caspase—3、HSP70表達(dá)在子癇前期發(fā)病機(jī)制中的作用

李延輝+梁媚珍+蔣潔珊

【摘要】 目的：探討子癇前期患者胎盤組織中caspase-3、HSP70的表達(dá)情況及其作用機(jī)制。方法：選擇本院住院治療的子癇前期孕婦45例為研究組，正常孕婦45例為對(duì)照組。收集兩組的胎盤組織標(biāo)本，采用免疫組化法檢測(cè)兩組胎盤組織中caspase-3、HSP70的表達(dá)。結(jié)果：研究組胎盤組織中caspase-3蛋白和HSP70蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率分別為62.2%、55.6%，均顯著高于對(duì)照組的4.4%、11.1%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ 字2=11.65、9.37，P<0.01）。隨著研究組孕婦的病情加重，胎盤組織中caspase-3蛋白和HSP70蛋白表達(dá)均呈上升趨勢(shì)，重度子癇前期孕婦胎盤組織中caspase-3蛋白和HSP70蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率均明顯高于輕度子癇前期孕婦（ 字2=9.91、7.93，P<0.01）。研究組中HSP70蛋白的表達(dá)和caspase-3蛋白的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=0.582，P<0.01）。結(jié)論：caspase-3和HSP70的異常表達(dá)不僅可能參與了子癇前期形成過(guò)程，而且也在子癇前期患者病情進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用，兩者之間可能存在相互作用。

【關(guān)鍵詞】 子癇前期； caspase-3； HSP70； 血管內(nèi)皮細(xì)胞； 凋亡

【Abstract】 Objective：To investigate the expression of caspase-3 and HSP70 in the placenta of patients with preeclampsia and its mechanism.Method：45 preeclampsia pregnant women in our hospital were selected as study group and 45 normal pregnant women as control group.Placental tissue samples were collected，and the expression of caspase-3 and HSP70 in the two groups were detected by immunohistochemical method.Result：The positive expression rates of caspase-3 protein and HSP70 protein in placenta tissue of the study group were 62.2% and 55.6%，respectively，which were significantly higher than 4.4%，11.1% of the control group，the differences were statistically significant（ 字2=11.65，9.37，P<0.01）.The expression of caspase-3 protein and HSP70 protein in placenta tissue were increased with the increase of the severity of the pregnant women in the study group，the positive expression rates of caspase-3 protein and HSP70 protein in placenta of severe preeclampsia were significantly higher than those in mild preeclampsia（ 字2=9.91，7.93，P<0.01）.In the study group，the expression of HSP70 protein and the expression of caspase-3 protein were negatively correlated（r=0.582，P<0.01）.Conclusion：The abnormal expression of caspase-3 and HSP70 may not only be involved in the formation of preeclampsia，but also play an important role in the progression of the disease in patients with preeclampsia，and there may be interactions between them.

【Key words】 Preeclampsia； Caspase-3； HSP70； Vascular endothelial cell； Apoptosis

First-authors address：Shijie Hospital of Dongguan City，Dongguan 523290，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.36.023

子癇前期是妊娠期特有的疾病，母嬰死亡率高，病因復(fù)雜，發(fā)病機(jī)制涉及到多系統(tǒng)、多器官的病理改變，迄今為止其病因和發(fā)病機(jī)制仍不明確[1]。大量研究資料發(fā)現(xiàn)，子癇前期早期發(fā)病已經(jīng)出現(xiàn)胎盤血管內(nèi)皮損傷，多數(shù)研究均認(rèn)同胎盤血管內(nèi)皮損傷和滋養(yǎng)層細(xì)胞功能障礙是子癇前期發(fā)病過(guò)程中的重要機(jī)制。caspase-3是半胱氨酸蛋白酶家族（caspase家族）中調(diào)節(jié)和參與凋亡發(fā)生的一種關(guān)鍵蛋白，其參與調(diào)整凋亡過(guò)程的機(jī)制可能與其被活化激活后具有切斷天冬氨酸殘基后肽鍵的能力有關(guān)[2-3]。HSP70是HSP家族中最保守和最主要的一類，在所有生物細(xì)胞中都有表達(dá)。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)HSP70不僅是細(xì)胞有力的保護(hù)因子，還參與了細(xì)胞凋亡的過(guò)程，HSP70可與凋亡抑制因子（AIF）直接結(jié)合，從而抑制其介導(dǎo)的非caspase依賴性細(xì)胞凋亡[4]。同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)HSP70的高表達(dá)可增強(qiáng)了細(xì)胞抗凋亡能力，并可能通過(guò)下調(diào)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因、蛋白和蛋白酶活性起到拮抗細(xì)胞凋亡的作用，因此HSP70被認(rèn)為是凋亡抑制因子[5]。本研究通過(guò)應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法（SP法）檢測(cè)45例子癇前期孕婦的胎盤組織中caspase-3、HSP70的表達(dá)情況和血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡及其相關(guān)性，旨在為進(jìn)一步研究子癇前期的發(fā)病機(jī)理奠定基礎(chǔ)，為臨床預(yù)防和治療子癇前期患者提供一條嶄新的方向和思路，現(xiàn)報(bào)告如下。endprint

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇本院收治住院的子癇前期孕婦45例為研究組，入選標(biāo)準(zhǔn)：?jiǎn)翁ト焉?，行剖宮產(chǎn)終止妊娠，符合子癇前期診斷標(biāo)準(zhǔn)；排除標(biāo)準(zhǔn)：有多胎妊娠、高血壓、心臟病、腎臟病、慢性肝病等病史以及輸血和免疫治療史的病例。子癇前期診斷標(biāo)準(zhǔn)參考第六版《婦產(chǎn)科學(xué)》，其中輕度子癇前期21例，重度子癇前期24例，平均年齡（30.26±5.65）歲，平均孕周（36.94±1.39）周。另選擇同期本院收治的正常孕婦45例為對(duì)照組，平均年齡（29.19±4.05）歲，平均孕周（37.02±1.67）周。兩組的年齡、孕周等一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。本研究已經(jīng)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)，且患者均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 試劑 SP法（streptavidin-perosidase，兩步法）試劑盒購(gòu)自福建邁新生物技術(shù)有限公司，caspase-3山羊抗人多克隆抗體（工作濃度1∶50）和兔抗人HSP70多克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)cell signal公司。

1.2.2 免疫組織化學(xué)染色 行剖宮產(chǎn)術(shù)后，收集研究組和對(duì)照組孕婦的胎盤組織標(biāo)本，采用免疫組化SP法檢測(cè)兩組胎盤組織中caspase-3、HSP70的表達(dá)。操作程序：將收集的胎盤組織經(jīng)10%中性緩沖甲醛溶液固定，常規(guī)脫水石蠟包埋后，制成石蠟切片，置于60 ℃烤箱內(nèi)烘干60 min，常規(guī)脫蠟、脫水之后進(jìn)行抗原修復(fù)（微波爐加熱），緩沖液沖洗后置于3% H2O2中進(jìn)行滅活，繼續(xù)沖洗后滴加山羊血清工作液進(jìn)行封閉，然后滴加caspase-3或HSP70抗體工作液，濕盒4 ℃過(guò)夜。緩沖液沖洗后滴加辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液，濕盒37 ℃孵育。緩沖液沖洗后采用DAB顯色，光鏡下觀察。光鏡下染色陽(yáng)性結(jié)果判斷：caspase-3定位于胞漿和胞膜內(nèi)，HSP70定位于細(xì)胞胞漿，均呈黃色或棕色顆粒。每張切片隨機(jī)選擇檢查5個(gè)視野，計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞百分率數(shù)綜合判定，計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞率。<10%為陰性（-），10%～50%為（+），>50%為（++），（+）～（++）記為陽(yáng)性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 15.0版統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，兩指標(biāo)之間的關(guān)系分析采用Spearson法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組胎盤組織中caspase-3、HSP70蛋白的表達(dá)比較 研究組胎盤組織中caspase-3蛋白和HSP70蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率分別為62.2%、55.6%，均顯著高于對(duì)照組的4.4%、11.1%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ 字2=11.65，9.37，P<0.01）。隨著研究組孕婦的病情加重，胎盤組織中caspase-3蛋白和HSP70蛋白表達(dá)均呈上升趨勢(shì)，重度子癇前期孕婦胎盤組織中caspase-3蛋白和HSP70蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于輕度子癇前期孕婦，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ 字2=9.91、7.93，P<0.01），見(jiàn)表1。

2.2 caspase-3和HSP70表達(dá)的相關(guān)性 研究組中HSP70蛋白的表達(dá)和caspase-3蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.582，P<0.01）。

3 討論

對(duì)子癇前期發(fā)病機(jī)制的研究一直是產(chǎn)科領(lǐng)域的熱點(diǎn)問(wèn)題，現(xiàn)在通過(guò)對(duì)胎盤組織中血管內(nèi)皮細(xì)胞的變化及凋亡的機(jī)制研究，發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮細(xì)胞受損、結(jié)構(gòu)及功能發(fā)生改變，甚至發(fā)生凋亡，可能是子癇前期發(fā)病至關(guān)重要的環(huán)節(jié)[6]。血管內(nèi)皮細(xì)胞覆蓋于血管內(nèi)表面，隔開(kāi)血管內(nèi)血液和血管平滑肌，一旦它發(fā)生損傷或者凋亡，內(nèi)皮細(xì)胞之間的間隙擴(kuò)大，血液里的蛋白以及液體更容易滲透出血管，激活凝血系統(tǒng)發(fā)生DIC，同時(shí)進(jìn)一步激活并釋放血管活性因子和血管收縮因子，打破血管調(diào)節(jié)細(xì)胞因子之間的平衡，促進(jìn)血管收縮的因子起主要作用，從而血壓升高，全身各系統(tǒng)各臟器血液灌流量減少，最終導(dǎo)致器官病理改變，進(jìn)一步促進(jìn)子癇前期[7-8]。目前血管內(nèi)皮細(xì)胞受損、結(jié)構(gòu)及功能發(fā)生改變，甚至發(fā)生凋亡的具體機(jī)制仍然不清楚[9]。

caspase-3是caspase家族參與調(diào)控凋亡發(fā)生的關(guān)鍵凋亡執(zhí)行者，參與外界各種刺激和誘因引發(fā)的細(xì)胞凋亡的過(guò)程。在caspase-3被刺激激活后，caspase-3能夠發(fā)揮切斷肽鍵的作用，降解細(xì)胞內(nèi)重要的蛋白質(zhì)，激發(fā)細(xì)胞凋亡的發(fā)生[10-11]。有研究結(jié)果提示，caspase-3的活化是血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)通路的早期事件[12-13]，而Zhao等[14]的試驗(yàn)結(jié)果也提示了caspase-3調(diào)控的凋亡信號(hào)通路可能參與了血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡過(guò)程。Du等[15]實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在體外血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)生血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡時(shí)，可以檢測(cè)到細(xì)胞內(nèi)caspase-3表達(dá)量出現(xiàn)明顯升高的情況；而Farber等[16]研究也同樣是體外培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，在應(yīng)用caspase-3抑制劑后，發(fā)生血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生凋亡數(shù)目減少。國(guó)內(nèi)尹曉敏等[17]實(shí)驗(yàn)采用檳榔堿刺激血管內(nèi)皮血細(xì)胞，檢測(cè)到caspase-3表達(dá)和活性均出現(xiàn)顯著上調(diào)現(xiàn)象，隨之實(shí)驗(yàn)細(xì)胞出現(xiàn)大量凋亡。本研究結(jié)果也顯示研究組胎盤組織中caspase-3蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率均顯著高于對(duì)照組的表達(dá)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。提示caspase-3的異常表達(dá)可能參與了子癇前期的發(fā)生過(guò)程。隨著研究組孕婦的病情加重，胎盤組織中caspase-3蛋白表達(dá)均呈上升趨勢(shì)，重度子癇前期孕婦胎盤組織中caspase-3蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于輕度子癇前期孕婦（P<0.01），進(jìn)一步證實(shí)了caspase-3蛋白表達(dá)上調(diào)不僅參與了子癇前期的發(fā)生，更可能是子癇前期患者病情演變和發(fā)展過(guò)程的作用機(jī)制之一[18]。

熱休克蛋白是一組生物體受到各種刺激時(shí)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)分子，具有調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的活性和功能、調(diào)控細(xì)胞的增殖與分化以及維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定等重要生理功能。目前研究最多的是HSP70，研究結(jié)果提示HSP70是細(xì)胞有力的保護(hù)因子，它參與了細(xì)胞周期調(diào)控、增殖、凋亡、分化[19]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)研究組胎盤組織中HSP70蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于對(duì)照組的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。隨著研究組孕婦的病情加重，胎盤組織中HSP70蛋白表達(dá)均呈上升趨勢(shì)，重度子癇前期孕婦胎盤組織中HSP70蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于輕度子癇前期孕婦（P<0.01）。說(shuō)明HSP70的高表達(dá)不僅可能參與了子癇前期形成過(guò)程，而且也在子癇前期患者病情進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用[20]。endprint

目前對(duì)于HSP70在細(xì)胞凋亡調(diào)控過(guò)程中的具體作用機(jī)制尚不明確，其與caspase-3蛋白表達(dá)之間的相互作用也仍不清楚。本研究結(jié)果顯示，研究組中HSP70蛋白的表達(dá)和caspase-3蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.582，P<0.01）。因此，推測(cè)HSP70和caspase-3之間可能存在相互作用，HSP70可能通過(guò)影響caspase-3的表達(dá)及功能而參與細(xì)胞凋亡過(guò)程。因此，深入探討二者在子癇患者胎盤組織中的表達(dá)及其作用機(jī)制，將對(duì)減緩子癇前期的形成及發(fā)展提供新的方向，具有重要的臨床價(jià)值和應(yīng)用前景。

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（收稿日期：2016-08-25） （本文編輯：張爽）endprint