人血清淀粉樣蛋白A磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析定量檢測(cè)方法的建立及性能評(píng)價(jià) *

丁蒙蒙，李 奎，于 林，李雙法

(鄭州安圖生物工程股份有限公司，鄭州 450016)

血清淀粉樣蛋白A(human serum amyloid A，SAA)是1976年從血清中分離鑒定出的一類高度保守的急性期蛋白家族成員，也是一種存在于血漿中的脂結(jié)合蛋白[1]。通常被認(rèn)為是炎癥反應(yīng)的主要蛋白之一[2]，人體內(nèi)正常情況下SAA含量是極低的，在細(xì)菌或病毒感染時(shí)迅速升高。近年來(lái)的研究結(jié)果表明：SAA在細(xì)菌、病毒感染，慢性炎性(類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病、肥胖、動(dòng)脈粥樣硬化、慢性阻塞性肺疾病)，腫瘤等疾病中均有升高，與傳統(tǒng)的感染標(biāo)志物外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)(peripheral blood white blood cell count，WBC)和C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CRP)相比，SAA的優(yōu)勢(shì)在于病毒感染期靈敏度高，升高時(shí)間較其他標(biāo)志物早，而且升高幅度大[3]。因此在感染早期，SAA聯(lián)合CRP檢測(cè)，能提高鑒別細(xì)菌或病毒感染的可靠性[4-5]。目前用于檢測(cè)SAA的方法主要有透射比濁法、散射比濁法、乳膠增強(qiáng)免疫比濁法和酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunoSorbent assay，ELISA)，關(guān)于磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法未見(jiàn)報(bào)道，因此本研究旨在建立一種快速、準(zhǔn)確檢測(cè)SAA的磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法，并對(duì)其檢測(cè)性能進(jìn)行研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取駐馬店中心醫(yī)院2018年5～10月疑似細(xì)菌或病毒感染患者300例，100例來(lái)自正常人體檢樣本。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 試劑：基因工程重組SAA抗原、抗SAA小鼠單克隆抗體對(duì)(SAA1，SAA2)購(gòu)自鄭州伊美諾生物技術(shù)有限公司；校準(zhǔn)品稀釋液為50 mmol/L pH 7.4 TB緩沖液，含有1 mg/dl Casein，0.2 ml/dl P-300；磁珠包被緩沖液為20 mmol/L pH 7.4 PBS緩沖液；封閉液為50 mmol/L pH 7.4 TBS緩沖液，含有2 mg/dl BSA，0.2 ml/dl P-300；對(duì)比試劑：西門子試劑盒，血清淀粉樣蛋白A(散射比濁法)測(cè)定試劑盒；SAA國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品(NIBSC 92/680)購(gòu)買自英國(guó)NIBSC公司。

1.2.2 主要儀器：Auto Lumo A2000 Plus全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光測(cè)定儀(鄭州安圖生物工程股份有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 雙抗體夾心法抗體制備

1.3.1.1 包被抗體的制備：取磁珠包被緩沖液300 μl，加入300 μg的磁珠原液反復(fù)吹打，置于磁珠分離器上吸取上清后，添加碳二亞胺活化液，室溫反應(yīng)30 min～1 h，然后加入鼠抗人SAA捕獲抗體偶聯(lián)2 h或過(guò)夜，偶聯(lián)結(jié)束后，置于磁珠分離器上吸取上清，加入乙醇胺溶液進(jìn)行封閉30 min，吸取上清后加入封保液，混勻后置于磁珠分離器，棄上清，重復(fù)3～5次后，最后加入封保液定容至3 ml，置于2～8℃保存。

1.3.1.2 辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記SAA抗體的制備：采用過(guò)碘酸鈉法標(biāo)記SAA抗體并用半飽和硫酸銨法純化并透析，取上清加入50ml/dl甘油于-20℃保存。

1.3.2 SAA校準(zhǔn)品的制備：使用校準(zhǔn)品稀釋液稀釋SAA國(guó)際參考品(NIBSC 92/680)，濃度分別為200，100，50，25，5mg/L，校準(zhǔn)品稀釋液為0 mg/L，同時(shí)SAA校準(zhǔn)品高點(diǎn)濃度為200 mg/L。

1.3.3 試劑盒的性能指標(biāo)

1.3.3.1 空白限：準(zhǔn)備5份接近0值的臨床樣本，每個(gè)樣本重復(fù)3次，連續(xù)測(cè)定4天，按照CLSI EP17-A2的方法進(jìn)行結(jié)果分析，計(jì)算空白限。

1.3.3.2 精密度：

1.3.3.2.1 分析內(nèi)變異：分析內(nèi)變異是指在同一次分析測(cè)定中測(cè)定結(jié)果的變異情況。按照CLSI EP5-A2的方法分別準(zhǔn)備臨床精密度樣本高、中、低濃度三份，各重復(fù)測(cè)定20次，計(jì)算分析內(nèi)變異。

1.3.3.2.2 分析間變異：分析間變異(也叫天間變異)是指在不同次的分析測(cè)定中測(cè)定結(jié)果的變異情況。按照CLSI EP5-A2的方法，制備臨床精密度樣本高、中、低濃度3份，每天各檢測(cè)2次，每次2個(gè)重復(fù)，連續(xù)檢測(cè)20天，計(jì)算分析間變異。

1.3.3.3 線性：根據(jù)CLSI EP06-A文件進(jìn)行線性范圍的建立。具體方法如下：準(zhǔn)備10份濃度約為300 mg/L的臨床高值樣本和1份濃度接近于0的臨床低值樣本按照不同比例混合，制備出10組系列濃度的樣本，作為線性樣本進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算線性范圍。

1.3.3.4 準(zhǔn)確度：用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液稀釋國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品，稀釋到線性范圍內(nèi)的3個(gè)濃度樣本。每個(gè)樣本重復(fù)檢測(cè)2次，計(jì)算每個(gè)樣本檢測(cè)濃度與理論濃度的偏差。

1.3.3.5 回收率：根據(jù)CLSI EP09文件進(jìn)行試劑盒的回收率評(píng)估。具體方法如下：選擇高值樣本3份，按照1∶9的比例分別加入到3份低值樣本/基質(zhì)樣本中，制成回收樣本，加入高值樣本的體積不得超過(guò)總體積的10%，每個(gè)回收樣本重復(fù)檢測(cè)3次求均值，計(jì)算回收率。回收率R=[ C×(V0+VS)-C0×V0]/(CS×VS)×100% ，其中V0為低值樣本的體積，VS為高值樣本的體積，C為回收樣本的檢測(cè)濃度，C0為低值樣本的檢測(cè)濃度，CS為高值樣本的檢測(cè)濃度。

1.3.3.6 鉤狀效應(yīng)：將SAA抗原加入SAA校準(zhǔn)品稀釋液中，配制成系列梯度HOOK樣本(理論濃度分別為10 000，8 000，4 000，2 000 mg/L)進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3.7 方法學(xué)比對(duì)：根據(jù)CLSI EP09-A2文件，與對(duì)比試劑均在相同條件下進(jìn)行平行檢測(cè)，具體方法如下：分別用本文方法和西門子檢測(cè)系統(tǒng)(散射比濁法)同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，每份樣本重復(fù)3次檢測(cè)，計(jì)算均值，并進(jìn)行線性擬合和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 線性擬合采用Excel軟件進(jìn)行，性能評(píng)價(jià)按照EP文件的實(shí)驗(yàn)要求，實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 空白限 對(duì)得到的60個(gè)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，該檢測(cè)方法的空白限為0.1 mg/L。

2.2 精密度 見(jiàn)表1。該方法學(xué)的分析內(nèi)精密度均不高于5%，分析間精密度不高于10%。

2.3 線性 10組回歸方程的相關(guān)系數(shù)r均大于0.990，10組樣本中每個(gè)樣本的實(shí)際測(cè)得濃度與理論濃度的相對(duì)偏差均小于2%，因此本研究建立的SAA檢測(cè)方法的線性范圍為2～200 mg/L。

2.4 準(zhǔn)確度 用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液稀釋國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品，得到線性范圍內(nèi)的3個(gè)濃度樣本。3個(gè)稀釋樣本的實(shí)測(cè)濃度與理論濃度的偏差分別為5.18%，4.94%和6.64%，其偏差均小于試劑盒允許偏倚15%。

2.5 回收率 見(jiàn)表2。10個(gè)樣本的回收率在95%～114%之間，符合要求。

表1 分析內(nèi)、分析間精密度檢測(cè)結(jié)果

表2 回收率的測(cè)定(mg/L)

2.6 鉤狀效應(yīng) 對(duì)濃度為10 000 mg/L的樣本進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示其信號(hào)值回算的濃度值均大于200 mg/L，說(shuō)明采用本方法學(xué)檢測(cè)，樣本中SAA濃度高達(dá)10 000 mg/L時(shí)，未出現(xiàn)鉤狀效應(yīng)。

2.7 方法學(xué)比對(duì) 兩種方法同時(shí)檢測(cè)100例臨床血清(其中60例為細(xì)菌或病毒感染患者血清，40例為正常人血清)進(jìn)行SAA測(cè)定，以西門子試劑SAA檢測(cè)值為X軸，以安圖磁微?；瘜W(xué)發(fā)光試劑SAA檢測(cè)值為Y軸，線性回歸方程為：Y=1.099 8X-2.673 9，相關(guān)系數(shù)(r2)為0.983 4，見(jiàn)圖1。

圖1 相關(guān)性擬合曲線

3 討論

SAA屬于一種急性時(shí)相反應(yīng)蛋白，人體中主要在肝臟中合成，在急性時(shí)相反應(yīng)中，由白細(xì)胞介素1(interleukin，IL-1)、白細(xì)胞介素6(interleukin-6，IL-6)和腫瘤壞死因子α(tumornecrosis factor-α，TNF-α) 刺激誘導(dǎo)產(chǎn)生，這些細(xì)胞因子可以與糖皮質(zhì)激素協(xié)同作用以增強(qiáng)SAA的產(chǎn)生[6]。SAA是反映感染性疾病早期炎癥的重要指標(biāo)，在炎癥或感染急性期48～72 h內(nèi)迅速升高，并在疾病的恢復(fù)期下降，與CRP相比，具有更高的敏感性[7]?，F(xiàn)有的研究結(jié)果表明，SAA參與了多種疾病如心腦血管疾病、細(xì)菌、病毒感染、動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病、急性移植排斥反應(yīng)、腫瘤、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等，并在疾病的發(fā)生和發(fā)展中起著重要的作用。因此，SAA磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法的建立具有重要的意義。

SAA檢測(cè)方法主要包括免疫比濁法、膠體金法、ELISA，熒光層析法等[8]。免疫比濁法由于儀器的要求高以及原理的缺陷，造成免疫比濁法的檢測(cè)結(jié)果線性短，檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確，而且易受血脂的影響。膠體金法適用于床旁檢驗(yàn)，并且可以檢測(cè)全血，但該方法不利于樣本批量處理。ELISA測(cè)定具有較高的靈敏度，但操作過(guò)程繁瑣，每次測(cè)值均需要繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，準(zhǔn)確度誤差大，測(cè)定時(shí)間較長(zhǎng)，儀器昂貴且需要經(jīng)過(guò)一定專業(yè)培訓(xùn)的人員進(jìn)行操作?；瘜W(xué)發(fā)光法作為新一代標(biāo)記免疫測(cè)定方法具有高靈敏度、高精密性、易操作等優(yōu)點(diǎn)，可以很好地滿足臨床科室對(duì)感染性疾病快速、準(zhǔn)確診斷的需求。

本研究采用磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)法，基于雙抗夾心法原理，搭配全自動(dòng)免疫檢測(cè)儀，靈敏度高、精密度好、線性范圍寬、臨床相關(guān)性好，具有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值。