞學(xué)檢查為宮頸癌的HPV E6/E7 mRNA轉(zhuǎn)錄數(shù)明顯高于其他類型，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：宮頸上皮內(nèi)瘤變與E6/E7 mRNA轉(zhuǎn)錄具有相關(guān)性，即轉(zhuǎn)錄數(shù)與病變的進(jìn)展程度及細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化密切相關(guān)，在宮頸癌篩查中檢測(cè)HPV E6/E7 mRNA的轉(zhuǎn)錄具有潛在價(jià)值。

【關(guān)鍵詞】 TCT； HPV E6/E7 mRNA定量檢測(cè)； 宮頸上皮內(nèi)瘤變

【Abstract】 Objective：To discuss the clinical application value of quantitative detection the HPV E6/E7 mRNA in cervical intraepithelial neoplasia.Method：In 69 cases of TCT examination results for cervical intraepithelial neoplasia，use of HPV E6/E7 mRNA detection technology for the infection of HPV virus in the cancer gene fragment E6，E7 transcription to make quantitative detection.Result：>ASC-H group HPV E6/ E7 mRNA transcription positive rate （60.6%） was higher than the≤ASC-H group （33.3%），>ASC-H group HPV E6/E7 mRNA transcription number （18 285.42±1487.71） was higher than the ≤ASC-H group （2668.43±681.39），the differences were statistically significant（P<0.05）.Cervical cytological examination for cervical cancer HPV E6/E7 mRNA transcription number was significantly higher than other types，the difference was statistically significant（P<0.05）.Conclusion：The cervical intraepithelial neoplasia is closely related to the E6/E7 mRNA transcription，that is，and that means the HPV E6/E7 mRNA transcription affect the the progression of lesions and malignant transformation of cells，quantitative detection the HPV E6/E7 mRNA has potential clinical application value in the screening of cervical intraepithelial neoplasia.

【Key words】 TCT； Quantitative detection of HPV E6/E7 mRNA； Cervical intraepithelial neoplasias

First-authors address：The First Affiliated Hospital of Baotou Medical College to Inner Mongolia University of Science & Technology，Baotou 014010，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.36.029

研究認(rèn)為單一的宮頸細(xì)胞學(xué)檢查不論是傳統(tǒng)的巴氏涂片還是薄層液基細(xì)胞學(xué)檢查（TCT）對(duì)于宮頸癌前病變和宮頸癌篩查的敏感性均較低[1]。目前研究已證實(shí)，人乳頭瘤病毒（HPV）感染是宮頸癌發(fā)生的主要危險(xiǎn)因素，其中高危型的HPV病毒持續(xù)性感染可導(dǎo)致宮頸癌及癌前病變，HPV E6/E7是病毒癌基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，其表達(dá)可導(dǎo)致宿主細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化[2]，但在大部分HPV感染的病例中病毒會(huì)自動(dòng)清除，只有少部分會(huì)發(fā)展成為對(duì)上皮細(xì)胞的高度損傷[3]。目前文獻(xiàn)[4]研究表明，宮頸細(xì)胞的病變程度不單與病毒類型以及負(fù)荷量相關(guān)，更和病毒的活動(dòng)程度關(guān)系緊密。而病毒癌基因組E6/E7的轉(zhuǎn)錄子mRNA作為病毒活動(dòng)程度的指標(biāo)，其定量檢測(cè)具有非常重要的臨床輔助診斷價(jià)值。有研究建議采用HR-HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)對(duì)ASC-US進(jìn)行分流[5]。本研究為來自包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院婦科就診并同時(shí)行TCT檢查及HPV E6/E7 mRNA定量檢測(cè)854例患者，并對(duì)TCT檢查結(jié)果為宮頸上皮內(nèi)瘤變的69例患者的HPV E6/E7 mRNA定量檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行回顧性分析，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2015年6月-2016年6月就診于本院婦科門診、住院的854患者，年齡18～77歲，臨床表現(xiàn)多為輕或重度宮頸炎癥、宮頸糜爛、不明原因的陰道流血、性交出血，并排除妊娠，取材前3 d內(nèi)無性生活史。所有研究對(duì)象已經(jīng)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均知情同意。endprint

1.2 主要儀器與試劑 QuantiVirusTM診斷試劑盒原材料、QuantiVirusTM冷光儀均由美國(guó)Diaca-rtaLLC公司總部提供。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集及處理 采用專用宮頸細(xì)胞刷收集子宮頸和宮頸鱗柱交界處的脫落細(xì)胞，將頸管細(xì)胞采集刷伸入陰道并抵住宮頸，其前面的刷毛伸入到宮頸管內(nèi)，按順/逆時(shí)針方向轉(zhuǎn)動(dòng)宮頸刷5圈，并立即將其收集到的細(xì)胞保存在專用保存液的瓶子中。

1.3.2 分組 本研究按照宮頸細(xì)胞學(xué)TBS分類法，將宮頸上皮內(nèi)瘤變分為兩組：第一組為>ASC-H組：包括鱗狀細(xì)胞癌（SCC）、腺癌（AC）、高度鱗狀細(xì)胞上皮內(nèi)病變（HSIL）、低度鱗狀細(xì)胞上皮內(nèi)病變（LSIL）；第二組為≤ASC-H組：包括意義不明不典型鱗狀細(xì)胞（ASC-US）、不能除外高度不典型鱗狀上皮細(xì)胞（ASC-H）。

1.3.3 HPV E6/E7 mRNA定量檢測(cè) HPV E6/E7 mRNA定量檢測(cè)使用專利的bDNA技術(shù)，利用專利的探針設(shè)計(jì)捕獲待測(cè)目標(biāo)，再經(jīng)過雜交信號(hào)放大即可定量檢測(cè)病毒，最終通過添加底物產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，以此對(duì)待測(cè)核酸即HPV病毒中的癌基因片段E6、E7轉(zhuǎn)錄子做出定量檢測(cè)，通過轉(zhuǎn)錄數(shù)值來判斷HPV病毒與上皮細(xì)胞整合的情況，從而判斷宮頸癌及癌前病變發(fā)生的可能性。轉(zhuǎn)錄數(shù)大于1000為HPV E6/E7 mRNA定量檢測(cè)陽性，轉(zhuǎn)錄數(shù)1000～4000為低度危險(xiǎn)值；4000～10000為中度危險(xiǎn)值；>10000為高度危險(xiǎn)值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 20.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用 字2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TCT診斷宮頸上皮內(nèi)瘤變細(xì)胞學(xué)及

HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)結(jié)果 854例患者中，TCT檢查結(jié)果為宮頸上皮內(nèi)瘤變的患者有69例，其中36例≤ASC-H組中HPV E6/E7 mRNA轉(zhuǎn)錄陽性者12例，轉(zhuǎn)錄陽性率為33.3%；而33例>ASC-H組中HPV E6/E7 mRNA轉(zhuǎn)錄陽性者20例，轉(zhuǎn)錄陽性率為60.6%，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表1。

2.2 不同宮頸上皮內(nèi)瘤變細(xì)胞學(xué)平均的HPV E6/E7 mRNA轉(zhuǎn)錄數(shù)值 >ASC-H組E6/E7 mRNA轉(zhuǎn)錄數(shù)為（18 285.42±1487.71），高于≤ASC-H組的（2668.43±681.39），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；ASC的HPV E6/E7 mRNA轉(zhuǎn)錄數(shù)為（2668.43±681.39），LSIT為（8416.81±875.62），HSIL為（7129.73±724.38），Ca為（39 309.72±3471.55），宮頸癌的HPV E6/E7 mRNA轉(zhuǎn)錄數(shù)與其他比較明顯偏高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

3 討論

宮頸癌是女性最常見的婦科惡性腫瘤之一，HPV感染是宮頸癌發(fā)生的主要危險(xiǎn)因素。幾乎100%的高級(jí)別CIN以及宮頸癌都合并HPV感染[6]。目前研究表明，宮頸癌是唯一一種經(jīng)過醫(yī)學(xué)干預(yù)能使發(fā)病率和死亡率下降的惡性腫瘤，而預(yù)防和控制的關(guān)鍵是通過篩查早期發(fā)現(xiàn)和治療癌前病變。將液基薄層細(xì)胞檢測(cè)系統(tǒng)（TCT）檢查作為主要手段應(yīng)用于宮頸癌篩查以來，已使宮頸癌的發(fā)生率和死亡率明顯下降[7]。ASC的診斷標(biāo)準(zhǔn)為細(xì)胞出現(xiàn)比單純反應(yīng)性改變更加顯著的異常特征，但未達(dá)到診斷鱗狀上皮內(nèi)病變的程度，其可能提示慢性子宮頸炎、CIN，甚至是宮頸癌[8-9]。故應(yīng)十分重視和加強(qiáng)對(duì)ASC患者及時(shí)、有效地評(píng)價(jià)和管理，防止宮頸浸潤(rùn)癌的發(fā)生。2012年美國(guó)陰道鏡和病理學(xué)會(huì)提出對(duì)于ASC的最佳方案為反饋性HPV檢測(cè)，陽性者行陰道鏡檢查[10]。

本研究則以TCT聯(lián)合目前最先進(jìn)的HPV E6/E7 mRNA定量檢測(cè)對(duì)ASC-US及以上病例進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，既可以使高度病變得到比較及時(shí)的診治，避免漏診，又可以減少臨床負(fù)擔(dān)。目前用于檢測(cè)HPV E6/E7 mRNA水平的方法有核酸序列擴(kuò)增法和支鏈DNA信號(hào)放大技術(shù)，部分市售的試劑檢測(cè)HR-HPVl6、18、31、33、45中E6/E7 mRNA的轉(zhuǎn)錄[11]，而本研究所用試劑可檢測(cè)14種HR-HPV mRNA，故敏感性更高。

病毒癌基因蛋白E6/E7是細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的主要原因，一旦HPV整合入人的基因組，E6/E7 mRNA的表達(dá)將不受限制，其增加到一個(gè)引起惡性轉(zhuǎn)化的水平，檢測(cè)這種致癌基因的轉(zhuǎn)錄具有不必重復(fù)進(jìn)行檢測(cè)即能鑒定高危反復(fù)感染者的潛力[12]，在宮頸疾病早期的檢測(cè)中具有潛在的價(jià)值。

本研究利用QuantiVirusTM檢測(cè)法檢測(cè)

69例宮頸上皮內(nèi)瘤變患者的病毒活動(dòng)程度指標(biāo)HPV E6/E7 mRNA的轉(zhuǎn)錄子，發(fā)現(xiàn)>ASC-H組E6/E7 mRNA轉(zhuǎn)錄陽性率、轉(zhuǎn)錄數(shù)分別為60.6%、（18 285.42±1487.71），均高于≤ASC-H組的33.3%、（2668.43±681.39），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；宮頸癌的HPV E6/E7 mRNA轉(zhuǎn)錄數(shù)高于其他，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

結(jié)果表明，宮頸高度病變與E6/E7 mRNA轉(zhuǎn)錄具有相關(guān)性，即HPV E6/E7 mRNA的轉(zhuǎn)錄與病變的進(jìn)展程度及細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化密切相關(guān)，這與劉桐宇等[13]的研究，隨著細(xì)胞學(xué)級(jí)別增高，E6/E7 mRNA表達(dá)相應(yīng)增加，不同細(xì)胞學(xué)分組間mRNA拷貝值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與黃寶英等[14]的高危HPV E6/E7 mRNA可以應(yīng)用于宮頸癌篩查，在篩查中聯(lián)合HPV E6/E7 mRNA及細(xì)胞學(xué)檢測(cè)有利于提高診斷準(zhǔn)確性的結(jié)論相一致；也與潘嬙微等[15-16]HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)可作為ASC-US患者分流的一種新方法，具有更高的特異性和效能的觀點(diǎn)一致。此外，從本研究結(jié)果中可以看出，在≤ASC-H組中也有HPV E6/E7 mRNA轉(zhuǎn)錄陽性的患者，這應(yīng)當(dāng)引起臨床的重視，他們可能是一些潛在的宮頸癌高?；颊?，而這有待于進(jìn)一步隨訪研究。endprint

總之，這種以專利的bDNA技術(shù)為基礎(chǔ)的HPV E6/E7 mRNA的定量檢測(cè)通過對(duì)HPV E6/E7轉(zhuǎn)錄值的升降來判斷宮頸癌及癌前病變發(fā)生的可能性，具有很好的重復(fù)性和自動(dòng)化前景，王華等[17]也有類似結(jié)論，并認(rèn)為E6/E7 mRNA更適用于宮頸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的評(píng)估。HPV E6/E7 mRNA的定量檢測(cè)為宮頸癌篩查提供了另一條有意義的途徑，其結(jié)果有利于宮頸癌的早期診斷、控制發(fā)展及預(yù)后監(jiān)測(cè)。

參考文獻(xiàn)

[1] Whitlock E P，Vesco K K，Eder M，et al.Liquid-based cytology and human papillomavirus testing to screen for cervical cancer：a systematic review for the US Preventive Services Task Force[J].Annals of Internal Medicine，2011，155（10）：214-215.

[2] Rampias T，Boutati E，Pectasides E，et al.Activation of Wnt Signaling Pathway by Human Papillomavirus E6 and E7 Oncogenes in HPV16-Positive Oropharyngeal Squamous Carcinoma Cells[J].Molecular Cancer Research，2010，8（8）：433-443.

[3] Cuschieri K，Wentzensen N.Human papillomavirus mRNA and p16 detection as biomarkers for the improved diagnosis of cervical neoplasia[J].Cancer Epidern Iol Biomarkers Prev，2008，17（10）：2536-2545.

[4]蘇韻華，許丹，張玉泉.宮頸癌及癌前病變多種篩查方法的研究進(jìn)展[J].實(shí)用婦產(chǎn)科雜志，2009，25（9）：529-530.

[5] Hovland S，Muller S，Skomedal H，et al.E6/E7 mRNA expression analysis：a test for the objective assessment of cervical adenocarcinoma in clinical prognostic procedure[J].Int J Oncol，2010，36（6）：1533-1539.

[6] Dogan N U，Salman M C，Yuce K.The role of HPV DNA testing in the follow-up of cervical intraepithelial neoplasia after loop electrosurgical excision procedure[J].Arch Gynecol Obstet，2011，283（4）：871-877.

[7] Syrj?nen S，Shabalova I P，Petrovichev N，et al.Human papillomavirus testing and conventional pap smear cytology as optional screening tools of women at different risks for cervical cancer in the countries of the former soviet union[J].Journal of Lower Genital Tract Disease，2002，6（2）：97-110.

[8]謝紅，楊菊芳，謝懿，等.宮頸細(xì)胞學(xué)涂片為ASCUS的處理方法探討[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2006，22（6）：699-700.

[9]曾曉琴，武積林，李萍，等.兩種宮頸涂片細(xì)胞學(xué)分類法的應(yīng)用研究[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)（婦幼保健分冊(cè)），2005，16（6）：346-348.

[10] Massad L S，Einstein M H，Huh W K，et al.2012 updated consensus guidelines for the management of abnormal cervical cancer screening tests and cancer precursors[J].J Low Genit Tract Dis，2013，17（5 Suppl 1）：S1-S27.

[11]孫玲玲，陳偉.宮頸細(xì)胞學(xué)不典型鱗狀細(xì)胞診斷及檢測(cè)的研究進(jìn)展[J].實(shí)用婦產(chǎn)科雜志，2013，29（7）：499-502.

[12] Keegan H，Mc I J，Pilkington L，et al.Comparison of HPV detection technologies：Hybrid capture 2，PreTect HPV-Proofer and analysis of HPV DNA viral load in HPV16，HPV18 and HPV33 E6/E7 mRNA positive specimens[J].Journal of Virological Methods，2009，155（1）：61-66.

[13]劉桐宇，謝榕，Lulu Zhang，等.TCT標(biāo)本檢測(cè)高危HPV E6/E7 mRNA及在宮頸病變中的應(yīng)用研究[J].中華婦幼臨床醫(yī)學(xué)雜志電子版，2011，7（3）：166-169.

[14]黃寶英，周倫順，富顯果.HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)對(duì)宮頸癌篩查意義的初步評(píng)價(jià)[J].中華腫瘤防治雜志，2013，20（14）：1061-1064.

[15]潘嬙微，陳育梅，潘嘉佳，等.HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)用于ASC-US患者診斷分流的臨床研究[J].中華計(jì)劃生育學(xué)雜志，2015，23（7）：471-472.

[16]潘嬙微，陳大可，陳育梅，等.HPV E6/E7 mRNA和高危型HPVDNA檢測(cè)在ASC-US患者的臨床應(yīng)用研究[J].浙江醫(yī)學(xué)，2015，37（14）：1199-1201，1254.

[17]王華，陳亞寶，葉麗華，等.應(yīng)用支鏈DNA技術(shù)檢測(cè)人乳頭瘤病毒HPV E6/E7 mRNA在宮頸疾病篩查中的價(jià)值[J].中華臨床醫(yī)師雜志（電子版），2011，5（15）：4362-4366.

（收稿日期：2016-08-18） （本文編輯：張爽）endprint