豬流行性腹瀉病毒分離鑒定及其滅活疫苗免疫保護(hù)效果研究

代洪波，岳豐雄，徐宏軍，魏勝男，高 鵬，胡來根

(成都天邦生物制品有限公司，四川成都 610100)

豬流行性腹瀉病毒分離鑒定及其滅活疫苗免疫保護(hù)效果研究

代洪波，岳豐雄，徐宏軍，魏勝男，高 鵬，胡來根

(成都天邦生物制品有限公司，四川成都 610100)

為篩選能用于豬流行性腹瀉病毒(PEDV)疫苗研發(fā)的流行毒株，收集PEDV陽性病料，以Vero細(xì)胞進(jìn)行病毒分離試驗，并對分離毒株進(jìn)行外源病毒檢測、病毒培養(yǎng)特性研究、仔豬毒力試驗及免疫效力試驗等。9份PEDV陽性病料共分離到3株病毒，分別命名為PEDV-SC12、PEDV-JS12、PEDV-JX12。其中PEDV-SC12株存在支原體污染；PEDV-JS12株與PEDV-JX12株均能被PEDV特異性陽性血清中和；PEDV-JS12株能在Vero細(xì)胞上增殖并產(chǎn)生細(xì)胞病變，但適應(yīng)細(xì)胞45代以后病毒培養(yǎng)效價仍然偏低；PEDV-JX12滴度能維持在106.0TCID50/mL以上。PEDV-JX12株毒力試驗顯示，該分離株能夠通過人工感染復(fù)制出腹瀉病例，并能從發(fā)病動物體內(nèi)檢測到感染的病毒。免疫攻毒保護(hù)試驗顯示，以PEDV-JX12株制備的滅活疫苗免疫母豬，對所產(chǎn)仔豬攻毒后免疫組6.25%(1/16)發(fā)病，對照組100%(8/8)發(fā)病。說明PEDV-JX12株能夠適應(yīng)細(xì)胞培養(yǎng)，免疫接種母豬能給仔豬提供有效保護(hù)，可以用于PEDV流行毒株的疫苗研發(fā)。

豬流行性腹瀉病毒；分離鑒定；毒力試驗；免疫效力試驗

豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的急性、高度傳染性的腸道疾病，臨床上主要以嚴(yán)重嘔吐、水樣腹瀉及脫水為特征，感染仔豬病死率極高。1971年，豬病毒性腹瀉病毒首先在英國被報道，主要引起架子豬和育肥豬急性腹瀉，當(dāng)時被稱為“流行性病毒性腹瀉”。1977年首次報道該病可侵害哺乳仔豬，癥狀與豬傳染性胃腸炎相似，在排除了豬傳染性胃腸炎病毒和其他病原以后，將其命名為2型腹瀉，以與早期發(fā)現(xiàn)的1型腹瀉區(qū)別，隨后分離得到該病的病原，命名為CV777[1-2]。1982年統(tǒng)一命名為“豬流行性腹瀉”。之后該病在歐洲、東亞、東南亞、北美洲等的許多國家均有報道[3-5]。

PEDV屬冠狀病毒，只有1個血清型，可以在Vero細(xì)胞上增殖，但小牛血清會抑制PEDV與細(xì)胞受體的結(jié)合。在培養(yǎng)液中添加一定量的胰酶，可以促進(jìn)PEDV在Vero上產(chǎn)生明顯的細(xì)胞病變[6]。2010年以來，中國暴發(fā)大規(guī)模豬腹瀉疫情，證實主要病原為PEDV。近期流行的PEDV毒株與早期我國流行的PEDV相比產(chǎn)生了明顯的變異[7]，疫情之初通過提高CV777疫苗毒株的病毒含量制備滅活疫苗，可以給豬群提供一定的免疫保護(hù)。本試驗利用全國收集的多份PEDV陽性病料進(jìn)行病原分離鑒定，并開展毒力與保護(hù)效力研究，旨在篩選能夠用于PEDV疫苗研發(fā)的流行毒株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 PEDV膠體金檢測試劑盒，安捷公司產(chǎn)品；病毒基因組RNA提取試劑盒、病毒基因組DNA提取試劑盒、2×TaqPCR Master Mix、DNA Marker DL 2 000等，天根生物公司產(chǎn)品；DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液、新生牛血清等，Gibco公司產(chǎn)品；0.22 μm濾器，默克公司產(chǎn)品；Vero細(xì)胞、PEDV特異性陽性血清(中和效價大于1∶16)由成都天邦生物制品有限公司提供。

1.1.2 試驗用動物 PEDV非免疫母豬所產(chǎn)3日齡仔豬12頭，PEDV抗原抗體陰性妊娠母豬4頭，篩選自成都周邊養(yǎng)殖場。

1.2 方法

1.2.1 病毒分離 從四川、江西、湖北、江蘇、廣西等地共收集PEDV抗原陽性病料9份，將腸系膜淋巴結(jié)與小腸黏膜加液氮混合研磨，組織懸液凍融3次后8 000 r/min離心10 min，取上清加入雙抗至終濃度1 000 IU/mL處理過夜；接種單層Vero細(xì)胞，加含胰酶(3 μg/mL)的無血清DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液，置37℃二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 d～3 d，觀察細(xì)胞病變。凍融細(xì)胞收集細(xì)胞培養(yǎng)液即病毒液進(jìn)行傳代培養(yǎng)。1.2.2 病毒核酸檢測 以病毒基因組RNA提取試劑盒提取病毒液RNA，以豬流行性腹瀉病毒(PEDV)S基因RT-PCR檢測方法進(jìn)行PEDV核酸檢測，目的片段大小為651 bp，引物序列如下：PEDV-S1：5′-TTCTGAGTCACGAACAGCCA-3′；PEDV-S2：5′-CATATGCAGCCTGCTCTGAA-3′。引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。

分別以本實驗室建立的豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬傳染性胃腸炎病毒及豬輪狀病毒的RT-PCR檢測方法進(jìn)行病原檢測。以病毒基因組DNA提取試劑盒提取病毒液DNA，進(jìn)行偽狂犬病毒、豬圓環(huán)病毒2型、豬細(xì)小病毒及支原體PCR檢測。1.2.3 細(xì)胞適應(yīng)性試驗 病毒分離株在Vero細(xì)胞上傳代至產(chǎn)生穩(wěn)定細(xì)胞病變后，繼續(xù)在Vero細(xì)胞上進(jìn)行細(xì)胞傳代適應(yīng)，選取不同代次的病毒培養(yǎng)液，以96孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)的Vero細(xì)胞進(jìn)行病毒TCID50測定。

1.2.4 病毒中和試驗 常規(guī)方法消化Vero細(xì)胞，制備2×105個/mL的細(xì)胞懸液接種24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待24孔板長成單層細(xì)胞后，以無血清DMEM培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞1次～2次備用。將分離的病毒液稀釋至103.0TCID50/mL，與等體積滅活后的PEDV特異性陽性血清混合，置37℃水浴中和1 h，同時設(shè)立病毒陽性對照與血清對照。中和完成后將樣品接種到洗滌后的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每個樣品接種4孔，每孔接種0.2 mL，設(shè)立正常細(xì)胞對照孔，加樣完成后置37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中吸附1 h。吸附完成后，以無血清DMEM培養(yǎng)液洗滌2次～3次，補(bǔ)加含胰酶無血清MEME培養(yǎng)液，置37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d～5 d，觀察并記錄細(xì)胞病變孔數(shù)。

1.2.5 仔豬毒力試驗 選取PEDV非免疫母豬所產(chǎn)3日齡仔豬12頭，隨機(jī)分為3組，每組4頭，在隔離器內(nèi)離乳飼養(yǎng)。試驗1組，每頭口服接種分離株F8代病毒液1 mL；試驗2組，每頭口服接種分離株F10代病毒液1 mL；對照組口服接種含胰酶無血清DMEM培養(yǎng)液1 mL。接種完成后連續(xù)觀察5 d，記錄試驗豬發(fā)病信息，試驗分組信息見表1。

1.2.6 PEDV滅活疫苗制備 以Vero細(xì)胞繁殖分離的PEDV，制備病毒含量高于106.0TCID50/mL的PEDV半成品抗原，以5 mmol/L的BEI滅活24 h制備PEDV滅活抗原并進(jìn)行滅活檢驗。滅活檢驗合格后，以鋁膠佐劑制備PEDV滅活疫苗。

1.2.7 PEDV滅活疫苗免疫攻毒保護(hù)試驗 篩選PEDV抗原抗體陰性妊娠母豬4頭，隨機(jī)分為2組，免疫組2頭母豬分別在產(chǎn)前40 d與產(chǎn)前15 d，分別進(jìn)行一次后海穴PEDV滅活疫苗接種，每頭4 mL；對照組2頭母豬后海穴接種DMEM培養(yǎng)液，每頭4 mL。母豬產(chǎn)仔以后，將母豬與仔豬回購至成都天邦試驗動物中心進(jìn)行攻毒保護(hù)試驗，免疫組2頭母豬各選8頭仔豬進(jìn)行攻毒試驗，對照組選用其中1頭母豬及8頭仔豬進(jìn)行攻毒試驗，3日齡口服接種105.0TCID50的PEDV F8代病毒液。攻毒完成后連續(xù)觀察5 d，記錄試驗仔豬發(fā)病信息，試驗分組與免疫攻毒信息見表2。

表1 仔豬毒力試驗分組信息

表2 PEDV滅活疫苗免疫攻毒保護(hù)試驗信息

1.2.8 試驗豬腹瀉發(fā)病要求 PEDV攻毒試驗豬發(fā)病要求：所有試驗豬攻毒后連續(xù)觀察5 d，每隔6 h觀察記錄1次是否出現(xiàn)腹瀉癥狀，出現(xiàn)腹瀉后36 h剖解試驗豬觀察腸道病變；剖檢攻毒期內(nèi)死亡仔豬，觀察期結(jié)束后剖解所有存活仔豬，觀察腸道病變:①觀察期內(nèi)有3次及以上腹瀉；②試驗豬剖解觀察，腸道充氣，腸壁變??；③腹瀉試驗豬腸內(nèi)容物PEDV膠體金檢測為陽性。同時符合以上3個條件時判定為腹瀉發(fā)病。

2 結(jié)果

2.1 病毒分離結(jié)果

從9份PEDV陽性病料中共成功分離到3株病毒，分別命名為PEDV-SC12、PEDV-JS12、PEDV-JX12。PEDC-SC12株傳至F7代以后可見細(xì)胞病變，PEDV-JS12株連續(xù)傳至F10代以后可見穩(wěn)定的細(xì)胞病變，PEDV-JX12株傳至F8代以后可見典型細(xì)胞病變。病毒接種細(xì)胞后36 h左右，細(xì)胞開始出現(xiàn)原位死亡(圖1)；接毒后48 h左右，90%以上細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞病變。

2.2 病毒核酸檢測結(jié)果

分離株產(chǎn)生細(xì)胞病變前每隔2代進(jìn)行一次PEDV核酸檢測，結(jié)果顯示9分樣品中有4份樣品在F4代時檢測不到PEDV核酸，有2份樣品在F6代時檢測不到PEDV核酸。PEDV-SC12株在F7代可見細(xì)胞病變，但在PEDV-SC12病毒液中檢測到支原體污染。PEDV-JS12株與PEDV-JX12株在出現(xiàn)細(xì)胞病變以后，選取連續(xù)兩代的病毒液進(jìn)行病毒核酸檢測，僅PEDV核酸檢測為陽性，無外源病毒與支原體污染。分離毒株病毒核酸檢測結(jié)果見表3；PEDV核酸檢測結(jié)果見圖2。

A.Vero 細(xì)胞對照； B.Vero細(xì)胞病變

毒株Strains代次Generation檢測項目TestitemPEDVCSFVPRRSVTGEVPRoVPRVPCV2PPVMycoplasmaPEDV?SC12F7+-------+F8+-------+PEDV?JS12F10+--------F11+--------PEDV?JX12F8+--------F9+--------

注：“+”表示陽性；“-”表示陰性。

Note:“+”means positive；“-”means negative.

2.3 病毒細(xì)胞適應(yīng)性試驗結(jié)果

PEDV-JS12株與PEDV-JX12株產(chǎn)生穩(wěn)定細(xì)胞病變以后，連續(xù)傳代至F45代，每隔5代進(jìn)行1次病毒含量測定。結(jié)果顯示，PEDV-JS12株連續(xù)傳代至F45代，病毒含量維持在104.5～5.0TCID50/mL左右；PEDV-JX12株從F35代至F45代，病毒含量維持在106.0TCID50/mL以上。PEDV分離株不同代次病毒含量測定結(jié)果見圖3。

2.4 病毒中和試驗結(jié)果

選用PEDV-JS12株與PEDV-JX12株的F10代與F12代病毒液進(jìn)行病毒微量中和試驗，結(jié)果顯示，2個分離株F10代病毒液與F12代病毒液接種所有細(xì)胞孔均產(chǎn)生細(xì)胞病變，血清對照與細(xì)胞對照孔未見細(xì)胞病變，F(xiàn)10代中和樣品與F12代中和樣品接種的細(xì)胞孔均未見細(xì)胞病變，說明分離毒株能夠被PEDV特異性陽性血清完全中和。試驗結(jié)果見表4。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；N.陰性對照；P.陽性對照；SC7.PEDV-SC12 F7；SC8.PEDV-SC12 F8；JS10.PEDV-JS12 F10；JS11.PEDV-JS12 F11；JX8.PEDV-JX12 F8；JX9.PEDV-JX12 F9

M.DNA Marker DL 2 000; N.Ngetive control; P.Positive control; SC7.PEDV-SC12 F7; SC8.PEDV-SC12 F8; JS10.PEDV-JS12 F10; JS11.PEDV-JS12 F11; JX8.PEDV-JX12 F8; JX9.PEDV-JX12 F9

圖2 PEDV核酸檢測電泳圖

Fig.2 PCR detection results of PEDV

圖3 PEDV分離株不同代次病毒含量測定結(jié)果

2.5 仔豬毒力試驗結(jié)果

以PEDV-JX12株F8代與F10代病毒液進(jìn)行動物回歸試驗，結(jié)果顯示，F(xiàn)8代與F10代病毒液分別接種4頭試驗仔豬，4頭仔豬表現(xiàn)均符合腹瀉發(fā)病要求；對照組4頭仔豬口服DMEM培養(yǎng)液，均未發(fā)病。動物回歸試驗結(jié)果見表5；仔豬剖檢圖片見圖4。

表4 病毒中和試驗結(jié)果

A.攻毒仔豬腸道病變；B.對照組仔豬腸道

2.6 PEDV滅活疫苗免疫攻毒保護(hù)試驗結(jié)果

以PEDV-JX12株制備滅活疫苗免疫母豬，以免疫母豬生產(chǎn)仔豬進(jìn)行攻毒保護(hù)試驗。結(jié)果顯示，免疫組M-1母豬所產(chǎn)仔豬攻毒后，有1頭出現(xiàn)腹瀉癥狀，12.5%(1/8)發(fā)病，87.5%(7/8)保護(hù)；免疫組M-2母豬所產(chǎn)仔豬攻毒后，無(0/8)發(fā)病，100%(8/8)保護(hù)；對照組全部(8/8)發(fā)病，37.5%(3/8)死亡。PEDV滅活疫苗免疫攻毒保護(hù)試驗結(jié)果見表6。

表6 PEDV滅活疫苗免疫攻毒保護(hù)試驗結(jié)果

3 討論

2010年以來，中國暴發(fā)大范圍的仔豬腹瀉疫情，主要表現(xiàn)為產(chǎn)房仔豬高發(fā)病率、高病死率，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。通過對全國范圍內(nèi)的幾百個養(yǎng)殖場進(jìn)行病原檢測證實，引起本次疫情的主要病原為PEDV，并且病原產(chǎn)生了較大的變異，母豬免疫接種PEDV CV777滅活疫苗后，仔豬發(fā)病率和死亡率低于未免疫豬群，但不能提供完全保護(hù)。何啟蓋等分別對我國不同省份的數(shù)10個豬場進(jìn)行PEDV病原監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，2010年以后，流行的PEDV毒株與我國早期分離病毒的S基因序列同源性為95%左右，與我國廣泛使用的CV777疫苗毒同源性為93%左右[8-9]。近期流行毒株與我國早期流行毒株的S基因氨基酸序列比較發(fā)現(xiàn)，部分氨基酸位點發(fā)生突變，破壞了部分糖基化位點，并產(chǎn)生部分新的糖基化位點，同時部分中和表位關(guān)鍵性氨基酸位點也存在突變[10]。

本次試驗從全國不同省份采集的9份PEDV陽性病料中分離到3株P(guān)EDV，然而PEDV-SC12株存在支原體污染，PEDV-JS12株與PEDV-JX12株無外源污染，并且能夠在Vero細(xì)胞上產(chǎn)生穩(wěn)定的細(xì)胞病變，可以用作疫苗研發(fā)的備選毒株。然而疫苗生產(chǎn)中需要考慮半成品的效價，PEDV-JS12株在Vero細(xì)胞連續(xù)傳代至F45代，病毒含量維持在104.5～5.0TCID50/mL左右，而PEDV-JX12株傳代至F35代以后，病毒含量維持在106.0TCID50/mL以上，兩株病毒相比，PEDV-JX12株更適合疫苗生產(chǎn)。以PEDV-JX12株進(jìn)行仔豬毒力試驗，F(xiàn)8代與F10代接種3日齡仔豬全部發(fā)病，能夠復(fù)制出典型的腹瀉病例，可以作為疫苗免疫后檢驗用的強(qiáng)毒。

PEDV感染主要引起10日齡以內(nèi)仔豬死亡，如何給仔豬提供有效保護(hù)是PEDV疫苗研發(fā)的關(guān)鍵。給仔豬接種疫苗進(jìn)行主動免疫，難以在短時間內(nèi)形成有效保護(hù)。因此，只能通過疫苗免疫母豬群，使仔豬獲得被動保護(hù)。母豬通過乳汁將分泌性IgA(SIgA)與IgG抗體傳遞給仔豬，分泌性IgA具有分泌片結(jié)構(gòu)，可以防止抗體在胃腸道內(nèi)降解，而且PEDV在腸道內(nèi)的免疫保護(hù)主要依靠黏膜，因此提高母豬乳汁中的SIgA水平，就能夠提高對仔豬群的免疫保護(hù)。通過肌肉注射難以激活母豬的腸道黏膜免疫，我國主要通過后海穴注射進(jìn)行PEDV的疫苗免疫，后海穴分為皮下區(qū)和直腸肛管外膜區(qū)，在直腸肛管外膜區(qū)分布有大量的腸相關(guān)淋巴組織(GALT)，后海穴免疫可以直接將抗原注射到GALT，可以激活黏膜免疫，同時可以避免抗原進(jìn)入血液循環(huán)，造成抗原稀釋和抗原降解[11-12]。本試驗以PEDV-JX12株制備的滅活疫苗，給PEDV陰性母豬產(chǎn)前免疫2次，對生產(chǎn)仔豬進(jìn)行攻毒試驗。結(jié)果顯示免疫組6.25%(1/16)發(fā)病，對照組全部(8/8)發(fā)病，說明該滅活疫苗母豬產(chǎn)前后海穴免疫2次，能夠給仔豬群提供較為理想的被動免疫保護(hù)。就我國目前的現(xiàn)狀來說，發(fā)生過腹瀉的豬場母豬腸道黏膜免疫已被激活，產(chǎn)生效應(yīng)B細(xì)胞和記憶細(xì)胞，再次以PEDV滅活疫苗免疫，記憶細(xì)胞迅速被激活，產(chǎn)生高水平的IgA，可以給仔豬群提供更好的免疫保護(hù)。未感染過PEDV的豬場及后備豬群，需要通過后海穴免疫刺激黏膜免疫，再通過增加免疫次數(shù)的方式，提高母豬群的免疫水平，以便給仔豬提供更好的免疫保護(hù)。

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Isolation and Identification of Porcine Epidemic Diarrhea Virus Epidemic Strain and Study on Its Immune Protection Efficacy of Inactivated Vaccine

DAI Hong-bo,YUE Feng-xiong,XU Hong-jun,WEI Sheng-nan,GAO Peng,HU Lai-gen

(ChengduTecbondBiologicalProductsCo.,Ltd,Chengdu,Sichuan，610100，China)

In order to isolate one porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) epidemic strain for vaccine research,the samples infected with PEDV were collected from different provinces of China,viruses were isolated from Vero cells,and went through SN test,RT-PCR and the characteristics of virus culture.3 strains of virus were isolated from 9 PEDV positive samples,named as PEDV-SC12,PEDV-JS12,and PEDV-JX12.The PEDV-SC12 strain was contaminated with mycoplasma.Both PEDV-JS12 and PEDV-JX12 strains can be neutralized by PEDV positive serum,but after being cultured for 45 generations,PEDV-JS12’s titer is much lower than PEDV-JX12’s.The virulence of PEDV-JX12 was tested by challenging piglets,and diarrhea can be observed in the infected piglets.Sows immunized with PEDV-JX12 inactivated vaccine,1/16 can be observed with diarrhea in the immune group,while 8/8 in the control group.The isolated PEDV-JX12 strain can be used as epidemic strain for PEDV vaccine research.

Porcine epidemic diarrhea virus; isolation and identification; virulence test; immune efficacy test

2016-05-31

代洪波(1988-)，男，四川德陽人，碩士，主要從事動物傳染病病原分子生物學(xué)研究。

S852.659.6;S858.28

A

1007-5038(2017)01-0050-06