水樣糞便中糞類(lèi)圓線蟲(chóng)幼蟲(chóng)的收集方法

范志剛，覃西，吳軍，黃聰聰，何蟬伊，符瑞祥，周利民，李斯

(1.海南醫(yī)學(xué)院熱帶醫(yī)學(xué)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室，海南 ?？?571199;2.海南醫(yī)學(xué)院熱帶病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，熱帶病轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(籌備教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)，海南 ?？?571199；3.海南省腫瘤醫(yī)院檢驗(yàn)科，海南 ?？?570100；4.海南省腫瘤醫(yī)院胸外科，海南 ?？?570100；5.海南醫(yī)學(xué)院科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，海南 ?？?571199；6.海南職業(yè)技術(shù)學(xué)院心理學(xué)教研室，海南 海口 570216)

·經(jīng)驗(yàn)交流·

水樣糞便中糞類(lèi)圓線蟲(chóng)幼蟲(chóng)的收集方法

范志剛1,2，覃西3，吳軍4，黃聰聰4，何蟬伊1，符瑞祥1，周利民5，李斯6

(1.海南醫(yī)學(xué)院熱帶醫(yī)學(xué)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室，海南 ?？?571199;2.海南醫(yī)學(xué)院熱帶病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，熱帶病轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(籌備教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)，海南 ?？?571199；3.海南省腫瘤醫(yī)院檢驗(yàn)科，海南 海口 570100；4.海南省腫瘤醫(yī)院胸外科，海南 ?？?570100；5.海南醫(yī)學(xué)院科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，海南 ?？?571199；6.海南職業(yè)技術(shù)學(xué)院心理學(xué)教研室，海南 ?？?570216)

糞類(lèi)圓線蟲(chóng)；幼蟲(chóng)；收集

糞類(lèi)圓線蟲(chóng)(Strongyloides stercoralis)是一種兼性寄生蟲(chóng)，可以引起人獸共患寄生蟲(chóng)病，并可在宿主體內(nèi)自體感染、播散性超度感染[1-2]。該蟲(chóng)引起的人類(lèi)疾病易被忽略而誤診、漏診。一旦患者免疫力下降或受損，該蟲(chóng)大量增殖，可導(dǎo)致患者全身播散性感染，全身各器官衰竭，甚至死亡[1-2]。2017年2月13日在海南省腫瘤醫(yī)院一名67歲男性患者水樣糞便中發(fā)現(xiàn)糞類(lèi)圓線蟲(chóng)幼蟲(chóng)。為開(kāi)展后續(xù)DNA和RNA的提取等研究，需要從患者水樣糞便中分離其幼蟲(chóng)。蠕蟲(chóng)幼蟲(chóng)收集常用方法有貝爾曼氏法、平皿法、Koga法等方法，其中貝爾曼氏法和Koga法適用于糞類(lèi)圓線蟲(chóng)幼蟲(chóng)收集[3-4]。這幾種方法主要用于從成形糞便中收集幼蟲(chóng)的病原學(xué)檢測(cè)，不適合用于從水樣糞便中收集糞類(lèi)圓線蟲(chóng)幼蟲(chóng)，其次它們的收集物中有雜質(zhì)，不利于開(kāi)展后續(xù)糞類(lèi)圓線蟲(chóng)幼蟲(chóng)DNA和RNA的提取等研究。因此，為從患者水樣糞便中收集無(wú)雜質(zhì)的糞類(lèi)圓線蟲(chóng)幼蟲(chóng)，探索采用綜合方法收集。

1 資料與方法

1.1 對(duì)象及糞便收集 海南省腫瘤醫(yī)院67歲男性患者水樣糞便。家屬將3個(gè)塑料袋分層套在便盆上，患者大便入塑料袋中。

1.2 幼蟲(chóng)收集 采用離掏濾法(簡(jiǎn)稱CWF法)，即離心沉淀法、改良淘洗法和改良鉤蚴培養(yǎng)法這三種方法聯(lián)合收集幼蟲(chóng)。將收集的大便分次轉(zhuǎn)入15 mL離心管中，2 000 r/min離心10 min，收集沉淀，標(biāo)記為“樣本1”。采用生理鹽水或雙蒸水混勻沉淀，2 000 r/min離心10 min，重復(fù)此步驟到混合液澄清為止，2000 r/min離心10 min，收集沉淀，標(biāo)記為“樣本2”，待用。將濾紙剪成寬度與500 mL燒杯等寬的T型或者長(zhǎng)方形。用少許生理鹽水或雙蒸水混勻待用沉淀，滴加在濾紙中部，放入500 mL燒杯中，濾紙上端采用固定方法固定在燒杯口上方。用生理鹽水或雙蒸水沿?zé)诩尤?，至濾紙底部0.5～1 cm，不接觸沉淀混合物為宜。室溫放置。每隔1～2 h觀察液面。根據(jù)觀察情況，收集燒杯中的液體于15 mL離心管中，2 000 r/min離心10 min，收集沉淀。采用雙蒸水混勻沉淀，2 000 r/min離心10 min，重復(fù)此步驟2～3次，保存沉淀，標(biāo)記為“樣本3”，待用。

1.3 幼蟲(chóng)檢查 根據(jù)沉淀多少，分別用1～5 mL生理鹽水稀釋取樣本1、樣本2和樣本3，混勻后，取一滴采用直接涂片法，在光學(xué)顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

樣本1糞樣直接離心后收集的幼蟲(chóng)中有很多雜質(zhì)，樣本2離心+淘洗后收集的幼蟲(chóng)中也有雜質(zhì)，樣本3離心+淘洗+濾紙分離后收集的幼蟲(chóng)中無(wú)雜質(zhì)。

3 討論

糞類(lèi)圓線蟲(chóng)可怕之處是其具有機(jī)會(huì)致病性，并可自體感染和播散性超度感染?；颊呙庖吡φr(shí)，該蟲(chóng)引起的臨床癥狀輕，易被忽略而導(dǎo)致誤診、漏診。一旦患者免疫力下降或受損，該蟲(chóng)大量增殖，可導(dǎo)致患者全身播散性感染，造成全身各器官衰竭，甚至死亡。更可怕的是基層醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)生和臨床醫(yī)生對(duì)其知之甚少以及醫(yī)院所用病原學(xué)檢驗(yàn)方法檢出率有限。目前，我們幫忙鑒定蟲(chóng)，大多數(shù)是因?yàn)榛颊吒腥鞠x(chóng)數(shù)多而被檢驗(yàn)醫(yī)師發(fā)現(xiàn)。就第一次全國(guó)人體寄生蟲(chóng)分布調(diào)查報(bào)告顯示海南省居民糞類(lèi)圓線蟲(chóng)感染率居全國(guó)之首，感染率為1.091%[1]，2007年至今，海南醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院和海南省腫瘤醫(yī)院確診的糞類(lèi)圓線蟲(chóng)病例主要由我們鑒定蟲(chóng)種確定的。因此，臨床檢驗(yàn)需要有新的簡(jiǎn)易的檢出率高的檢查糞類(lèi)圓線蟲(chóng)的方法。為此，課題組2017年2月13日和14日收集了海南省腫瘤醫(yī)院一名67歲男性患者水樣糞便，欲從中分離糞類(lèi)圓線蟲(chóng)幼蟲(chóng)開(kāi)展后續(xù)研究，為研發(fā)新的檢測(cè)方法研究奠定基礎(chǔ)。

經(jīng)過(guò)分析，課題組改良了淘洗法和鉤蚴培養(yǎng)法。改良的淘洗法沒(méi)有用篩網(wǎng)，改良的鉤蚴培養(yǎng)法將試管改為燒杯。從水樣糞便中分離糞類(lèi)圓線蟲(chóng)幼蟲(chóng)采用了離掏濾法，即結(jié)合了離心沉淀法、改良淘洗法和改良鉤蚴培養(yǎng)法這三種方法于一體。離掏濾法不僅區(qū)別于蠕蟲(chóng)幼蟲(chóng)收集常用方法貝爾曼氏法、平皿法和Koga法方法，也區(qū)別于離心沉淀法、淘洗法和鉤蚴培養(yǎng)法。貝爾曼氏法、平皿法和Koga法方法這三種方法主要適用于成形糞便中收集幼蟲(chóng)，而不適合用于從水樣糞便中收集幼蟲(chóng)，并且這三種方法收集物中有雜質(zhì)，不利于開(kāi)展后續(xù)DNA和RNA的提取等研究。離心沉淀法和淘洗法同樣無(wú)法去除雜質(zhì)，不利于開(kāi)展后續(xù)DNA和RNA的提取等研究。試管鉤蚴培養(yǎng)法主要用于幼蟲(chóng)的病原學(xué)檢查，不適用于從大量水樣糞便中收集幼蟲(chóng)，這需要大量的試管。將離心沉淀法、改良淘洗法、改良鉤蚴培養(yǎng)法進(jìn)行有機(jī)組合，可以獲得沒(méi)有雜質(zhì)的糞類(lèi)圓線蟲(chóng)，優(yōu)于以上各種方法，并可以用于貝爾曼氏法、平皿法和Koga法方法這三種方法去除雜質(zhì)的后續(xù)工作，方便后續(xù)DNA和RNA的提取等研究。

[1]吳觀陵,溫廷桓,胡孝素,等.人體寄生蟲(chóng)學(xué)[M].4版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2013:571-573.

[2]諸欣平,蘇川.人體寄生蟲(chóng)學(xué)[M].8版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2015:168-171.

[3]杜尊偉,姜進(jìn)勇,Peter Steinmann,等.不同檢測(cè)方法對(duì)糞類(lèi)圓線蟲(chóng)鉤蟲(chóng)檢出率的比較[J].中國(guó)血吸蟲(chóng)病防治雜志,2009,21(1):64-66.

[4]姜進(jìn)勇,杜尊偉,王學(xué)忠,等.云南省勐?？h居民糞類(lèi)圓線蟲(chóng)感染調(diào)查[J].中國(guó)病原生物學(xué)雜志,2008,3(3):242,202.

R532.1

B

1003—6350（2017）22—3764—02

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.22.051

國(guó)家大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：201511810012)；海南省自然基金項(xiàng)目(編號(hào)：20158368)；海南醫(yī)學(xué)院培育基金(編號(hào)：HY2015-14、HY2016-12)；海南醫(yī)學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：HYXC2014019)；?？谑袘?yīng)用技術(shù)研究與發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：2014-60)

李斯。E-mail：lisibei52@163.com

2017-03-02)