miR-124通過靶基因IQGAP1調(diào)控甲狀腺癌細(xì)胞分化、增殖的機(jī)制

于 佳 何 慶 劉玲梅 李宇琛

(天津市海河醫(yī)院內(nèi)科，天津 300350)

miR-124通過靶基因IQGAP1調(diào)控甲狀腺癌細(xì)胞分化、增殖的機(jī)制

于 佳 何 慶1劉玲梅 李宇琛

(天津市海河醫(yī)院內(nèi)科，天津 300350)

目的 探討miR-124對甲狀腺癌細(xì)胞的作用機(jī)制。方法 通過RT-PCR檢測人甲狀腺癌細(xì)胞K1、BCPAP、TPC-1和人甲狀腺細(xì)胞Nthy-ori 3-1中miR-124的表達(dá)水平。MTT法檢測甲狀腺癌細(xì)胞K1轉(zhuǎn)染miR-124 mimics、mimics control后的細(xì)胞存活率。根據(jù)靶基因預(yù)測軟件The miRBase、TargetScan、PicTar預(yù)測miR-124的靶基因IQGAP1，構(gòu)建wt-IQGAP1和mut-IQGAP1，采用雙熒光素酶活性檢測鑒定靶基因的正確性。Western印跡檢測轉(zhuǎn)染miR-124 mimics、mimics control后甲狀腺癌細(xì)胞K1中IQGAP1的表達(dá)情況。甲狀腺癌細(xì)胞K1中轉(zhuǎn)染siIQGAP1和siIQGAP1 control，用MTT檢測細(xì)胞增殖能力，Western印跡檢測細(xì)胞中IQGAP1蛋白表達(dá)含量。結(jié)果 甲狀腺癌細(xì)胞K1、BCPAP、TPC-1中的miR-124的相對表達(dá)量與甲狀腺細(xì)胞相比差異顯著(P<0.05)，三種甲狀腺癌細(xì)胞中K1細(xì)胞的表達(dá)量最低。轉(zhuǎn)染后12 h內(nèi)，空白組、miR-124 mimics組和mimics control組的甲狀腺癌K1細(xì)胞的存活數(shù)量差異不顯著(P>0.05)，從轉(zhuǎn)染后12 h開始，miR-124 mimics組與對照組、mimics control組相比，甲狀腺癌細(xì)胞生長抑制明顯。預(yù)測miR-124的靶基因可能為IQGAP1，轉(zhuǎn)染miR-124 mimics 野生型IQGAP1中熒光素酶活性比突變型IQGAP1中熒光素酶活性顯著降低，差異顯著(P<0.05)。mimics control和wt-IQGAP1和mut-IQGAP1共轉(zhuǎn)染組比較無明顯差異(P>0.05)。轉(zhuǎn)染miR-124 mimics組甲狀腺癌K1細(xì)胞IQGAP1蛋白明顯下降，miR-124負(fù)調(diào)控IQGAP1的表達(dá)。抑制甲狀腺癌K1細(xì)胞中IQGAP1基因，細(xì)胞增殖能力減弱，細(xì)胞中IQGAP1蛋白表達(dá)減弱。結(jié)論 miR-124在甲狀腺癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，miR-124可以抑制甲狀腺癌細(xì)胞的增殖分化，其通過負(fù)調(diào)控靶基因IQGAP1抑制癌細(xì)胞增殖分化。

甲狀腺癌；miRNA；靶基因；增殖

甲狀腺癌發(fā)病率高，致死率高，治療預(yù)后差〔1〕，因此，尋找治療和診斷甲狀腺癌的小分子標(biāo)志物對于提高甲狀腺癌的診斷率和治療效果都具有重要意義。miRNA是一種小分子的RNA，由20～25個核苷酸組成〔2〕。生物機(jī)體內(nèi)存在多種小RNA分子，這些小分子是非編碼性的單鏈RNA，具有多種生物學(xué)功能。近年來，小RNA分子與腫瘤的關(guān)系受到廣泛關(guān)注，在胃癌、肝癌、乳腺癌、宮頸癌、淋巴癌等多種腫瘤中已經(jīng)得到驗(yàn)證〔3〕。miR-124在乳腺癌、胃癌中表達(dá)下調(diào)〔4〕，但關(guān)于miR-124在甲狀腺癌中的表達(dá)研究尚未見相關(guān)報(bào)道。本研究通過對比多種甲狀腺癌細(xì)胞中miR-124表達(dá)水平，研究miR-124對甲狀腺癌細(xì)胞增殖的影響，探討miR-124對相關(guān)靶基因的調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 人甲狀腺癌細(xì)胞K1、BCPAP、TPC-1和人甲狀腺細(xì)胞Nthy-ori 3-1均為本實(shí)驗(yàn)室保存。主要儀器與試劑：酶標(biāo)儀(南京德鐵實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，紫外分光光度計(jì)(美國Thermo)，CO2培養(yǎng)箱(日本SANYO)，超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司)，倒置顯微鏡(日本尼康)，水浴鍋(上海精密儀器儀表公司)，離心機(jī)(湖南恒諾醫(yī)用設(shè)備有限公司)，熒光素酶檢測試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒〔寶生物工程(大連)有限公司〕，DMEM培養(yǎng)基(美國Sigma)，DAB顯色液(美國Thermo)，Triozl細(xì)胞裂解液(美國Thermo)，抗體稀釋液(杭州聯(lián)科生物股份有限公司)，胎牛血清(FBS)(杭州四季青有限公司)，MTT(碧云天生物技術(shù)有限公司)，青鏈霉素(美國Sigma)，PBS(碧云天生物技術(shù)有限公司)，胰蛋白酶(美國Sigma)，脫脂奶粉(雅培)，細(xì)胞總蛋白提取(碧云天生物技術(shù)有限公司)，Real-time PCR試劑盒(上海欣百諾生物工程有限公司)，兔抗IQGAP1多克隆抗體(北京博爾邁生物技術(shù)有限公司)，鼠抗人β-actin抗體(北京博爾邁生物技術(shù)有限公司)，辣根過氧化物標(biāo)記的二抗(北京博爾邁生物技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 從液氮罐中取出人甲狀腺癌細(xì)胞K1、BCPAP、TPC-1和人甲狀腺細(xì)胞Nthy-ori 3-1，放置于37℃水浴鍋中融化，觀察細(xì)胞完全融化后，加入8倍體積的細(xì)胞生長液(含青霉素100 U/ml，鏈霉素0.1 mg/ml，15%FBS的DMEM培養(yǎng)基，pH7.2)，1 000 r/min離心10 min，棄上清，加入細(xì)胞生長液，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。觀察細(xì)胞生長液顏色變淺時，加入0.5%的胰蛋白酶消化細(xì)胞，1 000 r/min離心10 min，棄去胰蛋白酶消化液，加入新鮮的細(xì)胞生長液懸浮細(xì)胞，接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。

1.2.2 RT-PCR檢測細(xì)胞中miR-124表達(dá) 取對數(shù)生長期的人甲狀腺癌細(xì)胞K1、BCPAP、TPC-1和人甲狀腺細(xì)胞Nthy-ori 3-1，加入適量Triozl細(xì)胞裂解液，放置于冰上靜置5 min，用移液槍吹打細(xì)胞。將裂解的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至1.5 ml EP管中，加入200 μl氯仿充分混勻，上下顛倒10次，室溫靜置3 min。4℃12 000 r/min離心15 min，吸取水相層至新的EP管中，加入異丙醇500 μl混合均勻，室溫下靜置20 min，4℃ 12 000 r/min離心15 min，棄上清。加入75%的乙醇充分混合，10 000 r/min離心5 min，棄上清，放置于超凈工作臺中晾干，加入DEPC水，-80℃保存。用紫外分光光度計(jì)檢測提取的RNA濃度及純度，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄合成各組細(xì)胞miR-124的cDNA，按照熒光定量PCR試劑盒操作說明書擴(kuò)增miR-124的cDNA，分析各組細(xì)胞中miR-124表達(dá)水平。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取對數(shù)生長期的甲狀腺癌細(xì)胞K1，加入胰蛋白酶消化后，接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，調(diào)整細(xì)胞濃度為每毫升含有5×103個細(xì)胞，37℃、CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，觀察細(xì)胞融合度大約為80%后，將細(xì)胞生長液換成不含血清的DMEM不完全培養(yǎng)基繼續(xù)孵育1 h以增加轉(zhuǎn)染效率。將5 μl轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000與250 μl的不完全培養(yǎng)基混合均勻后，室溫下靜置5 min，同時取250 μl的不完全培養(yǎng)基與miR-124 mimics、mimics control混合室溫靜置5 min。將Lipofectamine 2000混合物加入到miR-124 mimics、mimics control混合物中，室溫靜置20 min。將混合物加入到細(xì)胞中，37℃、CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，換含有胎牛血清的完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.4 MTT法檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞增殖情況 轉(zhuǎn)染miR-124 mimics、mimics control后的K1細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，同時設(shè)置空白對照組，空白對照組用未轉(zhuǎn)染的甲狀腺癌細(xì)胞K1，細(xì)胞濃度為3×105個/ml，每孔加入100 μl細(xì)胞懸液，37℃、CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，加入50 μl MTT溶液(濃度為5 mg/ml)，37℃孵育4 h。小心棄去上清，加入150 μl DMSO溶液混合，搖床震蕩10 min，觀察結(jié)晶物充分溶解后，放置于酶標(biāo)儀上檢測各孔吸光度，為了提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，每組設(shè)置8個復(fù)孔。觀察細(xì)胞存活情況。

1.2.5 miR-124靶基因預(yù)測與鑒定 根據(jù)靶基因預(yù)測軟件The miRBase(http://www.mirbase.org/)、TargetScan(http://www.targetscan.org/)、PicTar(http://pictar.mdc-berlin.de/)預(yù)測miR-124的靶基因，結(jié)果顯示IQGAP1可能是miR-124的靶基因。分別構(gòu)建野生型IQGAP1熒光素酶報(bào)告基因載體(wt-IQGAP1)和突變型IQGAP1熒光素酶報(bào)告基因載體(mut-IQGAP1)，將這兩種質(zhì)粒wt-IQGAP1和mut-IQGAP1分別與miR-124 mimics和mimics control混合后共同轉(zhuǎn)染到甲狀腺癌K1細(xì)胞中，37℃、CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。收集的細(xì)胞經(jīng)PBS洗滌后，根據(jù)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒檢測熒光素酶活性。

1.2.6 Western印跡檢測IQGAP1的表達(dá) 轉(zhuǎn)染miR-124 mimics、mimics control后的甲狀腺癌K1細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞并加入冰預(yù)冷的PBS反復(fù)洗滌細(xì)胞3次，胰蛋白酶消化細(xì)胞后，10 000 r/min離心5 min，加入適量PBS懸浮細(xì)胞，10 000 r/min離心5 min，棄上清，重復(fù)洗滌細(xì)胞2次。加入細(xì)胞蛋白提取液充分混合，放置于冰上孵育20 min，振蕩器上震蕩10 min。吸取裂解細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管中，1 000 r/min離心10 min，取蛋白上清置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｗ贤夥止夤舛扔?jì)測定蛋白濃度及純度，取蛋白樣品與loading buffer混合，100℃煮沸變性5 min。SDS蛋白膠用12%分離膠和5%濃縮膠，80 V電壓電泳觀察溴酚藍(lán)進(jìn)入濃縮膠和分離膠交界處，調(diào)整電壓為120 V至電泳結(jié)束。取出蛋白凝膠置于電泳緩沖液中浸泡20 min，按照濾紙、PVDF膜、蛋白凝膠、濾紙的順序在300 mA轉(zhuǎn)膜90 min。取出PVDF膜加5%脫脂奶粉的封閉液在37℃封閉2 h，PBST洗滌PVDF膜，加入一抗，室溫下孵育2 h，PBST洗滌3次，每次5 min，加二抗孵育過夜。PBST洗膜，加入DAB顯色液，暗室中曝光，用凝膠光密度軟件分析蛋白表達(dá)含量。

1.2.7 IQGAP1對細(xì)胞增殖影響 將處于對數(shù)生長期的甲狀腺癌細(xì)胞K1轉(zhuǎn)染siIQGAP1和 siIQGAP1 control，MTT法檢測細(xì)胞增殖情況，轉(zhuǎn)染方法同1.2.3，MTT法檢測細(xì)胞增殖同1.2.4。Western印跡檢測轉(zhuǎn)染siIQGAP1和 siIQGAP1 control后的甲狀腺癌細(xì)胞中IQGAP1 的表達(dá)水平，方法同1.2.6。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS13.0軟件行方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 各組細(xì)胞中miR-124的表達(dá)檢測 甲狀腺癌細(xì)胞K1中miR-124相對表達(dá)量為(1.14±0.11)，BCPAP中為(3.24±0.21)，TPC-1中為(2.31±0.16)，Nthy-ori 3-1中為(3.98±0.24)。甲狀腺癌細(xì)胞K1、BCPAP、TPC-1中的miR-124的相對表達(dá)量與甲狀腺細(xì)胞相比差異顯著(P<0.05)，三種甲狀腺癌細(xì)胞中K1細(xì)胞的表達(dá)量最低。

2.2 MTT法檢測細(xì)胞增殖情況 轉(zhuǎn)染后12 h內(nèi)，空白組、miR-124 mimics組和mimics control組的甲狀腺癌K1細(xì)胞的OD值差異不顯著(P<0.05)。從轉(zhuǎn)染后12 h開始，miR-124 mimics組與空白組、mimics control組相比，細(xì)胞生長抑制明顯(見圖1)。從轉(zhuǎn)染后48 h開始，miR-124 mimics組與空白組、mimics control組相比細(xì)胞吸光度差異顯著(P<0.05)，miR-124可以明顯抑制甲狀腺癌細(xì)胞K1的增殖。

與空白組比較：1)P<0.05 圖1 MTT法檢測miR-124對甲狀腺癌細(xì)胞K1的存活影響

2.3 miR-124靶基因鑒定 轉(zhuǎn)染miR-124 mimics 野生型IQGAP1中熒光素酶活性比突變型IQGAP1中熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)。mimics control與wt-IQGAP1和mut-IQGAP1共轉(zhuǎn)染組無明顯差異(P>0.05)，說明miR-124的靶基因?yàn)镮QGAP1。

2.4 Western印跡檢測IQGAP1蛋白表達(dá)含量 將轉(zhuǎn)染有miR-124 mimics的甲狀腺癌K1細(xì)胞中IQGAP1蛋白表達(dá)含量與空白組和mimics control組相比差異顯著(P<0.01)?？瞻捉M和mimics control組的IQGAP1蛋白表達(dá)含量差異不顯著(P>0.05)。miR-124 mimics組甲狀腺癌K1細(xì)胞IQGAP1蛋白明顯下降(圖2)，說明miR-124 mimics可以有效抑制IQGAP1蛋白的表達(dá)，miR-124負(fù)調(diào)控IQGAP1的表達(dá)。

1：miR-124 mimics;2:mimics control;3:空白組圖2 Western印跡檢測IQGAP1蛋白表達(dá)情況

2.5 IQGAP1對甲狀腺癌細(xì)胞影響 轉(zhuǎn)染siIQGAP1后的甲狀腺癌細(xì)胞K1與對照組相比增殖能力明顯減弱(P<0.05)。提示siIQGAP1可以明顯減弱細(xì)胞中IQGAP1蛋白的表達(dá)量。見圖3。

圖3 IQGAP1對甲狀腺癌細(xì)胞的影響

3 討 論

甲狀腺癌早期臨床癥狀不明顯且不易察覺，目前治療甲狀腺癌的方法主要有非手術(shù)治療和手術(shù)治療，非手術(shù)治療可以有效緩解癥狀，延長生存率，主要應(yīng)用于晚期腫瘤不能完全切除的患者；手術(shù)治療一般適用于早期診斷為甲狀腺瘤的患者，對患者的身體狀況要求較高〔5〕。傳統(tǒng)的診斷和治療方法具有很大的局限性，給甲狀腺腫瘤早期診斷和治療帶來了巨大挑戰(zhàn)。甲狀腺癌的發(fā)生和發(fā)展受多種基因、多種信號因子的調(diào)控〔6〕，尋找診斷和治療甲狀腺癌的小分子標(biāo)志物是目前迫切需要解決的問題。

miRNA是一種小分子的RNA，在機(jī)體中具有調(diào)控功能，有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA可以調(diào)控細(xì)胞的生長和凋亡，與胰島素的分泌、大腦形態(tài)形成都有密切關(guān)系〔7〕。近年來，miRNA與腫瘤之間的關(guān)系也得到廣泛關(guān)注，有研究發(fā)現(xiàn)miRNA具有抑癌基因和癌基因的作用〔8〕。研究表明，miR-125b與乳腺癌、卵巢癌、肺癌、肝癌有密切關(guān)系，在癌癥的發(fā)生過程中起到抑癌基因的作用。miR-15a和miR-16-1在淋巴瘤和骨髓瘤中低表達(dá)，通過上調(diào)Bcl-2的表達(dá)促進(jìn)癌癥的發(fā)生。miR-21在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中過度表達(dá)，表達(dá)水平是正常組織的100倍，可以通過抑制癌細(xì)胞凋亡促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。miR-17-5p、miR-18a、miR-19b等都是目前為止在淋巴瘤中得到驗(yàn)證的癌基因〔9〕。

miR-124已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)在乳腺癌、肝癌、胃癌細(xì)胞和組織中低表達(dá)，為一種抑癌基因。為了探究miR-124在甲狀腺癌中的作用機(jī)制，本研究選用了人甲狀腺癌細(xì)胞K1、BCPAP、TPC-1和人甲狀腺細(xì)胞Nthy-ori 3-1，通過細(xì)胞RNA提取，反轉(zhuǎn)錄合成miR-124的cDNA，RT-PCR檢測細(xì)胞中miR-124的表達(dá)水平。結(jié)果提示，miR-124在人甲狀腺癌細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯低于人甲狀腺細(xì)胞Nthy-ori 3-1，說明miR-124在甲狀腺癌細(xì)胞中低表達(dá)，發(fā)揮抑癌基因的作用。轉(zhuǎn)染miR-124 mimics、mimics control

的甲狀腺癌K1細(xì)胞經(jīng)MTT法檢測，miR-124mimics可以明顯抑制甲狀腺癌K1細(xì)胞的增殖，進(jìn)一步驗(yàn)證了miR-124的抑癌作用。

miRNA主要通過作用于靶基因發(fā)揮抑癌或癌基因的作用。有研究表明miR-221可以作用于靶基因BRAF發(fā)揮作用。miR-21作用于靶基因PNTE，下調(diào)PNTE的表達(dá)，而PNTE與信號通路PIK/AKT有關(guān)。miR-124在肝癌細(xì)胞中干擾STAT3信號通路發(fā)揮抑癌基因作用，在胃癌中，miR-124可以下調(diào)靶基因EZH2的表達(dá)，在乳腺癌細(xì)胞中，miR-124作用于靶基因FLOT1影響癌細(xì)胞的增殖和侵襲力〔10〕。

IQGAP1是一種支架蛋白，為IQGAPs家族的一員。IQGAP1含有能與多種蛋白相結(jié)合的區(qū)域，可以與Rac1、ERK、Src等多種蛋白相結(jié)合作用于信號通路MAPK和Wnt。在肝癌中，IQGAP1過表達(dá)可以活化Wnt信號通路，促進(jìn)肝癌的發(fā)生和發(fā)展，IQGAP1在乳腺癌中高表達(dá)，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖分化〔11〕。本研究通過轉(zhuǎn)染miR-124 mimics、mimics control，Western blot 檢測細(xì)胞中IQGAP1的表達(dá)水平，與空白組相比IQGAP1表達(dá)明顯下降，說明IQGAP1是一種癌基因，miR-124 mimics可以有效降低IQGAP1的表達(dá)。通過抑制IQGAP1基因，可使甲狀腺癌細(xì)胞增殖能力明顯減弱，說明miR-124可通過作用于IQGAP1基因抑制甲狀腺癌細(xì)胞增殖。

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〔2016-06-15修回〕

(編輯 郭 菁)

何 慶(1969-)，男，博士，主任醫(yī)師，主要從事糖尿病、甲狀腺等內(nèi)分泌疾病研究。

于 佳(1983-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事內(nèi)分泌研究。

R73

A

1005-9202(2017)03-0566-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.03.018

1 天津市醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院內(nèi)分泌科