番茄紅素對原代小鼠皮質(zhì)神經(jīng)元的保護作用及機制研究*

黃翠芹， 李 勤， 范沖竹， 甘丹卉， 李 安， 趙佳儀， 王 珍， 陸大祥

(暨南大學醫(yī)學院病理生理學系，腦科學研究所，國家中醫(yī)藥管理局三級科研實驗室，廣東 廣州 510632)

番茄紅素對原代小鼠皮質(zhì)神經(jīng)元的保護作用及機制研究*

黃翠芹， 李 勤▲， 范沖竹， 甘丹卉， 李 安， 趙佳儀， 王 珍， 陸大祥△

(暨南大學醫(yī)學院病理生理學系，腦科學研究所，國家中醫(yī)藥管理局三級科研實驗室，廣東 廣州 510632)

目的： 觀察番茄紅素(lycopene)對氧化損傷的原代皮質(zhì)神經(jīng)元的保護效應并探討其作用機制。方法: 采用原代細胞培養(yǎng)技術(shù)體外分離培養(yǎng)小鼠皮質(zhì)神經(jīng)元，通過免疫熒光染色法檢測微管相關(guān)蛋白2 (microtubule-associated protein 2，MAP-2)的表達進行鑒定。將神經(jīng)元分為4組：正常神經(jīng)元組、叔丁基過氧化氫(tert-butyl hydroperoxide，t-BHP)處理組、t-BHP+lycopene處理組和lycopene處理組，培養(yǎng)24 h，采用MTT法檢測各組神經(jīng)元的活力；采用流式細胞技術(shù)檢測各組神經(jīng)元內(nèi)ROS的水平；Western blot法檢測各組神經(jīng)元Bax、Bcl-2、caspase-3、cleaved caspase-3及細胞色素C蛋白表達的變化。結(jié)果: Lycopene能明顯提高t-BHP處理的神經(jīng)元活性，降低t-BHP處理的神經(jīng)元內(nèi)ROS含量，同時上調(diào)Bcl-2蛋白的表達，降低Bax、cleaved caspase-3和細胞色素C蛋白的表達(P<0.05)。結(jié)論: Lycopene能夠?qū)箃-BHP誘導的原代皮質(zhì)神經(jīng)元的損傷，抑制神經(jīng)元凋亡，其機制可能與降低神經(jīng)元內(nèi)ROS的水平及上調(diào)Bcl-2的表達有關(guān)。

番茄紅素； 腦皮質(zhì)神經(jīng)元； 叔丁基過氧化氫； 氧化應激

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種進行性的神經(jīng)退行性疾病，臨床上表現(xiàn)為記憶、認知功能減退、行為異常和語言功能障礙[1]。其病理特點為神經(jīng)元細胞外β-淀粉樣蛋白聚集形成老年斑、細胞內(nèi)異常磷酸化的Tau蛋白聚集形成神經(jīng)纖維纏結(jié)、神經(jīng)元的缺失和腦血管淀粉樣變性[2]。隨著全球人口老齡化增加，阿爾茨海默病發(fā)病率正逐年上升，由阿爾茨海默病所導致的經(jīng)濟負擔和社會問題也日益嚴重，如今已成為全人類共同面臨的巨大挑戰(zhàn)之一。番茄紅素(lycopene)是一種含有 11個共扼雙鍵及2個非共扼雙鍵的類胡蘿卜素，是一種抗氧化劑，具有極強的清除自由基的能力，其淬滅單線態(tài)氧的速率常數(shù)是維生素E的100倍[3]。研究發(fā)現(xiàn)，番茄紅素不僅具有抗癌、抑癌、降低膽固醇、預防心血管疾病與動脈硬化的作用，還具有增強免疫、延緩衰老及神經(jīng)保護等多種功能[4-7]。叔丁基過氧化氫(tert-butyl hydroperoxide, t-BHP)是一種穩(wěn)定的氧化損傷試劑，在體外實驗中可引起氧化應激，導致細胞內(nèi)ROS水平升高，線粒體功能障礙，DNA損傷及神經(jīng)元凋亡等[8-9]。這些現(xiàn)象與AD的氧化應激損傷機制相符。近年來，t-BHP誘導的神經(jīng)元常被用于模擬神經(jīng)退行性疾病的細胞模型。因此，本研究以原代培養(yǎng)的小鼠皮層神經(jīng)元為研究對象，運用 t-BHP建立神經(jīng)元氧化損傷模型，研究lycopene對t-BHP誘導的原代皮質(zhì)神經(jīng)元的保護作用及其相關(guān)機制，從而提升番茄紅素在阿爾茨海默病防治方面的運用價值。

材 料 和 方 法

1 動物

C57新生小鼠(24 h內(nèi))，SPF級，雌雄不限，購買于南方醫(yī)科大學實驗動物中心，許可證編號：44002100007299。

2 主要試劑

番茄紅素(純度≥95%)購買于廣東省藥品檢驗所；Neurobasal培養(yǎng)液、B27添加劑、多聚賴氨酸、Hanks平衡鹽溶液、胰蛋白酶、谷氨酰胺、高糖培養(yǎng)基和DMEM/F12 培養(yǎng)基均購自Gibco；t-BHP購自Sigma；微管相關(guān)蛋白(microtubule-associated protein 2, MAP-2)、膠質(zhì)細胞原纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)、Bax、Bcl-2、caspase-3、cleaved caspase-3及細胞色素C蛋白的Ⅰ抗購自CST; TIRTC標記山羊抗兔以及FITC標記的山羊抗小鼠Ⅱ抗購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；ROS檢測試劑盒購自碧云天；其它生化試劑均為進口分裝或國產(chǎn)分析純。

3 主要方法

3.1 原代小鼠皮層神經(jīng)元的分離和培養(yǎng) 用12.5 mg/L多聚賴氨酸包被96孔培養(yǎng)板、24孔培養(yǎng)板以及6孔培養(yǎng)板，于超凈臺中過夜。實驗前，用滅菌的去離子水洗板，晾干備用。75%的乙醇消毒新生鼠頭部，冰凍麻醉，無菌條件下打開顱腔取出腦組織置于盛有5 mL高糖培養(yǎng)基的皿中，分離出皮質(zhì)，用精細鑷在顯微鏡下去除腦膜和血管后，將皮質(zhì)移入無菌的盛有2 mL高糖培養(yǎng)基的玻璃瓶中，以上步驟均在4 ℃條件下進行。使用眼科剪將皮質(zhì)剪碎至直徑0.5 mm左右，向組織內(nèi)加入1 mL 0.125%的胰蛋白酶，消化10 min，加入5 mL添加血清的DMEM/F12培養(yǎng)基終止其消化，輕柔吹打數(shù)次，組織懸液通過200目篩網(wǎng)進行過濾，收集濾液，離心1 000 r/min、5 min，棄上清。向細胞沉淀中加入DMEM/F12完全培養(yǎng)基(含 10% FBS)制成細胞懸液，臺盼藍染色計數(shù)，調(diào)整細胞密度為每孔2×104細胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔1.5×105細胞接種于24孔培養(yǎng)板中，每孔7×105細胞接種于6孔培養(yǎng)板中，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。接種4 h時，用原代神經(jīng)元Neurobasal完全培養(yǎng)基(含2% B27)全量換液。培養(yǎng)第3天，原代神經(jīng)元完全培養(yǎng)基半量換液。培養(yǎng)第7天的細胞用于實驗。

3.2 MAP-2免疫熒光染色鑒定神經(jīng)元 培養(yǎng)第7天的神經(jīng)元，棄去培養(yǎng)基，用PBS洗2次，每次3 min。多聚甲醛溶液室溫固定神經(jīng)元30 min，棄多聚甲醛后PBS洗細胞2次。0.1% Triton X-100室溫透化處理細胞10 min(24孔板每孔加入500 μL,6孔板每孔加入1 000 μL)。0.1% BSA 室溫封閉60 min。采用抗體稀釋液稀釋MAP-2的Ⅰ抗至工作濃度(1∶100)，置于濕盒內(nèi)，4 ℃冰箱孵育過夜。第2天，除去Ⅰ抗，用PBS洗3次，每次5 min。標記的Ⅱ抗用封閉液稀釋至工作濃度(1∶200)，濕盒內(nèi)室溫孵育Ⅱ抗60 min。除去Ⅱ抗，用PBS洗細胞3次，每次5 min。滴加DAPI試劑，室溫10 min，PBS 洗3次，每次5 min?？篃晒夥馄瑒┓馄螅瑹晒怙@微鏡下觀察結(jié)果并拍照。

3.3 MTT檢測神經(jīng)元活力 將神經(jīng)元以每孔2×104的密度接種于96孔板中。第7天分為對照組及不同濃度番茄紅素組，每組6個復孔。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后吸出培養(yǎng)基，每孔加終濃度為5 g/L的MTT溶液，繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中孵育4 h。吸出培養(yǎng)基，每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min，在Bio-Rad 酶標儀570 nm 波長處測定各孔吸光度(A)值，對該值進行數(shù)據(jù)分析，評價細胞活力，實驗重復3 次。

3.4 氧化損傷模型的建立 將神經(jīng)元以每孔2×104的密度接種于96孔板中，第7天換液時按照以下方式進行分組：對照組及不同濃度t-BHP組，每組6個復孔，加入t-BHP繼續(xù)培養(yǎng)24 h后吸出培養(yǎng)基。按上述3.3步驟，MTT檢測細胞活力，確定t-BHP作用濃度。

3.5 實驗分組 將原代皮質(zhì)神經(jīng)元以每孔7×105的密度接種于6孔板中。第7 天換液時分為4組，對照組(正常神經(jīng)元組)：不加任何處理因素；模型組(t-BHP處理組)：加入t-BHP作用于原代皮層神經(jīng)元24 h；t-BHP+lycopene處理組：加入番茄紅素預保護4 h 后，再加入t-BHP共作用于原代皮層神經(jīng)元24 h；lycopene處理組：番茄紅素作用原代皮質(zhì)神經(jīng)元24 h。

3.6 流式細胞術(shù)檢測神經(jīng)元內(nèi)ROS的水平 將原代皮質(zhì)神經(jīng)元以每孔7×105的密度接種于6孔板中。第7天換液時分為對照組、t-BHP處理組、t-BHP+lycopene處理組和lycopene處理組，培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)基，PBS洗2次，每孔加入1 mL胰酶，輕柔吹打使之懸浮于消化液中，然后加入含有血清的DMEM/F12 培養(yǎng)基終止消化。收集消化好的細胞進行離心，1 000 r/min離心5 min。棄去上清，各組加入由無血清DMEM/F12配制的終濃度為10 μmol/L的DCFH-DA 熒光探針，置于37 ℃孵育15 min，無血清DMEM/F12洗3次，1 000 r/min 離心5 min，棄上清，最后用300 μL PBS重懸細胞，流式細胞儀檢測。實驗重復3次。

3.7 Western blot 檢測細胞內(nèi)蛋白表達 按照步驟3.5方法處理各組細胞后，棄去舊培養(yǎng)基，用預冷的PBS洗2次，每孔加入80 μL細胞裂解液，冰上裂解30 min，每10 min用細胞刮刮1次細胞，使裂解液與細胞充分混勻，收集混合液，12 000 r/min、4 ℃離心15 min，收集上清液，BCA法測定蛋白濃度。加入相應的loading buffer后，100 ℃變性10 min，分裝后放入-80 ℃冰箱待用。以上樣品，每組取20 μg蛋白上樣，以12% SDS-PAGE分離蛋白，用半干轉(zhuǎn)法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜；5%的脫脂奶粉室溫封閉1 h；分別加入兔抗小鼠Bax、Bcl-2、caspase-3、cleaved caspase-3及細胞色素C蛋白的Ⅰ抗(1∶1 000稀釋)，4 ℃孵育過夜；TBST溶液洗滌3次，每次10 min，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔Ⅱ抗(1∶5 000稀釋)，室溫孵育1 h；TBST溶液洗滌3次，每次10 min；用增強化學發(fā)光法顯色、曝光；使用Quantity One軟件對結(jié)果進行分析；以β-actin或GAPDH為內(nèi)參照進行校正。實驗重復3次。

4 統(tǒng)計學處理

使用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，組間比較用單因素方差分析(one-way AN0VA)，組間兩兩比較用Turkey法檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 原代皮質(zhì)神經(jīng)元的培養(yǎng)與鑒定

采用細胞免疫熒光法對體外培養(yǎng)7 d的新生小鼠原代皮質(zhì)神經(jīng)元進行MAP-2染色鑒定，MAP-2為神經(jīng)微管結(jié)合蛋白，是神經(jīng)元的特異性標志物，可見所培養(yǎng)的細胞90%以上都為神經(jīng)元，純度較高，可用于后續(xù)實驗,見圖1。

Figure 1. Neuron identification. Analysis of MAP-2 protein expression and DAPI in primary mouse cerebrocortical neurons by immunofluorescence (×200).

圖1 免疫熒光法檢測原代小鼠皮質(zhì)神經(jīng)元中MAP-2蛋白的表達

2 MTT結(jié)果

采用MTT法檢測不同濃度的t-BHP和lycopene作用于原代皮質(zhì)神經(jīng)元24 h后細胞活性的變化。結(jié)果顯示：隨著t-BHP濃度的升高，神經(jīng)元的活性逐漸下降，當t-BHP濃度為10 μmol/L時神經(jīng)元的活性為對照組的50.6%±1.0%(P<0.05)；在8 μmol/L濃度范圍內(nèi)，隨著lycopene濃度的升高，神經(jīng)元的活性有所增加，但與對照組比差異無統(tǒng)計學意義。在lycopene濃度為4 μmol/L時，細胞活性最高，同時用光學顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，4 μmol/L的lycopene可逆轉(zhuǎn)10 μmol/L t-BHP損傷的神經(jīng)元形態(tài)恢復至接近正常組；根據(jù)上述結(jié)果，確定以10 μmol/L t-BHP為模型的損傷濃度，4 μmol/L lycopene為藥物保護濃度，見圖2。

Figure 2.The effects of t-BHP and lycopene on primary mouse cerebrocortical neurons. A: neurons were treated with t-BHP at various concentration for 24 h and cell viability was examined by MTT assay; B: neurons were treated with lycopene at various concentration for 24 h and cell viability was examined by MTT assay; C: neurons were treated with t-BHP (10 μmol/L) or/and lycopene for 24 h and cell viability was examined by MTT assay; D: effects of lycopene on t-BHP-induced cell viability observed by microscopy (×200). Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vst-BHP group.

圖2 MTT法和光學顯微鏡觀察lycopene對t-BHP誘導神經(jīng)元損傷的影響

3 流式細胞術(shù)檢測神經(jīng)元內(nèi)ROS的結(jié)果

以DCFH-DA為熒光探針采用流式細胞術(shù)檢測神經(jīng)元內(nèi)ROS的水平，與對照組比較，t-BHP處理組的ROS水平明顯升高(P<0.05)；與t-BHP處理組比較，lycopene+t-BHP組的ROS水平顯著下降(P<0.05)。這一結(jié)果提示lycopene可以對抗t-BHP引起的ROS水平的升高,見圖3。

Figure 3. ROS production in primary mouse cerebrocortical neurons detected by flow cytometry. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vst-BHP group.

圖3 流式細胞術(shù)檢測神經(jīng)元內(nèi)ROS的水平

4 Western blot實驗結(jié)果

Western blot檢測發(fā)現(xiàn)新生小鼠原代皮質(zhì)神經(jīng)元t-BHP損傷后線粒體凋亡途徑相關(guān)凋亡蛋白表達明顯增加，而抗凋亡蛋白降低。t-BHP處理組Bax和Bcl-2的比值較對照組增加(P<0.05)，加入lycopene后，Bax/Bcl-2比值顯著下降；活化的凋亡執(zhí)行蛋白caspase-3 (cleaved caspase-3)在t-BHP處理組表達增加，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而加入lycopene后，其表達顯著降低，與t-BHP處理組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。同時還發(fā)現(xiàn)t-BHP組中細胞色素C蛋白表達顯著增加且與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，加入lycopene后可使其表達下降，與t-BHP處理組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。以上結(jié)果表明lycopene可以下調(diào)t-BHP誘導的神經(jīng)元Bax的表達、上調(diào)Bcl-2的表達、降低caspase-3的活化水平，見圖4。

Figure 4. Effects of lycopene on Bax, Bcl-2, caspase-3, cleaved caspase-3 and cytochrome C (Cyt-C) protein expression in primary mouse cerebrocortical neurons. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vst-BHP group.

圖4 Western blot法檢測各組凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、caspase-3、cleaved caspase-3和細胞色素C的表達變化

討 論

阿爾茨海默病是一類嚴重威脅人類健康的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病?，F(xiàn)普遍認為氧化應激及其引發(fā)的線粒體功能障礙是許多神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病發(fā)生和發(fā)展的主要因素[10]。神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的共同特征是神經(jīng)細胞凋亡和壞死[11]。線粒體是控制細胞凋亡的中心和產(chǎn)生氧自由基的主要場所，氧自由基可以導致線粒體膜脂質(zhì)體過氧化，功能蛋白結(jié)構(gòu)變異變性以及線粒體 DNA 突變斷裂、DNA 解聚和分子交聯(lián)等氧化損傷[12]，致使線粒體功能障礙，進而促進線粒體呼吸鏈大量 ROS 的生成和線粒體抗氧化系統(tǒng)功能的降低，形成惡性循環(huán)，最終線粒體凋亡途徑被激活，導致大量神經(jīng)細胞的凋亡和壞死[13]。

氧化損傷引起的神經(jīng)元丟失與神經(jīng)退行性疾病有密切關(guān)系[14]。大量實驗證實神經(jīng)退行性疾病中，神經(jīng)元丟失過多是由于凋亡通路被激活后誘發(fā)凋亡所致[15]。其中Bcl-2 家族蛋白質(zhì)是線粒體凋亡途徑的主要調(diào)控因子，上調(diào)Bcl-2 成為抑制神經(jīng)退行性疾病的細胞凋亡相關(guān)藥物的一類重要靶標。在凋亡通路中，半胱氨酸蛋白酶成員caspase-3 一直被認為是凋亡發(fā)生的執(zhí)行者，大量實驗證實caspase-3 被抑制后細胞能夠抵抗來自多種損傷引起的細胞凋亡[16-17]。同時，當線粒體功能障礙時，線粒體膜通道孔開放致使線粒體膜通透性改變，細胞色素C可以從線粒體內(nèi)膜釋放到細胞漿中，因此，細胞素色C是線粒體介導細胞凋亡途徑不可缺少的重要因子，其釋放也是線粒體功能受損的重要標志[18-19]。Lycopene是一種天然類胡蘿卜素，是高效的抗氧化劑和自由基清除劑。Lycopene在多種細胞中驗證能夠減少細胞凋亡，例如Aβ1-42引起的神經(jīng)元凋亡、MPP + 誘導的SH-SY5Y 細胞凋亡及TMT誘導神經(jīng)元凋亡等[20-26]。本課題以原代培養(yǎng)的小鼠皮質(zhì)神經(jīng)元為研究對象，運用t-BHP建立神經(jīng)元氧化損傷模型，探討lycopene對t-BHP誘導損傷的神經(jīng)元的保護作用及其機制。結(jié)果觀察到lycopene可以對抗t-BHP誘導的神經(jīng)元的氧化損傷和凋亡，顯著降低神經(jīng)元內(nèi)ROS的水平，有效抑制線粒體對細胞色素C的釋放和caspase-3的活化，同時降低Bax/Bcl-2的比值。綜上結(jié)果表明，lycopene對抗t-BHP誘導的神經(jīng)元的氧化損傷作用與阻斷線粒體凋亡途徑密切相關(guān)。

根據(jù)上述實驗結(jié)果，本研究初步證明了lycopene能夠?qū)箃-BHP誘導的原代皮質(zhì)神經(jīng)元的氧化損傷，抑制神經(jīng)元凋亡，從而發(fā)揮其對神經(jīng)元的保護作用，在防治以氧化應激損傷為靶點的神經(jīng)退行性疾病方面具有潛在的應用價值。

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(責任編輯： 林白霜， 羅 森)

Lycopene protects primary mouse cerebrocortical neurons against t-BHP-induced damageinvitro

HUANG Cui-qin, LI Qin, FAN Chong-zhu, GAN Dan-hui, LI An, ZHAO Jia-yi, WANG Zhen, LU Da-xiang

(DepartmentofPathophysiology,InstituteofBrainResearch,KeyLaboratoryofStateAdministrationofTraditionalChineseMedicine,SchoolofMedicine,JinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:ldx@jnu.edu.cn)

AIM: To investigate the protective effect of lycopene on primary mouse cerebrocortical neurons exposed to tert-butyl hydroperoxide (t-BHP) and its mechanisms ofinvitro. METHODS: Primary cerebrocortical neurons of newborn C57 mice were extracted and divided into normal group, t-BHP group, lycopene+t-BHP group and lycopene group. The neuronal damage was induced by t-BHP exposure for 24 h, and the cell viability was examined by MTT assay. ROS content was measured by flow cytometry, and the protein levels of Bax, Bcl-2, caspase-3, cleaved caspase-3 and cytochrome C were examined by Western blot. RESULTS: The primary mouse cortical neurons expressed MAP-2 protein. Lycopene at concentration of 4 μmol/L reversed the decrease in cell viability. Flow cytometry revealed that lycopene treatment attenuated ROS content under the condition of t-BHP exposure. In addition, the protein level of Bcl-2 was increased, and the expression of Bax, cleaved caspase-3 and cytochrome-C was suppressed in lycopene+t-BHP group. CONCLUSION: The protective effect of lycopene on cortical neurons with t-BHP-induced injury may be involved in the mechanism of neuronal antioxidative response by down-regulating caspase-3 and Bax/Bcl-2 through the mitochondrial apoptotic pathway.

Lycopene; Cerebrocortical neurons; Tert-butyl hydroperoxide; Oxidative stress

1000- 4718(2017)02- 0208- 07

2016- 11- 14

2016- 12- 02

國家自然科學基金資助項目(No.81471236)

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.02.003

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