中藥多糖提取測量研究進(jìn)展*

張蕊馨 齊 彥 周迎春

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院·150040）

中藥多糖提取測量研究進(jìn)展*

張蕊馨 齊 彥**周迎春

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院·150040）

目的：對中藥糖的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。方法：查閱相關(guān)文獻(xiàn)，對中藥多糖提純工藝、含量測定等方面進(jìn)行總結(jié)。結(jié)果：中藥多糖可用用合理的工藝提取，適宜的方法測定。結(jié)論：可為中藥多糖的進(jìn)一步開發(fā)研究提供科學(xué)依據(jù)。

中藥多糖 提純工藝 含量測定

多糖及糖復(fù)合物存在于一切細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)中，參與生命現(xiàn)象中細(xì)胞的各種活動。因此，中藥多糖在生命科學(xué)、藥物研究中的研究意義深遠(yuǎn)。

1 中藥多糖的提取、分離和純化概述

1.1 提取工藝概述

多糖是極性大分子化合物，易溶于水，不溶于乙醇。常用的方法有水提法、酸提法、堿提法、超聲提法、微波提法等。

1.1.1 水提法 提取多糖最常用的方法之一是用水來作溶劑。植物多糖采用熱水浸提法提取較適宜，提取得到的溶液可直接分離不溶物，用濃度高的乙醇沉淀提純亦可；還可以利用乙醇濃度的不同，分級分離多糖的不同組分。梁婷婷等[1]研究了水提醇沉提取太子參多糖的最佳工藝條件。雖然水提法不需特殊設(shè)備，成本低等，但費(fèi)時且提取效率低。

1.1.2 酸提法 對一些特定的植物多糖提取，用稀酸提取能獲得更高的提取率。但為避免引起多糖中糖苷鍵的斷裂，需嚴(yán)格控制酸度。孟憲元等[2]利用稀酸提取得純度較高茜草多糖。

1.1.3 堿提法 為了得到更高的提取率，可在堿液中提取含有糖醛酸的多糖及酸性多糖。李平等[3]利用堿法提取山茱萸多糖，得褐色山茱萸粗多糖。但為避免有些多糖在堿性較強(qiáng)時發(fā)生水解,堿的濃度應(yīng)合理控制。

1.1.4 超聲提取法 為了使提取的有效成分易于溶解于溶劑之中，可利用能產(chǎn)生“空化作用”及其次級效應(yīng)的超聲波，使生物細(xì)胞和組織易于破碎；這樣可大大加速了萃取過程，有利于被提取成分的生物活性盡量保持不變。胡斌杰[4]等利用超聲波法與傳統(tǒng)熱水法提取靈芝多糖。發(fā)現(xiàn)超聲波法提取時間較傳統(tǒng)熱水法縮短3/4，而提取率高30%。

1.1.5 微波提取法 不同的物質(zhì)，微波吸收能力也不同，因此，吸收微波能力強(qiáng)的基體中某些物質(zhì)，或萃取體系中的某種組分，會被加熱，從基體或體系中分離出來，這是微波提取法的機(jī)制。劉青梅進(jìn)行了紫菜多糖微波提取的影響因素研究。表明影響微波浸提的主要因素為浸提時間、微波功率和液固質(zhì)量比。

1.1.6 生物酶解提取法 生物酶的特點(diǎn)是具有高度專一性，若作為浸提輔助劑，有利于中藥植物的細(xì)胞壁降解或水解，從而易于提取細(xì)胞內(nèi)有效成分。但是，中藥多糖用酶解法提取，對反應(yīng)的溫度以及pH值等參數(shù)的要求嚴(yán)苛，需預(yù)實(shí)驗(yàn)確定合理參數(shù)。張弛[5]等利用酶法技術(shù)提取板黨多糖，以纖維素酶提取的最優(yōu)工藝為：酶用量120U/g干粉、pH4.0、溫度40℃、酶解時間150min，提取率為28.22%。

1.2 分離和純化概述

1.2.1 多糖的分離 （1）除蛋白質(zhì)：游離蛋白質(zhì)在多糖中的去除方法依據(jù)多糖的類型而異，對于微生物類多糖的分離常用Sevag法及三氟三氯乙烷法處理，對于植物類多糖分離的可用三氯醋酸法處理；而對于糖肽類，則需用酶破壞蛋白質(zhì)與糖的結(jié)合再去除。

（2）除色素：多糖提取過程中常伴隨氧化作用，會產(chǎn)生色素，而多糖的含量測定時，色譜分析的準(zhǔn)確性會受到色素干擾。因此需要除去色素，常用方法有活性炭吸附法、離子交換法、氧化劑氧化法等。

（3）除小分子雜質(zhì)：去除小分子雜質(zhì)，常用超濾和透析的方法。若要將多糖樣品按分子大小分級，可選用不同規(guī)格的超濾膜和透析袋進(jìn)行，或一定條件下的超速離心操作來實(shí)現(xiàn)。

1.2.2 多糖的純化 （1）沉淀法：利用在不同濃度低級醇、酮中，多糖溶解度不同的性質(zhì)，可以實(shí)現(xiàn)分級沉淀。李卷梅[6]等用乙醇分級沉淀法純化香薷多糖。向多糖提物中依次加入6組體積分?jǐn)?shù)分別為20%～70%的乙醇，純化后得香薷多糖組分HMP-1、HMP-2、HMP-3、HMP-4、HMP-5和HMP-6，糖含量中等。

依據(jù)不同鹽濃度中，不同多糖溶解度不同，而將多糖分離稱鹽析法。氯化鈉、氯化鉀、硫酸銨等常用作鹽析劑,其中硫酸銨效果最佳。而對于各種不同酸性多糖，可通過控制季胺鹽的濃度分離得到。何偉珍[7]等對用季銨鹽沉淀法純化銀耳粗多糖。加2%CTAB溶液于提取液可得純化產(chǎn)率37.4%的精品銀耳多糖，且多糖含量由50.5%增加到76.28%。

常用斐林試劑、氯化銅、氫氧化鋇和醋酸鉛等作絡(luò)合劑與多糖形成金屬絡(luò)合物而沉淀分離，也是一種有效的方法。

（2）柱層析法：選擇不同濃度的鹽溶液和緩沖溶液，作為洗脫劑，采用葡聚糖凝膠和瓊脂糖凝膠的柱層析法，可分離純化大小不同的多糖分子。但處理粘多糖效果不佳。

為了處理各種酸性、中性多糖和粘多糖，可選擇不同濃度堿型和硼砂型兩種洗脫劑，采用DEAE-纖維素和ECTEOLA-纖維素的陰離子交換劑柱層析法，其過程中能夠吸附雜質(zhì)而達(dá)到部分純化的效果。

（3）其他方法：若按多糖的電荷性質(zhì)不同分級，可采用區(qū)域電泳法純化多糖。聚丙烯酰胺凝膠電泳、乙酸纖維素薄膜電泳是比較常用的方法。

2 中藥多糖含量測定概述

2.1 多糖測定方法

2.1.1 比色法 目前苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法應(yīng)用最廣。多糖含量的比色測定法，其作用機(jī)制是多糖在濃硫酸的作用下先被水解成單糖，然后生成糖醛衍生物，再與苯酚或者葸酮縮合產(chǎn)生有色化合物。這里利用了吸收值與糖濃度存在的線性關(guān)系，在一定濃度范圍內(nèi)和適當(dāng)波長下，可以通過比色測定其含量。梁麗軍[8]等用蒽酮-硫酸法建立大蒜多糖的含量測定方法。

2.1.2 滴定法 滴定法的作用機(jī)制是在酸性環(huán)境及適宜溫度下，可以水解經(jīng)乙醇沉淀分離后的多糖成單糖，然后使用次甲基藍(lán)指示劑，對標(biāo)定過的堿性酒石酸銅溶液進(jìn)行滴定，測量樣液體積的消耗量，以此計(jì)算其含量多少。該方法速度快,無需精密儀器，適用于所有多糖，但是，滴定法伴隨著還原反應(yīng)，還原糖會影響其結(jié)果。陳廣東[9]等采用高錳酸鉀滴定法快速測定肝速康膠囊中云芝多糖的含量。表明了高錳酸鉀滴定法簡單、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好。

2.1.3 薄層色譜法 薄層色譜是利用樣品組分的差異與吸附劑之間的吸附力不同，而且其分配系數(shù)在展層溶劑中亦不相同，從而使混合物出現(xiàn)分離。薄層層析的特點(diǎn)是樣品需要量較少，設(shè)備操作簡便，分離效果好。王亞娟[10]等建立了雙波長薄層掃描法測定烏靈膠囊中多糖含量的方法。結(jié)果顯示該方法測定烏靈膠囊中多糖的含量，操作簡便，重復(fù)性好，結(jié)果可靠。

2.1.4 高效液相色譜法（HPLC法) HPLC法既能測定樣品中多糖的含量，也能測量分子量分布。HPLC作用機(jī)制是選用TSK、SW凝膠排斥色譜柱，以分子量不同的標(biāo)準(zhǔn)右旋糖酐作標(biāo)準(zhǔn)，在示差折光檢測器中檢測經(jīng)簡單預(yù)處理的樣品。HPLC法具有諸多優(yōu)點(diǎn)，如分析快速、選擇性強(qiáng)、分離效能高、靈敏度高等。強(qiáng)靜等[12]采用HPLCELSD法測定多糖的含量。其條件為：漢邦KromasilC18分析柱(250mm×4.6mm，5μm)；柱溫30℃；流動相為(5:95)；流速0.8ml/min；檢測器漂移管溫度115℃；進(jìn)樣量20μl；分析時間5min。

2.1.5 氣相色譜法(GC法) 若要既定性又定量分析多糖的組分及含量，就選用GC法。該方法的操作是先用鹽酸-甲醇把多糖酸水解物或甲醇解物，再用三氟乙?；?TFA)轉(zhuǎn)化為乙?；a(chǎn)物，或者三甲基硅烷基化(TMS)轉(zhuǎn)化為硅烷化產(chǎn)物，然后用氣相色譜分析處理。吳韶輝[12]等采用三氟乙酸水解豌豆根尖黏液中的多糖。使用氣相色譜分離測定了衍生化后的6種單糖。

2.1.6 高效毛細(xì)管電泳(HPCE法) 近年來，人們開發(fā)了對多糖進(jìn)行分析的高效毛細(xì)管電泳法，取得更好的效果。高現(xiàn)朝[13]等采用高效毛細(xì)管電泳法分析百合多糖的單糖組成。表明高效毛細(xì)管電泳法用于分析多糖的組成，精度高，操作方便。

此外，多糖分析還有其他方法可用。而且隨著檢測儀器愈來愈先進(jìn)，多糖含量檢測將變得更簡便、快速、準(zhǔn)確。常靜[14]等利用傅里葉變換紅外光譜儀(FTIR)對不同等級貴州靈芝的紅外光譜進(jìn)行了測定。結(jié)果表明可用紅外光譜法來預(yù)測靈芝多糖含量。

2.2 多糖定量測定方法存在問題的解決方法

2.2.1 多糖的提取分離純化問題與雜質(zhì)干擾問題的解決

對于還原性雜質(zhì)的干擾，一般的做法是先分別測定總糖和單糖，再用總糖量減去單糖量的方法排除，但是這種處理無法從根本上解決雜質(zhì)干擾問題。

若要多糖定量測定結(jié)果準(zhǔn)確，需要多糖的提取分離純化、雜質(zhì)檢查、純度鑒別，得到無雜質(zhì)純度高的多糖，再選擇不同的定量測定方法。

若定量測定要求不高時，可以用比色法進(jìn)行測定精制粗多糖；而當(dāng)定量測定要求較高時，精制粗多糖就需要采取多種方法分離純化，獲得純多糖，再進(jìn)行定量測定才能得到可靠結(jié)果。

2.2.2 設(shè)備問題和測量值與真實(shí)值偏差問題的解決

蒽酮-硫酸法和苯酚-硫酸法測定多糖含量雖然應(yīng)用較多，但是，若測定復(fù)雜的糖類化合物，需改良傳統(tǒng)比色法，才能解決多糖定量測定中存在的問題。此外，若提高中藥多糖測定的準(zhǔn)確性，也需要應(yīng)用精密儀器在高效液相色譜法、氣相色譜法、毛細(xì)管電泳法等方法中才能滿足要求。

3 結(jié)語

通過文獻(xiàn)綜述，旨在為中藥多糖在藥物學(xué)和分子生物學(xué)領(lǐng)域中的進(jìn)一步應(yīng)用研究提供了科學(xué)依據(jù)，相信更多中藥多糖的研究將成為人類疾病治療探索中的另一條有效途徑。

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黑龍江省中醫(yī)藥管理局基金資助項(xiàng)目（ZHY10-Z45）

** 通訊作者:黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)·哈爾濱 150040