人輔酶Ⅱ依賴性視黃醇脫氫/還原酶在宮頸癌中的研究進(jìn)展

鄧田園綜述周瑾第一審校張藝峰第二審校

(1.新疆軍區(qū)總醫(yī)院婦產(chǎn)科，新疆烏魯木齊830000；2.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院，新疆石河子832000；3.新余市婦幼保健院婦產(chǎn)科，江西新余338000)

人輔酶Ⅱ依賴性視黃醇脫氫/還原酶在宮頸癌中的研究進(jìn)展

鄧田園1，2綜述周瑾1第一審校張藝峰3第二審校

(1.新疆軍區(qū)總醫(yī)院婦產(chǎn)科，新疆烏魯木齊830000；2.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院，新疆石河子832000；3.新余市婦幼保健院婦產(chǎn)科，江西新余338000)

視黃酸(rRA)是維生素A的活性代謝產(chǎn)物，在胚胎發(fā)育和細(xì)胞的生長及分化過程中發(fā)揮重要作用。視黃酸相關(guān)物質(zhì)與腫瘤細(xì)胞的分化、增殖或凋亡等密切相關(guān)。作為視黃酸代謝酶的一種，人輔酶Ⅱ依賴性視黃醇脫氫/還原酶(NRDR)被證實了其剪接的異常及蛋白酶活性變化和宮頸鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。本文，我們將詳述NRDR的研究現(xiàn)狀和未來前景。

維甲酸；人輔酶Ⅱ依賴性視黃醇脫氫/還原酶；宮頸癌

宮頸癌(cervical carcinoma)是一種常見的惡性婦科腫瘤，嚴(yán)重威脅婦女生命健康，其危險因素除了高危型人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)感染，機體基因易感性也參與了它的發(fā)生，有研究指出宮頸癌對婦女的危害在發(fā)展中國家更加顯著[1]。人輔酶Ⅱ依賴性視黃醇脫氫/還原酶[NADP(H)-dependent retinol dehydrogenase/reductase，NRDR]是一種維甲酸(retinoic acid，RA)代謝酶，有研究結(jié)果表明，宮頸鱗癌的發(fā)生發(fā)展與NRDR選擇性剪接的異常及其蛋白酶活性的改變關(guān)系緊密；并且癌蛋白E6E7發(fā)生降解過程中，NRDR、Hsp70與HPVE6E7之間的相互作用發(fā)揮了一定的促進(jìn)作用，這可能是NRDR影響宮頸癌發(fā)生的機制之一，因此備受關(guān)注。

1 維甲酸代謝酶NRDR

視黃酸，又稱維甲酸、異維A酸，是動物體內(nèi)維生素A的代謝中間產(chǎn)物。分子式：C20H28O2，分子量300.44，CAS號302-79-4，熔點180℃。它具有廣泛的生理學(xué)及藥理學(xué)活性，是維生素A的生物活性代謝產(chǎn)物，諸多的研究表明，其具有調(diào)控特定上皮細(xì)胞的分化、抑制腫瘤的發(fā)生等作用[2]。在維甲酸的體內(nèi)合成過程中，必經(jīng)的步驟—視黃醇到視黃醛再到視黃酸，關(guān)鍵部位即視黃醇到視黃醛的轉(zhuǎn)化過程?；谠撨^程的研究中，Napoli等[3]在動物肝臟微粒體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了能分解視黃醇生成視黃醛的NADP依賴型酶類，其屬于短鏈脫氫還原酶超家族(SDR)，且此酶及其同工酶在催化過程中起著限速作用。

NRDR是Sierra-Torres等[4]首先從兔肝中發(fā)現(xiàn)并純化的一種維甲酸(retinoic acid，RA)代謝酶，于各種哺乳動物肝臟組織中均有分布，具有調(diào)節(jié)體內(nèi)環(huán)境維甲酸的合成與代謝的作用。NRDR在生理條件下具有RA還原活性，且該作用較已知的短鏈脫氫酶家族(SDR)其他成員更強。這使得前一階段各方面對NRDR的研究驟然增多。

2 NRDR于腫瘤方面研究現(xiàn)狀

流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)證實：攝入的維生素A的量或其于血漿的濃度與多種癌癥如乳腺癌、肺癌、肝癌等的發(fā)生呈反比關(guān)系。最近楊清遠(yuǎn)等[5]通過對其2009-2012年收集的食管癌患者病理標(biāo)本的提取，通過RT-PCR等過程分析后指出：細(xì)胞視黃酸結(jié)合蛋白2 (CRABP2)在相關(guān)抑癌基因的下調(diào)、腫瘤的分化、TNM分期及轉(zhuǎn)移中都存在重要作用。該實驗通過直接的流式細(xì)胞分析得到結(jié)論，且結(jié)論涉及腫瘤分化、TNM分期等，結(jié)果可信度稍差，實驗分組及標(biāo)本納入標(biāo)準(zhǔn)方面值得再推敲，但總體結(jié)論是與當(dāng)前主流研究相符，在一定程度上證實了維甲酸的抗癌作用；劉紅等[6]通過建立肺癌移植瘤動物模型實驗后認(rèn)為：(1)全反式維甲酸與順鉑都有抑制肺癌A549細(xì)胞裸鼠移植瘤生長，促進(jìn)移植瘤細(xì)胞凋亡的作用，但二者聯(lián)合作用效果相比較更加突出。(2)二者對腫瘤細(xì)胞的抑制作用可能與抑制bcl-2基因表達(dá)下調(diào)同時促進(jìn)bax基因表達(dá)上調(diào)，及bcl-2基因抑制細(xì)胞的增殖和bax基因促進(jìn)細(xì)胞的凋亡有關(guān)聯(lián)。該實驗分組情況好，各病理類型明確，對照完備，雖為動物模型實驗，亦存一定指導(dǎo)意義。相似情況于國內(nèi)外研究中均可見到，如Castillo等[7]提出的對與甲狀腺癌的類似抑制作用、崔潔等[8]對肝癌模型的研究指出：ATRA(全反式維甲酸)可抑制腫瘤細(xì)胞Hepa1-6增殖，并具有濃度依賴性，促進(jìn)其凋亡，干擾其遷移及侵襲能力，這與抑制細(xì)胞的間質(zhì)表型及ATRA上調(diào)MicroRNA200家族密切相關(guān)。NRDR作為有更強還原性的RA代謝酶，與之關(guān)系較密切的腫瘤卻是宮頸癌。

3 NRDR在宮頸癌中的研究進(jìn)展

Cervical Carcinoma是婦科三大惡性腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率高，發(fā)病年齡逐漸年輕化，尤其在25～34歲年齡組發(fā)病率上升明顯。宮頸癌前病變及宮頸癌變的重要因素在臨床廣泛認(rèn)可的是持續(xù)性的高危型人乳頭瘤病毒(human papilloma virus，HPV)感染，但HPV感染并不是引起宮頸癌的唯一因素[9]。很多與宮頸癌發(fā)病相關(guān)因素的研究逐漸增多，其中有關(guān)的基因研究已成為一個熱點，多項研究表明宮頸癌的發(fā)病與基因的變異所引發(fā)的一系列改變有關(guān)。有研究結(jié)果表明，宮頸鱗癌的發(fā)生發(fā)展與NRDR選擇性剪接的異常及其蛋白酶活性的改變關(guān)系緊密；并且NRDR、Hsp70與HPVE6、E7之間相互作用并促使癌蛋白E6、E7發(fā)生降解，可能是NRDR影響宮頸癌發(fā)生的機制之一[10-11]。Helm等[12]通過對CINⅠ、CINⅡ及CINⅢ的病變患者外源性應(yīng)用NRDR類物質(zhì)，借此來觀察病變轉(zhuǎn)歸情況，從而得到結(jié)果：此類物質(zhì)的應(yīng)用對于CINⅡ轉(zhuǎn)歸為低階病變甚至正常組織效果較為明顯，對于CINⅠ樣本數(shù)及其他干擾因素所致的結(jié)論信服力足，而在CINⅢ的轉(zhuǎn)歸方面，維甲酸代謝酶類無明顯作用。這從側(cè)面證明了NRDR類物質(zhì)對于宮頸的腫瘤防治作用，而之所以對CINⅢ的轉(zhuǎn)歸效果較差，原因可能在于病變組織內(nèi)部NRDR新的剪接亞型過表達(dá)對外源性類似物質(zhì)的抑制作用所致。實際情況，在HPV感染基礎(chǔ)上，是不是會增加宮頸癌對相關(guān)某些暴露的易感性，這本身就值得進(jìn)一步商榷。黃東陽等[13]實驗發(fā)現(xiàn)NRDR的異常選擇性剪接、新剪接亞型NRDRB1細(xì)胞內(nèi)定位及蛋白酶活性的改變在宮頸癌的發(fā)生與發(fā)展中可能發(fā)揮重要作用，此猜想依托大量嚴(yán)謹(jǐn)實驗，有一定可信度，較僅憑猜想得來的結(jié)論更具說服力。

黃東陽等[13]、劉戈飛等[13-15]實驗團隊通過前期實驗的基礎(chǔ)準(zhǔn)備，完成了NRDR的測序及不同剪接亞型的制備，同時完成了NRDR多克隆抗體的制備及純化，為后期的實驗順利進(jìn)行打下基礎(chǔ)。隨后宋旭紅等[16]通過RT-PCR等方法檢測宮頸癌組織中NRDR、NRDRB1表達(dá)，用RACE法克隆NRDRB1全長cDNA，運用Gateway表達(dá)系統(tǒng)將NRDR、NRDRB1編碼區(qū)序列構(gòu)建到表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中表達(dá)，表達(dá)的融合蛋白通過金屬離子親和層析純化，在大腸桿菌中獲得高效表達(dá)的NRDR、NRDRB1蛋白。而后又以pDONR-NRDR、pDONR-NRDRB1載體為模板，用PCR方法擴增兩端帶有酶切位點的NRDR及NRDRB1編碼區(qū)序列，隨后將其與真核表達(dá)載體(pCDNA3、pCMV-Myc)連接。酶切后測序鑒定,并轉(zhuǎn)染于HeLa細(xì)胞，通過Western blot、蛋白質(zhì)譜分析檢測及鑒定表達(dá)蛋白。籍此成功構(gòu)建NRDR、NRDRB1真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞后可表達(dá)帶有Myc標(biāo)簽的蛋白和不帶標(biāo)簽的Native蛋白；質(zhì)譜分析結(jié)果證實所表達(dá)的蛋白為NRDR和NRDRB1。依次獲得了在原核及真核細(xì)胞中表達(dá)的NRDR、NRDRB1蛋白，為揭示NRDR于人體內(nèi)參與維甲酸代謝的論證提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。然而宋旭紅等[17]隨即發(fā)現(xiàn)：真核構(gòu)建所表達(dá)出的NRDR蛋白活性相對較低的情況又使此研究蒙上新的面紗。考慮到體內(nèi)參與維甲酸代謝酶較多，機制相對復(fù)雜，得到活性稍低的NRDR蛋白卻也可以被接受。張紅麗等[18]通過對與宮頸癌相關(guān)的維甲酸受體β2進(jìn)行研究指出該受體表達(dá)沉默與宮頸癌的發(fā)病相關(guān)，同時該受體的表達(dá)恢復(fù)能增加機體的抗腫瘤能力，從而引發(fā)了以維甲酸相關(guān)基因做靶點的抗癌思路。近日多項針對于民族之間宮頸癌患者NRDR表達(dá)水平差異的研究正在開展，作為整體的一部分，這將對NRDR之于宮頸癌的全面研究提供助力，為研究工作提出了新思路。

4 展望

視黃酸類衍生物在預(yù)防和治療惡性腫瘤上取得了矚目的進(jìn)展。目前視黃酸類衍生藥物Targretin (LGD1069)在醫(yī)學(xué)發(fā)展中已取得明顯效果，尤其在皮膚病和癌癥的治療中。然而在臨床應(yīng)用上，大部分視黃酸類藥物的治療劑量與藥物的中毒劑量很接近，此缺陷對于視黃酸類藥物的進(jìn)一步臨床應(yīng)用有一定的限制[19]，或許相關(guān)研究的進(jìn)一步展開有可能解決此類問題。而NRDR之于宮頸癌，我們有理由相信二者之間的關(guān)聯(lián)并非空穴來風(fēng)。如能確切利用實時熒光定量PCR、反轉(zhuǎn)錄PCR、限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)和Western Blot等技術(shù)檢測NRDR基因在宮頸癌患者和對照人群中的變異和表達(dá)水平等，分析NRDR基因變異與表達(dá)水平的相關(guān)性，相信作為一種早期篩查手段，則會使宮頸病變更早期發(fā)現(xiàn)，更早期治療，實現(xiàn)病變的癌前終結(jié)；作為一種治療手段，將通過單克隆抗體的制備，通過靶向治療減輕宮頸癌患者的痛苦[20]。NRDR相關(guān)研究需更進(jìn)一步，不久的將來如能實現(xiàn)對宮頸癌患者NRDR基因啟動子區(qū)SNP及NRDR基因表達(dá)變化的檢測，同時分析NRDR基因變異與表達(dá)的水平，這將使宮頸癌高危人群的識別、預(yù)防及診斷工作更上一臺階。

[1]周權(quán),黃民主,黃霜,等.中國已婚婦女宮頸癌發(fā)病影響因素meta分析[J].中國癌癥雜志,2011,21(2):125-129.

[2]Breccia M,Stefania de Propris M,Molica M,et al.Introducingbiological features at diagnosis improves the relapse risk stratification in patients with acute promyelocytic leukemia treated with ATRA and chemotherapy[J].Am J Hematol,2015,90(9):E181-E182.

[3]Chai X,Zhai Y,Napoli JL.Cloning of a rate DNA encoding reti.nol dehydrogenase isozyme typeⅢ[J].Gene,1996,169(2):219-222.

[4]Sierra-Torres CH,Arboleda-Moreno YY,Orejuela-Aristizabal L.Exposure to wood smoke,HPV infection,and genetic susceptibility for cervical neoplasia among women in Colombia[J].Environ Mol Mutagen,2006,47(7):553-561.

[5]Yang Q,Wang R.Cellular retinoic acid binding protein 2 is strikingly downregulated in human esophageal squamous cell carcinoma and functions as a tumor suppressor[J].PLoS One,2016,11(2): e0148381.

[6]劉紅,李偉國,張國瑞,等.全反式維甲酸聯(lián)合順鉑對A549細(xì)胞增殖及Bcl-2和P53基因表達(dá)的影響[J].國際呼吸雜志,2015,35(19): 1446-1450.

[7]Castillo V,Pessina P,Hall P,et al.Post-surgical treatment of thyroid carcinoma in dogs with retinoic acid 9 cis improves patient outcome [J].Open Vet J,2016,6(1):6-14.

[8]崔潔潔,龔夢嘉,何昀,等.全反式維甲酸對小鼠肝癌細(xì)胞Hepa1-6增殖、遷移、侵襲的影響及其機制[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床,2016,36 (2):211-217.

[9]Munoz N,Bosch FX,de Sanjose S,et al.Epidemiologic classification of human papil 1omavirus types associated with cervical cancer [J].N Eng J Med,2003,348(6):518-527.

[10]Gasowska-Giszczak U,Darmochwal-Kolarz D,Kwasniewska A,et al.Apoptosis of HeLa cell lines incubated with retinol[J].Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol,2005,119(1):119-122.

[11]Choo CK,Rorke EA,Eckert RL.Retinoid regulation of cell differentiation in a series of human papillomavirus type 16-immortalized human cervical epithelial cell lines[J].Carcinogenesis,1995,16(2): 375-381.

[12]Helm CW,Lorenz DJ,Meyer NJ,et al.Retinoids for preventing the progression of cervical intra-epithelial neoplasia[J].Cochrane Database Syst Rev,2013,6:CD003296.

[13]宋旭紅,梁斌,劉戈飛,等.宮頸鱗癌組織中NRDR選擇性剪接新亞型的鑒定及意義[J].腫瘤,2006,26(12):1088-1092.

[14]Huang DY,Ichikawa Y.Purification and characterization of a novel cytosolic NADP(H)-dependent retinoloxidoreductase from rabbit liver[J].Biochim BiophysActa,1997,1338(1):47-59.

[15]Song XH,Liang B,Liu GF,et al.Expression of a novel alternatively spliced variant of NADP(H)-dependent retinol dehydrogenase/reductase with deletion of exon 3 in cervical squamous carcinoma[J].Int J Cancer,2007,120(8):1618-1626.

[16]宋旭紅,劉戈飛,梁斌,等.宮頸癌細(xì)胞中NRDR選擇性剪接新亞型表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及原核表達(dá)[J].癌變·畸變·突變,2008,20(4): 262-266.

[17]宋旭紅,李蕊,劉戈飛,等.宮頸癌細(xì)胞中輔酶Ⅱ依賴性視黃醇脫氫/還原酶及其選擇性剪接亞型真核表達(dá)載體的構(gòu)建和表達(dá)[J].汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2008,21(2):71-73.

[18]張紅麗,馮定慶,凌斌.維甲酸受體β2在宮頸癌靶向治療中的作用機制[J].實用醫(yī)學(xué)雜志,2014,30(15):2506-2508.

[19]雷田兵,羅模桂,劉官智.阿維A聯(lián)合窄譜中波紫外線治療尋常性銀屑病的療效及其對患者外周血細(xì)胞因子IFN-γ、IL-4及IL-17的影響[J].海南醫(yī)學(xué),2016,27(13):2118-2120.

[20]吳嬌,楊唐斌,柳長柏.腫瘤歸巢肽及其在腫瘤靶向治療中的應(yīng)用[J].海南醫(yī)學(xué),2016,27(1):82-84.

Research and progress of NADP(H)-dependent retinol dehydrogenase/reductase in cervical carcinoma.

DENG Tian-yuan1,2,ZHOU Jin1,ZHANG Yi-feng3.1.Department of Gynaecology and Obstetrics,Xinjiang Military General Hospital,Urumqi 830000,Xinjiang,CHINA;2.Shihezi University School of Medicine,Shihezi 832000,Xinjiang,CHINA; 3.Department of Gynaecology and Obstetrics,Maternal and Child Health Care Hospital of Xinyu,Xinyu 338000,Jiangxi, CHINA

Retinoic acid(RA)is an active derivative of vitamin A,which plays an important role in embryonic development,cell growth and differentiation through regulating the target gene expression.Current studies have found that the RA related substances are closely related to the differentiation,proliferation and apoptosis of tumor cells.As a kind of retinoic acid metabolism enzyme,NADP(H)-dependent retinol dehydrogenase/reductase(NRDR)was proved that its abnormal splicing and protease activity changes are closely related to the occurrence and development of cervical squamous cell carcinoma.In this review,we will discuss the research status and future prospects of NRDR.

Retinoic acid(RA);NADP(H)-dependent retinol dehydrogenase/reductase;Cervical carcinoma

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.15.028

R737.33

A

1003—6350（2017）15—2502—03

2016-11-29)

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金(編號：2015211C245)

周瑾。E-mail：zhoujin92629@163.com