橙皮苷對慢性支氣管炎大鼠炎性因子表達的影響*

王立偉

(通遼職業(yè)學院， 內(nèi)蒙古 通遼 028000)

橙皮苷對慢性支氣管炎大鼠炎性因子表達的影響*

王立偉△

(通遼職業(yè)學院， 內(nèi)蒙古 通遼 028000)

目的： 觀察橙皮苷對慢性支氣管炎大鼠模型的炎性因子表達變化的影響。方法: 將大鼠隨機分為3組：對照組、模型組和橙皮苷給藥組。采用熏煙法建立慢性支氣管炎大鼠模型，采用HE染色檢測支氣管肺組織的病理學情況；ELISA法檢測支氣管肺泡灌洗液中腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素 6(IL-6)和白細胞介素 10(IL-10)含量；Western blot法檢測肺組織中ICAM-1和VCAM-1的蛋白表達水平。結(jié)果: 與模型組相比，橙皮苷給藥組的支氣管肺組織的炎性浸潤減少，肺泡結(jié)構(gòu)的完整性增加，支氣管肺泡灌洗液中TNF-α和IL-6的含量顯著下降(P<0.05)，IL-10含量無顯著變化；肺組織中ICAM-1和VCAM-1的蛋白表達水平顯著下降(P<0.05)。結(jié)論: 橙皮苷具有降低慢性支氣管炎中炎性因子TNF-α和IL-6含量的作用，可能與調(diào)節(jié)ICAM-1和VCAM-1的蛋白表達有關(guān)。

橙皮苷； 慢性支氣管炎； 炎性因子

慢性支氣管炎(chronic bronchitis)主要指氣管、支氣管以及其周圍組織的慢性非特異性炎癥，大多是由吸煙、過敏、感染、免疫等因素引起的氣管慢性炎癥，以及炎癥的反復(fù)損傷。病理變化主要是中央氣道的上皮受損，炎癥細胞浸潤，平滑肌細胞肥大等，進一步導(dǎo)致黏液分泌增加，上皮的免疫功能下降，最終導(dǎo)致氣道重塑。我國的慢性支氣管炎患病率約為4.0%，老年患者約占6%～20%，一般的治療方式采用低流量吸氧，抗生素與祛痰藥聯(lián)合應(yīng)用[1]。但由于慢性支氣管炎患者老年人居多，氣血循環(huán)功能弱，祛痰藥可能會刺激支氣管，引起強烈的咳嗽。

橙皮苷(hesperidin，Hes)廣泛存在于豆科、唇形花科和蕓香科等植物中。國內(nèi)學者發(fā)現(xiàn)橙皮苷呈劑量依賴性抑制大鼠角叉菜膠性足腫脹、棉球肉芽腫以及佐劑性關(guān)節(jié)炎[2]。此外，橙皮苷能顯著抑制脂多糖誘導(dǎo)的炎性細胞因子腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)的生成，并降低脂多糖誘導(dǎo)的敗血性休克的死亡率[3]。橙皮苷可以降低急性肝損傷小鼠血清中的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine amino-transferase，ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)和TNF-α的水平[4]。目前尚未有橙皮苷對慢性支氣管炎的研究，為研究橙皮苷對慢性支氣管炎大鼠模型的療效，我們觀察橙皮苷對模型支氣管肺泡灌洗液炎性因子含量以及肺組織中黏附因子的影響，以期為橙皮苷用于慢性支氣管的臨床應(yīng)用提供實驗基礎(chǔ)。

材 料 和 方 法

1 實驗動物和試劑

健康Sprague-Dawley (SD)大鼠30只，SPF級，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號為SCXK(湘)2011-0003，自由飲水進食，進行適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

橙皮苷購自中國食品藥品檢定研究院；TNF-α和IL-6的ELISA試劑盒購自武漢優(yōu)爾生物科技股份有限公司；IL-10的ELISA試劑盒購自上海森雄科技實業(yè)有限公司；抗細胞間黏附分子 1(intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1)、血管細胞黏附分子 1(vascular cellular adhesion molecule-1，VCAM-1)和GAPDH抗體購自Santa Cruz。芙蓉牌香煙購自湖南常德卷煙廠

2 實驗方法

2.1 大鼠模型的建立與分組 參照文獻[5]建立慢性支氣管炎大鼠模型，將SD大鼠置于煙室(0.5 m×0.5 m×0.4 m)中，點燃煙葉8 g熏煙，每天2次，間隔10 min，每次50 min，共煙熏40 d。建模結(jié)束后，對大鼠的支氣管肺組織進行病理學檢查，出現(xiàn)典型慢性支氣管病變表示建模成功。對照組(control)大鼠與上述處理相同，但煙室中不進行煙熏。建模成功后，將大鼠隨機分為慢性支氣管炎(chronic bronchitis，CB)模型組和橙皮苷給藥組(Hes組)，后者灌胃橙皮苷 200 mg/kg，連續(xù)給藥并煙熏共30 d。

2.2 標本的采集與制備 抽取腹主動脈血液約5 mL，3 000 r/min離心10 min，取上清液備用。夾閉右側(cè)主支氣管，導(dǎo)入微型導(dǎo)管于氣管隆突上約1 cm處固定，分別采用3 mL、2 mL和2 mL的生理鹽水灌洗3次，灌洗速度與回抽速度保持在1～2 mL/min，回收的支氣管肺泡灌洗液，1 500 r/min離心5 min，上清液備用。用20%烏拉坦腹腔麻醉大鼠，仰臥固定，處死，頸動脈放血，用0.9%生理鹽水快速從右心室注入，沖刷肺循環(huán)內(nèi)血液，將支氣管和肺臟完整取出，氣管插管，從氣管注入4%多聚甲醛溶液，肺膨脹至胸膜平展后，結(jié)扎氣管，將整個組織放入甲醛溶液中固定24 h，石蠟包埋切片，其余組織置于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 支氣管肺組織的HE染色 將支氣管肺組織的切片分別浸入二甲苯Ⅰ、Ⅱ，依次浸入梯度乙醇(100%、95%、85%、75%)脫水，蒸餾水沖洗，蘇木素浸染5 min，1%鹽酸乙醇分化，氫氧化銨溶液返藍，伊紅復(fù)染3 min，再次用梯度乙醇(75%、85%、95%、100%)脫水，二甲苯Ⅰ、Ⅱ透明，晾干，用中性樹膠封片，置于顯微鏡下觀察。

2.4 支氣管肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6和IL-10含量測測定 嚴格按照ELISA試劑盒說明書操作，取出試驗板條，加入標準品及待測血清樣品，37 ℃孵育2 h，PBS洗板，加入檢測A溶液100 μL至各孔，37 ℃孵育1 h；棄去孔內(nèi)液體，加入檢測B溶液100 μL至各孔，37 ℃孵育30 min，棄去孔內(nèi)液體，洗板，加入底物TMB，覆膜避光37 ℃孵育20 min，每孔加入50 μL終止液，混勻后在酶標儀450 nm波長處測量各孔的吸光度(A)值。

2.5 Western blot法檢測ICAM-1和VCAM-1的蛋白表達 將支氣管肺組織剪碎，在冰上勻漿，加入裂解液裂解30 min，12 000 r/min 4 ℃離心5 min，取上清液進行蛋白定量，調(diào)整蛋白量后，取等量裂解產(chǎn)物，加入上樣緩沖液進行SDS-PAGE電泳，電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，加入脫脂牛奶中室溫封閉2 h，加入 Ⅰ 抗4 ℃孵育過夜，TBST洗滌，加入相應(yīng) Ⅱ 抗室溫孵育1 h，TBST洗滌，化學發(fā)光法顯色，成像掃描分析系統(tǒng)保存圖像。

3 統(tǒng)計學處理

運用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件分析，實驗數(shù)據(jù)結(jié)果采用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，各組間差異采用單因素方差(one-way ANOVA)進行分析，Bonferroni校正的t檢驗分析兩兩數(shù)據(jù)間差異，以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學顯著性。

結(jié) 果

1 支氣管肺組織的HE染色結(jié)果

正常組大鼠支氣管上皮纖毛豐富、排列整齊，肺泡結(jié)構(gòu)完整，無缺損；模型組大鼠可見支氣管黏膜水腫，變形增厚，官腔狹窄，大量炎性細胞浸潤，表明慢性支氣管炎大鼠模型成功建立；給予橙皮苷處理后，可見支氣管黏膜有炎性細胞浸潤，部分支氣管黏膜上皮脫落，見圖1。

Figure 1.The pathological change of the bronchial and lung tissues (×200).

圖1 支氣管肺組織的病理學觀察

2 支氣管肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6和IL-10含量的變化

與正常組相比，模型組大鼠的支氣管肺泡灌洗液中TNF-α和IL-6的含量顯著上升(P<0.05)，IL-10含量的差異無統(tǒng)計學顯著性；給予橙皮苷干預(yù)后，與模型組相比，大鼠的支氣管肺泡灌洗液中TNF-α和IL-6含量顯著下降(P<0.05)，IL-10含量的差異水平無統(tǒng)計學顯著性，見表1。

表1 橙皮苷對TNF-α、IL-6和IL-10含量變化的影響

Table 1.The effect of hesperidin (Hes) on the content of TNF-α, IL-6 and IL-10 (ng/L. Mean±SD.n=10)

GroupTNF?αIL?6IL?10Control30．24±2．4832．47±4．5812．24±0．43CB54．67±4．73?48．21±4．37?12．68±0．67hes39．58±3．47?#37．72±3．14?#12．54±0．28

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsCB group.

3 肺組織中ICAM-1和VCAM-1蛋白表達的變化

與正常組相比，模型組大鼠的肺組織中ICAM-1和VCAM-1的蛋白表達水平顯著上升(P<0.05)；給予橙皮苷干預(yù)后，與模型組相比，大鼠的肺組織中ICAM-1和VCAM-1的蛋白表達水平顯著下降(P<0.05)，見圖2。

討 論

TNF-α是巨噬細胞、淋巴細胞、肺泡上皮細胞等釋放的一種重要的中性粒細胞趨化因子，能夠激活中性粒細胞、巨噬細胞、淋巴細胞等，促進炎癥顆粒的釋放，以及炎性細胞因子的合成與釋放。TNF-α通過誘導(dǎo)中性粒細胞的局部浸潤，促使白細胞與血管內(nèi)皮細胞黏附，導(dǎo)致白細胞游出血管內(nèi)壁進入氣道，另外，TNF-α激活的中性粒細胞與巨噬細胞能增加細胞毒性，生成一系列的促炎因子，進而介導(dǎo)肺組織炎癥反應(yīng)的過程，誘發(fā)或加重支氣管炎癥[6-7]。IL-6能夠誘導(dǎo)抗原刺激的T淋巴細胞增殖和B淋巴細胞成熟，誘導(dǎo)全身性的急性期反應(yīng)物的釋放，是一種多效應(yīng)的細胞因子，與全身性炎癥反應(yīng)和肺功能下降程度有直接關(guān)系[8]。我們實驗結(jié)果顯示，慢性支氣管炎大鼠的TNF-α和IL-6含量明顯高于正常組，而給予橙皮苷處理后，能顯著下調(diào)TNF-α和IL-6的水平，提示慢性支氣管炎是肺部的炎癥反應(yīng)與細胞因子的分泌異常升高，橙皮苷可能具有抑制肺組織中炎性因子TNF-α和IL-6的作用，清除肺組織細胞中的炎癥。IL-10具有抑制促炎細胞因子合成與釋放的抗炎作用，但本實驗結(jié)果顯示橙皮苷對IL-10的含量無明顯影響，可能原因還需進行進一步實驗研究。另有報道指出獲得性肺炎死亡的患者IL-10水平顯著高于存活的患者，提示IL-10雖作為抑炎因子，但過度的抑炎反應(yīng)會使體內(nèi)平衡失調(diào)，預(yù)后不佳[9]。

Figure 2.The effect of hesperidin (Hes) on the protein expression of ICAM-1 and VCAM-1 in lung tissue. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsCB group.

圖2 橙皮苷對肺組織中ICAM-1和VCAM-1蛋白表達的影響

黏附分子主要參與細胞的識別、活化和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，在免疫應(yīng)答和炎癥發(fā)生等方面具有重要作用[10]。VCAM-1通過介導(dǎo)單核細胞、淋巴細胞和嗜酸性粒細胞黏附至血管內(nèi)皮表面，促使白細胞往炎癥部位聚集，使血管內(nèi)皮細胞受損。ICAM-1介導(dǎo)細胞間的黏附，促使相關(guān)抗原陽性白細胞黏附于ICAM-1陽性內(nèi)皮細胞表面，進一步到達炎癥組織，促進炎癥細胞的遷移和趨化[11]。ICAM-1與VCAM-1是NF-κB激活后的下游炎癥因子。本研究發(fā)現(xiàn)，給予橙皮苷干預(yù)后，大鼠肺組織中的ICAM-1與VCAM-1的蛋白表達顯著下調(diào)，推測橙皮苷通過降低ICAM-1與VCAM-1的表達，從而降低白細胞與內(nèi)皮細胞的黏附作用，緩解炎性反應(yīng)。

[1] 陳 陽， 翁 惠. 慢性支氣管炎的臨床研究進展[J]. 湖南中醫(yī)雜志， 2013, 29(3):140-141.

[2] 李 榮， 胡成穆， 姜 輝， 等. 橙皮苷的提取及其抗炎活性研究[J]. 安徽醫(yī)科大學學報， 2007, 42(5):546-549.

[3] Kawaguchi K, Kikuchi S, Hasunuma R, et al. A citrus flavonoid hesperidin suppresses infection-induced endotoxin shock in mice[J]. Biol Pharm Bull, 2004, 27(5): 679-683.

[4] 李曉冬， 李 俊， 李 榮， 等.橙皮苷對刀豆蛋白A致小鼠免疫性肝損傷的保護作用[J]. 安徽醫(yī)科大學學報，2010, 45(3):350-353.

[5] 李慶云， 黃紹光， 吳華成. 大鼠吸煙致慢性支氣管炎模型氣道炎癥研究[J]. 上海第二醫(yī)科大學學報， 2004, 24(1):31-35.

[6] Desai D, Brightling C. Cytokines and cytokine-specific therapy in asthma[J]. Adv Clin Chem, 2012, 57:57-97.

[7] 李淑瑾， 姚玉霞， 朱桂軍，等.CCK-8抑制LPS誘導(dǎo)大鼠肺間質(zhì)巨噬細胞TNF-α轉(zhuǎn)錄及NF-κB活性[J].中國病理生理雜志，2004, 20(8)：1335-1339.

[8] Walter RE, Wilk JB, Lozson MG, et al. Systemic inflammation and COPD: the Framingham Heart Study[J]. Chest, 2008, 133(1):19-25.

[9] Lee YL, Chen W, Chen LY, et al. Systemic and bronchoalveolar cytokines as predictors of in-hospital mortality in severe community-acquired pneumonia[J]. J Crit Care, 2010,25(1):176-177.

[10]Williamson JD, Sadofsky LR, Crooks MG, et al. Bleomycin increases neutrophil adhesion to human vascular endothelial cells independently of upregulation of ICAM-1 and E-selectin[J]. Exp Lung Res, 2016, 42(8-10):397-407.

[11]Yang JX, Pan YY, Ge JH, et al. Tanshinone II A attenuates TNF-α induced expression of VCAM-1 and ICAM-1 in endothelial progenitor cells by blocking activation of NF-κB[J]. Cell Physiol Biochem, 2016, 40(1-2):195-206.

(責任編輯： 林白霜， 羅 森)

Effects of hesperidin on inflammatory cytokine levels in chronic bronchitic rats

WANG Li-wei

(TongliaoVocationCollege,Tongliao028000,China.E-mail:wangxqmed@126.com)

AIM: To observe the effects of hesperidin on the inflammatory cytokine levels in chronic bronchitic rats. METHODS: The rats were randomly divided into control group, model group and hesperidin treatment group. The rat model of chronic bronchitis was established by smoking. The pathological changes of the bronchial and lung tissues were observed by HE staining. The levels of TNF-α, IL-6 and IL-10 in the bronchoalveolar lavage fluid were analyzed by ELISA. The protein expression levels of ICAM-1 and VCAM-1 were detected by Western blot. RESULTS: Compared with model group, hesperidin treatment significantly reduced inflammatory infiltration in the bronchial and lung tissues, improved the integrity of the alveolar structure, and decreased the levels of TNF-α and IL-6 in the bronchoalveolar lavage fluid, but had no effect on the IL-10 level. Moreover, the protein expression of ICAM-1 and VCAM-1 were dramatically inhibited after hesperidin treatment. CONCLUSION: Hesperidin decreases the levels of TNF-α and IL-6 in the bronchoalveolar lavage fluid in the rats with chronic bronchitis, which may be associated with the inhibition of ICAM-1 and VCAM-1 expression.

Hesperidin; Chronic bronchial; Inflammatory cytokines

1000- 4718(2017)02- 0358- 04

2016- 10- 13

2016- 12- 08

內(nèi)蒙古自然科學基金資助項目(No. 2013MS1120)

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.02.027

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