苦參堿通過調(diào)節(jié)單核吞噬細(xì)胞表型偏移改善博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化*

李 鑫， 李 琦，3▲， 李 祎， 蘇程程， 周 欣， 彭守春， 魏路清△， 姬文婕△

(中國人民武裝警察部隊(duì)后勤學(xué)院 1附屬醫(yī)院呼吸與重癥醫(yī)學(xué)科， 2附屬醫(yī)院心臟醫(yī)院， 3錦州醫(yī)科大學(xué)武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院研究生培養(yǎng)基地，天津 300162)

苦參堿通過調(diào)節(jié)單核吞噬細(xì)胞表型偏移改善博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化*

李 鑫1， 李 琦1，3▲， 李 祎1， 蘇程程1， 周 欣2， 彭守春1， 魏路清1△， 姬文婕1△

(中國人民武裝警察部隊(duì)后勤學(xué)院1附屬醫(yī)院呼吸與重癥醫(yī)學(xué)科，2附屬醫(yī)院心臟醫(yī)院，3錦州醫(yī)科大學(xué)武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院研究生培養(yǎng)基地，天津 300162)

目的： 研究苦參堿(matrine，MA)對博萊霉素(bleomycin，BLM)誘導(dǎo)的循環(huán)單核細(xì)胞和肺泡巨噬細(xì)胞表型偏移的調(diào)節(jié)作用。方法: 160只C57BL/6雄性小鼠隨機(jī)分為生理鹽水(NS)組、BLM組、苦參堿干預(yù)組(BLM+MA組)及溶劑對照組(BLM+NS組)，經(jīng)口咽吸入法給予BLM (2.5 mg/kg)建立實(shí)驗(yàn)性肺纖維化模型，對照組給予等體積NS，BLM+MA組和BLM+NS組分別在術(shù)后每天灌胃給予MA(15 mg·kg-1·d-1)或等量NS。術(shù)后第3、7、14和21天處死小鼠，采用HE染色和Masson染色觀察肺組織病理學(xué)變化及纖維化程度，采用堿水解法測定肺組織羥脯氨酸的含量，用流式細(xì)胞術(shù)分別檢測循環(huán)單核細(xì)胞亞群和支氣管肺泡灌洗液細(xì)胞表型的變化。結(jié)果: 與對照組相比，MA干預(yù)可以明顯減輕BLM誘導(dǎo)的小鼠肺組織炎癥反應(yīng)及纖維化程度(P<0.05)；與NS組相比，BLM組的Ly6Chi單核細(xì)胞比例升高，肺泡巨噬細(xì)胞表型由M1型向M2型偏移，且與炎癥反應(yīng)和纖維化程度呈現(xiàn)一定的相關(guān)性；MA干預(yù)后可以部分逆轉(zhuǎn)BLM誘導(dǎo)的循環(huán)單核細(xì)胞和肺泡巨噬細(xì)胞的表型偏移。結(jié)論: 苦參堿可以減輕BLM誘導(dǎo)的急性肺泡炎癥和肺纖維化程度，可能是部分通過逆轉(zhuǎn)循環(huán)單核細(xì)胞和肺泡巨噬細(xì)胞表型的偏移而實(shí)現(xiàn)的。

苦參堿； 肺纖維化； 單核細(xì)胞； 巨噬細(xì)胞； 博萊霉素

特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是一種由各種病因引起的累及肺間質(zhì)、肺泡或細(xì)支氣管的肺部彌漫性疾病，有病程發(fā)展不可逆、預(yù)后極差、臨床治療手段有限等特點(diǎn)[1]。單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)(mononuclear phagocyte system，MPS)由骨髓中的單核細(xì)胞前體細(xì)胞、血液循環(huán)中的單核細(xì)胞以及組織中由單核細(xì)胞分化而來的巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞組成，是吞噬細(xì)胞最主要的組成部分，在機(jī)體自身免疫及抵御疾病等方面發(fā)揮重要作用[2]。本課題小組前期研究結(jié)果表明單核/巨噬細(xì)胞表型的偏移與博萊霉素(bleomycin，BLM)誘導(dǎo)的肺纖維化的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3-4]。

苦參堿(matrine，MA)是一種從傳統(tǒng)中藥苦參中分離出來的生物堿，大量證據(jù)表明MA具有抗氧化[5]、抗炎[6]及抗纖維化[7]等多種生物和藥理學(xué)作用。近年來，MA對肺纖維化的干預(yù)作用已經(jīng)得到了廣泛研究[8]，但是其機(jī)制尚不清楚。本研究擬通過博萊霉素誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性小鼠肺纖維化模型，探索苦參堿是否通過對博萊霉素誘導(dǎo)單核/巨噬細(xì)胞表型偏移的調(diào)控，從而干預(yù)了肺纖維化的發(fā)生發(fā)展。

材 料 和 方 法

1 動(dòng)物

健康C57BL/6雄性小鼠，8～10周齡，體重18～20 g，購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號為SCXK-(軍)2012-0004。小鼠常規(guī)飼養(yǎng)于清潔級動(dòng)物房內(nèi)，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2 主要試劑

注射用鹽酸博萊霉素(NIPPON KAYAKU)；苦參堿(純度>98%，由武警后勤學(xué)院生藥教研室陳虹教授提供)；FITC標(biāo)記的抗小鼠Ly6C抗體、PE標(biāo)記的抗小鼠 CD11b抗體、7-氨基放線菌素D(7-aminoactinomycin D，7-AAD)、PerCP/Cy5.5 標(biāo)記的抗小鼠Ly6G、PE標(biāo)記的抗小鼠CD206和PerCP/Cy5.5標(biāo)記的抗小鼠CD64均購自BioLegend；羥脯氨酸(hydroxyproline, HYP)測定試劑盒(堿水解法，南京建成生物工程研究所)；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

3 主要方法

3.1 動(dòng)物模型的制備 160只C57BL/6雄性小鼠隨機(jī)分為生理鹽水(normal saline, NS)組、BLM組、BLM+NS組和BLM+MA組。參照Lakatos等[9]經(jīng)口咽吸入法建立肺纖維化模型，BLM組給予BLM(2.5 mg/kg),NS組給予等體容積無菌生理鹽水。BLM+MA組在造模后每天經(jīng)口灌胃給予MA(15 mg·kg-1·d-1)，BLM+NS組給予同等容積的生理鹽水灌胃。

3.2 標(biāo)本的采集及處理 分別于模型建立后第3、7、14和21天取材。首先采用乙二胺四乙酸(ethy-lene diamine tetraacetic acid，EDTA)抗凝管經(jīng)下頜靜脈采集取外周靜脈血50 μL，進(jìn)行循環(huán)單核細(xì)胞亞群的流式細(xì)胞術(shù)檢測。然后將小鼠輕度麻醉后摘眼球放血致死，灌洗組用1 mL預(yù)冷無菌生理鹽水行經(jīng)支氣管肺泡灌洗，重復(fù)3次，支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)離心后用于流式細(xì)胞術(shù)分析。未灌洗組左肺行病理學(xué)檢測；灌洗組左肺用于HYP含量的測定。

3.3 肺組織病理學(xué)檢測 根據(jù)前期研究結(jié)果[3]，選擇炎癥反應(yīng)明顯的時(shí)點(diǎn)第3、7天進(jìn)行檢測。對肺組織進(jìn)行固定、脫水、透明、浸蠟及包埋處理后，切片。按常規(guī)方法進(jìn)行蘇木素-伊紅(hematoxylin and eosin，HE)染色和Masson染色。參照Szapiel等[10]方法進(jìn)行炎癥評分(inflammation score，IS)，取其平均值代表肺組織的炎癥程度。采用Image-Pro Plus 4.5軟件對肺間質(zhì)纖維化程度進(jìn)行分析，膠原容積分?jǐn)?shù)(collagen volume fraction，CVF)代表肺纖維化程度，公式如下：CVF(%)=膠原面積/(圖像總面積-空白區(qū)域面積)×100%。

3.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測循環(huán)單核細(xì)胞亞群比例變化 根據(jù)前期研究結(jié)果[3]，選擇單核細(xì)胞表型偏移明顯的時(shí)點(diǎn)第3、7天進(jìn)行檢測。取新鮮EDTA抗凝血50 μL，按照說明書推薦劑量，加入PE-CD11b、FITC-Ly6C和PerCP/Cy5.5-Ly6G抗體及各自的同型對照抗體并混勻，24 ℃避光孵育15 min，加入紅細(xì)胞裂解液600 μL，混勻后避光靜置10 min，F(xiàn)C500流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter，USA)檢測。流式細(xì)胞術(shù)設(shè)門策略參見文獻(xiàn)[11]。

3.5 肺泡巨噬細(xì)胞(alveolar macrophages, AMφ)表型偏移 根據(jù)前期研究結(jié)果[3]，選擇巨噬細(xì)胞表型偏移明顯的時(shí)點(diǎn)第3、7、14天進(jìn)行檢測。用50 μL staining buffer重懸計(jì)數(shù)5×105BALF細(xì)胞，加入PerCP/Cy5.5-CD64和PE-CD206抗體，混勻后24 ℃避光孵育15 min，然后加入7-AAD，混勻后避光孵育5 min，加入600 μL staining buffer，300目尼龍濾網(wǎng)過濾后，流式細(xì)胞儀檢測。設(shè)門策略參見文獻(xiàn)[4]。

3.6 小鼠肺組織HYP含量測定 根據(jù)前期研究結(jié)果[3]，選擇肺纖維化程度最明顯的時(shí)點(diǎn)第21天進(jìn)行檢測。按照試劑盒說明書采用堿水解法水解肺組織，氯胺T法測定肺組織HYP含量。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用STATA 14.1軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間的比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用Tukey’s檢驗(yàn)，相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組小鼠的肺組織病理變化觀察

如圖1所示，NS組肺組織經(jīng)HE染色后在普通光學(xué)顯微鏡下可見肺泡結(jié)構(gòu)基本正常，無炎性細(xì)胞浸潤和膠原纖維沉積。與NS組相比，BLM組及BLM+ NS組在第3天可見炎性細(xì)胞浸潤，部分肺間隔增厚，第7天炎癥反應(yīng)加重，可見大量炎性細(xì)胞浸潤，肺泡間隔明顯增厚，肺泡腔塌陷。給予苦參堿干預(yù)的BLM+MA組炎性細(xì)胞浸潤及肺泡腔增厚與BLM組及BLM+NS組相比較輕，肺泡結(jié)構(gòu)相對完整。第3、7天，與NS組相比，BLM組和BLM+NS組的IS增高(P<0.01)；BLM+MA組的IS低于BLM+NS組(P<0.05)。Masson染色結(jié)果顯示，NS組各時(shí)點(diǎn)均未見明顯膠原沉積。與NS組相比，第21天，BLM組及BLM+NS組可見大量致密的藍(lán)色膠原纖維，BLM+MA組膠原纖維減少。BLM組CVF值較NS組顯著升高(P<0.01)，BLM+MA組CVF值低于BLM+NS組(P<0.01)。

2 各組小鼠肺組織羥脯氨酸含量的變化

與NS組相比，BLM組第21天的HYP含量明顯增高(P<0.01);與BLM+NS組相比，BLM+MA組的HYP含量明顯降低(P<0.05)，見圖1。

Figure 1.The result of pathological staining and inflammation score (IS), collagen volume fraction (CVF), and hydroxyproline (HYP) content in the mouse lung tissues. Mean±SD.n=5.**P<0.01vsNS group;#P<0.05,##P<0.01vsBLM+NS group.

圖1 苦參堿干預(yù)后各組小鼠肺組織病理染色及評分結(jié)果

3 各組小鼠循環(huán)單核細(xì)胞亞群比例的變化

流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示，NS組不同時(shí)點(diǎn)之間2種單核細(xì)胞亞群比例變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。與NS組相比，第 3、7天BLM組Ly6Chi的比例均升高(P<0.01)；與BLM+NS組相比，BLM+MA組第3天的Ly6Chi亞群比例降低(P<0.05)，第7天有下降趨勢,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。Ly6Clo單核細(xì)胞亞群比例變化趨勢與Ly6Chi相反，見圖2。

Figure 2.Matrine treatment reversed mononuclear phenotype switching induced by bleomycin. Mean±SD.n=5.*P<0.05,**P<0.01vsNS group;#P<0.05vsBLM+NS group.

圖2 苦參堿干預(yù)后各組小鼠循環(huán)單核細(xì)胞亞群的變化

4 各組小鼠肺泡巨噬細(xì)胞表型比例的變化

流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示，NS組不同時(shí)點(diǎn)之間2種巨噬細(xì)胞表型比例變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。與NS組相比，BLM組各時(shí)點(diǎn)AMφ M1的比例均降低(P<0.01)；與BLM+NS組相比，BLM+MA組第3天AMφ M1的比例變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，第7、14 天BLM+MA組 AMφ M1的比例均升高(P<0.01)。AMφ M2比例變化趨勢與AMφ M1相反，見圖3。

5 單核細(xì)胞亞群Ly6Chi與IS和CVF的相關(guān)關(guān)系

小鼠循環(huán)單核細(xì)胞亞群Ly6Chi在博萊霉素干預(yù)后，比例迅速升高，在炎癥反應(yīng)期維持較高水平。將相同時(shí)點(diǎn)各組小鼠單核亞群Ly6Chi比例與相應(yīng)肺組織IS，以及將變化最大的第3天小鼠單核亞群Ly6Chi比例與第21天的CVF進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果如圖4所示，Ly6Chi比例與IS呈明顯正相關(guān)(r=0.6328，P<0.01)，Ly6Chi比例的變化與CVF值亦呈明顯正相關(guān)性(r=0.7857，P<0.01)。

6 M2肺泡巨噬細(xì)胞與IS和CVF的相關(guān)關(guān)系

小鼠M2肺泡巨噬細(xì)胞在博萊霉素干預(yù)后，比例升高，經(jīng)MA干預(yù)后比例有所下降。將相同時(shí)點(diǎn)各組小鼠AMφ M2比例與相應(yīng)肺組織IS，以及將變化最大的第14天小鼠AMφ M2的比例與第21天的CVF進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果如圖4所示，AMφ M2比例與IS呈明顯正相關(guān)(r=0.7014，P<0.01)，AMφ M2與CVF值亦呈明顯正相關(guān)性(r=0.9326，P<0.01)。

Figure 3.Matrine treatment reversed alveolar macrophages switching induced by bleomycin. Mean±SD.n=5.**P<0.01vsNS group;#P<0.05vsBLM+NS group.

圖3 苦參堿干預(yù)后各組小鼠肺泡巨噬細(xì)胞表型的變化

Figure 4.Pooled correlation analysis between mononuclear phagocytes and lung pathological changes.

圖4 Ly6Chi單核細(xì)胞亞群和M2型肺泡巨噬細(xì)胞與炎癥評分、膠原容積分?jǐn)?shù)的相關(guān)性分析

討 論

在機(jī)體中，骨髓干細(xì)胞發(fā)育成單核母細(xì)胞，后者進(jìn)一步分化成為前單核細(xì)胞并進(jìn)入血流，在此處分化成為成熟的單核細(xì)胞，單核細(xì)胞穿過血管內(nèi)皮，遷移到不同的組織，分化成為組織特異性的巨噬細(xì)胞，由于巨噬細(xì)胞是一種異質(zhì)性細(xì)胞群體，不同組織甚至同一組織的巨噬細(xì)胞在表型和功能方面也存在較大差異[12-13]。由于單核/巨噬細(xì)胞具有異質(zhì)性，小鼠單核細(xì)胞可分為具有抗炎作用的單核細(xì)胞Ly6Chi群和具有“巡視”功能的單核細(xì)胞Ly6Clo群[14]。巨噬細(xì)胞在不同環(huán)境刺激下分化為經(jīng)典活化巨噬細(xì)胞(classically activated macrophage，CAMs/M1)和選擇性活化巨噬細(xì)胞(alternatively activated macrophage，AAMs/M2)2種極化類型。M1型細(xì)胞參與正向免疫應(yīng)答，進(jìn)行免疫監(jiān)視；M2型細(xì)胞具有抑制炎癥的表型,同時(shí)能夠促進(jìn)血管、淋巴管、肉芽組織的新生，促進(jìn)組織修復(fù)[15]。本課題小組前期研究發(fā)現(xiàn)通過鹽皮質(zhì)激素受體阻斷劑調(diào)節(jié)肺泡巨噬細(xì)胞的表型偏移能夠有效改善二氧化硅所致矽肺的早期炎癥反應(yīng)及后期的肺纖維化程度[16]。

目前大量研究主要還是從抗炎及抗氧化等方面對博萊霉素誘導(dǎo)肺纖維化進(jìn)行探討[17-19]。苦參堿在治療肺纖維化等疾病過程中也主要發(fā)揮著抗纖維化、抗炎、抗氧化等作用[20-21]，但其治療肺纖維化的具體作用機(jī)制仍不明確。本課題小組前期研究結(jié)果顯示在博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠實(shí)驗(yàn)性肺纖維化過程中，單核/巨噬細(xì)胞亞群隨著肺纖維化程度的發(fā)生發(fā)展呈明顯的動(dòng)態(tài)變化[3]，同時(shí)發(fā)現(xiàn)給予螺內(nèi)酯阻斷鹽皮質(zhì)激素受體后減輕了早期炎癥反應(yīng)及后期纖維化程度，其可能是通過降低炎癥早期快速升高的Ly6Chi單核細(xì)胞數(shù)量及抑制肺泡巨噬細(xì)胞選擇性激活實(shí)現(xiàn)的[11]。結(jié)合前期研究，在本研究中經(jīng)MA干預(yù)后第3天肺組織的炎性細(xì)胞浸潤明顯減輕，同時(shí)發(fā)揮促炎作用的Ly6Chi群的比例也明顯低于對照組。在MA干預(yù)后，第21天肺組織CVF和HYP均低于BLM+NS組，同時(shí)發(fā)揮促纖維化作用的AMφ M2在第7、14天均低于BLM+NS組。通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，Ly6Chi比例和AMφ M2比例與炎癥反應(yīng)及肺纖維化程度均有一定的相關(guān)性，尤其發(fā)現(xiàn)第14天的AMφ M2比例與后期(第21天)肺纖維化程度密切相關(guān)。由此結(jié)果可驗(yàn)證本研究假設(shè)：苦參堿發(fā)揮作用，可能是通過抑制博萊霉素致小鼠肺纖維化過程中單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞表型偏移，抑制Ly6Chi比例及促纖維化肺泡巨噬細(xì)胞M2的升高，進(jìn)而減輕炎癥細(xì)胞滲出和膠原沉積。同時(shí)前期的Ly6Chi比例和AMφ M2比例能夠預(yù)測出后期的肺纖維化嚴(yán)重程度。

綜上所述，MA可以在一定程度上通過降低炎癥反應(yīng)期的Ly6Chi表型的單核細(xì)胞的比例，和降低肺纖維化期的AMφ M2的比例，進(jìn)而減輕炎癥反應(yīng)和肺纖維化程度。MA通過調(diào)控單核/巨噬細(xì)胞表型治療博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化的具體分子生物學(xué)機(jī)制有待后續(xù)進(jìn)一步研究。

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(責(zé)任編輯： 盧 萍， 羅 森)

Matrine attenuates bleomycin-induced pulmonary injury partially via modulating mononuclear phagocyte phenotype switching in mice

LI Xin1, LI Qi1,3, LI Yi1, SU Cheng-cheng1, ZHOU Xin2, PENG Shou-chun1, WEI Lu-qing1, JI Wen-jie1

(1DepartmentofRespiratoryMedicine&IntensiveCareMedicine,2HeartCenter,3PostgraduateTrainingBaseofJinzhouMe-dicalUniversity,AffiliatedHospitalofLogisticsUniversityofChinesePeople’sArmedPloiceForce,Tianjin300162,China.E-mail:ji_wenjie@hotmail.com;wei_luqing@hotmail.com)

AIM: To investigate the influence of matrine (MA) on the phenotype switching of mouse monocytes and alveolar macrophages induced by bleomycin (BLM). METHODS: All mice were randomly divided into normal saline (NS) group, BLM group, BLM+NS group and BLM+MA group. The mice were administered with BLM at 2.5 mg/kg via oropharyngeal instillation. The mice in BLM+MA group were treated with MA (15 mg·kg-1·d-1) by oral gavage following BLM administration. The mice were sacrificed on days 3, 7, 14, and 21. The lungs were removed for pathological analysis. The circulating monocyte subsets and polarization state of bronchoalveolar lavage fluid (BALF)-derived alveolar macrophages were analyzed by flow cytometry.RESULTS: The results of HE and Masson trichrome staining in BLM and BLM+NS groups exhibited classical pathological stages of lung fibrosis, including acute inflammation phase and later fibrosis phase. Compared with BLM+NS group, MA treatment alleviated the inflammatory response and the degree of fibrosis induced by BLM (P<0.05). There was a rapid change of circulating Ly6Chimonocytes and its magnitude was positively associated with the pulmonary inflammatory response. An expansion of M2-like alveolar macrophages was positively correlated with the magnitude of lung fibrosis. Moreover, MA treatment partially normalized the phenotype switching of monocytes and alveolar macrophages.CONCLUSION: Matrine treatment attenuates BLM-induced pulmonary injury partially via modulating the phenotype switching of monocytes and alveolar mocrophages.

Matrine; Pulmonary fibrosis; Monocytes; Macrophages; Bleomycin

1000- 4718(2017)02- 0322- 07

2016- 09- 05

2016- 10- 09

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81102088； No. 81441101； No. 81570335)；天津市自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 15JCZDJC35000)；武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院重點(diǎn)項(xiàng)目(No. FYZ201510； No. FYZ201605)

R363.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.02.021

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△通信作者 姬文婕 Tel: 022-60577283； E-mail： ji_wenjie@hotmail.com； 魏路清 Tel: 022-60578671； E-mail： wei_luqing@hotmail.com

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