結(jié)核病分子診斷研究進(jìn)展

梅珍珍

(咸寧市結(jié)核病院，湖北 咸寧 437000)

結(jié)核病分子診斷研究進(jìn)展

梅珍珍

(咸寧市結(jié)核病院，湖北 咸寧 437000)

結(jié)核?。环肿釉\斷技術(shù)；進(jìn)展

結(jié)核病是威脅人類健康的主要傳染性疾病之一，自上世紀(jì)50年代抗生素療法問世后，其發(fā)病率和死亡率已顯著降低，然而，最近20多年來，結(jié)核病疫情大有卷土重來之勢，全球的流行形勢十分嚴(yán)峻[1]。及時發(fā)現(xiàn)、治療和隔離患者是控制結(jié)核病的有效手段，而結(jié)核病診斷是發(fā)現(xiàn)和治療患者的前提。近些年，分子診斷技術(shù)發(fā)展十分迅速，為結(jié)核病和耐藥結(jié)核的快速診斷提供了重要手段?，F(xiàn)將目前結(jié)核病分子診斷進(jìn)展介紹如下：

1 Xpert Mtb/RIF技術(shù)

Xpert Mtb/RIF是一項發(fā)展十分迅速的結(jié)核病及耐藥結(jié)核病的全自動快速分子診斷方法，該技術(shù)具有操作簡便，檢測快，結(jié)果準(zhǔn)等優(yōu)點，手工操作部分僅需5min，而全過程只需90min即可完成Mtb特異核酸檢測和利福平耐藥基因rpoB突變的檢測。因此，該技術(shù)迅速得到認(rèn)可及推廣使用。2010年12月，WHO批準(zhǔn)了Xpert Mtb/RIF技術(shù)的應(yīng)用。2013年7月，Xpert Mtb/RIF技術(shù)通過了美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)的認(rèn)證。Xpert Mtb/RIF可在2h內(nèi)得到檢測結(jié)果、敏感度高、潛力巨大，目前已在結(jié)核病患病率較高的67個國家推廣實施[2]。

Xpert Mtb/RIF技術(shù)診斷結(jié)核病具有檢測限低，靈敏度和特異度高的優(yōu)點。Van等[3]在研究中發(fā)現(xiàn)Xpert MTB/RIF檢測法的檢測低限可低至痰液中100個細(xì)菌/mL。Chang等[4]的meta分析顯示，Xpert Mtb/RIF法診斷肺結(jié)核總敏感度為90.4%，特異度為98.4%，而在肺外結(jié)核診斷中合并敏感度和特異度分別為80.4%和86.1%。新加坡Teo等[5]對162份標(biāo)本的診斷比較研究結(jié)果表明，與Mtb直接試驗(MTD)檢測(靈敏度97.3%、特異度87.1%)相比，運用Xpert Mtb/RIF技術(shù)(靈敏度90.9%、特異度89.0%)也可以準(zhǔn)確診斷。同時，Xpert MTB/RIF技術(shù)也可用于兒童結(jié)核病診斷，并具有其他方法不具備的優(yōu)越性，與直接痰涂片鏡檢相比，具有較高的敏感度[6-8]。

Xpert Mtb/RIF技術(shù)操作簡單，檢測時間短，有利于患者的早期快速診斷及耐利福平結(jié)核的治療。Theron 等[9]在南非進(jìn)行的大規(guī)模多中心隨機對照臨床實驗研究結(jié)果顯示，與痰涂片鏡檢相比，Xpert Mtb/RIF檢測具有較高的就診當(dāng)天診斷率(24.0%和13.0%，P<0.0001)和就診當(dāng)天治療率(23.0%和15.0%，P=0.0002)。Boehme等[10]研究顯示，Xpert Mtb/RIF技術(shù)檢測結(jié)核和耐藥結(jié)核的中位時間分別是0 d和20 d，而菌陰結(jié)核治療的中位時間則由56 d減少至5 d。Davis等[11]進(jìn)行了一項隨訪2個月的前瞻性橫斷面研究，結(jié)果顯示Xpert Mtb/RIF在不減少早期檢出率的同時，能夠降低94.0%的過度治療，平均每個患者減少44 d的過度治療，而在隔離治療評估中，Xpert Mtb/RIF可將總隔離天數(shù)從495 d減少至30 d。

2 分子線性探針測定法

分子線性探針測定法診斷Mtb耐藥基因檢測已得到了WHO的認(rèn)可與推薦。目前該方法主要分為3種：Genotype MDRTBsl檢測法、Genotype MDRTBplus檢測法和REBA MTB-Rifa線性探針測定法。

2.1 Genotype MDRTBsl檢測法 目前Genotype MDRTBsl試驗已應(yīng)用于XDR-TB的診斷，主要用于檢測氟喹諾酮類藥物(FQs)、乙胺丁醇(EMB)和其他二線藥物的耐藥基因突變。Lacoma等[12]采用Genotype MDRTBsl和BACTECTM460 TB法檢測臨床分離株和臨床標(biāo)本的FQs、卡那霉素(Km)-卷曲霉素(Cm)和EMB藥敏的總體符合率，Genotype MDRTBsl檢測臨床分離株的總體符合率分別為72.4%、88.9%、67.6%，而檢測臨床樣本的符合率則分別為86.5%、92.3%、56.0%。Huang等[13]采用Genotype MDRTBsl檢測法和DNA測序法對234例耐多藥菌株檢測耐藥基因，并與傳統(tǒng)的藥物敏感度試驗(DST)相比，Genotype MDRTBsl檢測法測定耐藥基因的敏感度(FQs為85.1%、阿米卡星為84.2%、Cm為71.4%、Km為43.2%)差別較大，而兩種方法檢測上述耐藥基因的特異度均很高(95.8%～100.0%)。

2.2 Genotype MDRTBplus檢測法 Genotype MDRTBplus檢測法可用于結(jié)核病和耐利福平、異煙肼結(jié)核的診斷。Friedrich等[14]研究顯示Genotype MDRTBplus檢測法檢測臨床標(biāo)本中分枝桿菌或其DNA的靈敏度可達(dá)96.8%；而RFP耐藥檢測結(jié)果與Xpert Mtb/RIF檢測法和液體培養(yǎng)法的檢測結(jié)果完全一致，INH耐藥檢測的靈敏度和特異度則分別是83.3%和100.0%。Maurya等[15]使用Genotype MTBDRplus檢測法檢測125株可檢測到120株(96%)Mtb，檢測RFP、INH和耐多藥結(jié)核的敏感度分別為95.8%、96.3%、97.7%。Jin等[16]使用GenoType MTBDRplus、DNA測序和藥敏試驗檢測237株MDR-Mtb菌株的RFP和INH耐藥情況，結(jié)果顯示GenoType MTBDRplus檢測法對兩者的敏感度分別為93.5%和75.0%，而特異度均為100.0%，但同時發(fā)現(xiàn)，該檢測法不能檢出諸如katG S315N等少見的INH耐藥基因突變，因此仍需加以改進(jìn)以提高對INH耐藥檢測的靈敏度。

2.3 REBA MTB-Rifa線性探針測定法 REBA MTB-Rifa線性探針測定法可用于檢測RIF耐藥基因rpoB。Cho等[17]采用REBA MTB-Rifa線性探針測定法和傳統(tǒng)表型DST兩種方法對492株Mtb臨床分離株進(jìn)行RFP耐藥檢測，結(jié)果顯示有215株RFP耐藥，REBA MTB-Rifa線性探針測定法對RFP耐藥檢測的靈敏度為98.1%、特異度為100.0%；同時還檢測了228份涂片陽性的標(biāo)本，該方法的靈敏度和特異度均為100.0%。

3 基因芯片技術(shù)

基因芯片技術(shù)具有簡便、快速、靈敏度高、特異度高等優(yōu)點。周楊等[18]用基因芯片法和絕對濃度法檢測臨床分離株的耐藥情況，其中基因芯片法針對Mtb的rpoB、katG、inhA三個基因的多個位點進(jìn)行檢測，以絕對濃度法的藥敏結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，基因芯片法檢測RFP耐藥的符合率為93.7%、靈敏度為92.0%、特異度為97.2%，檢測INH耐藥的符合率為83.8%、靈敏度為77.4%、特異度為96.9%，而檢測耐多藥的符合率為82.4%、靈敏度為74.6%、特異度為98.0%。Kurbatova等[19]對俄羅斯2個耐藥結(jié)核病流行地區(qū)的238份標(biāo)本使用Xpert Mtb/RIF法和TB-biochip生物芯片法同時進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)兩者對MTBC的RFP耐藥檢測效果相似。

4 多重PCR檢測技術(shù)

多重PCR檢測技術(shù)采用多個特異性引物對多個不同基因靶點進(jìn)行擴增，不僅具有PCR技術(shù)簡便、快速的特點外，還可以減少假陰性結(jié)果。Sharma等[20]研究發(fā)現(xiàn)，以IS 6110作為引物的單PCR和以IS 6110、devR作為引物的多重PCR在結(jié)核病患者中的陽性率分別為84.5%和97.5%，而在臨床疑似患者中的陽性率分別為40.0%和45.0%，兩者的特異度均為96.5%，說明在多重PCR可在不降低特異度的同時，提高靈敏度。Chia等[21]針對INH和RFP的5個耐藥基因突變位點進(jìn)行多重等位基因PCR(MAS-PCR)，以藥敏試驗結(jié)果為參照，MAS-PCR可以較為準(zhǔn)確的檢測INH(靈敏度82.8%、特異度100.0%)和RFP(靈敏度98.4%、特異度100.0%)耐藥性突變。Vadwai等[22]以katG315、rpoB531、gyrA94和rrs1401等4個位點為目標(biāo)進(jìn)行多重等位基因特異性PCR，檢測Mtb對INH、RFP、FQs和氨基糖苷類藥物的敏感性，該方法對培養(yǎng)陽性患者、涂陽患者、涂陰患者和培養(yǎng)陰性患者的檢測準(zhǔn)確率分別為97.2%、100.0%、55.5%、93.6%。

5 焦磷酸測序法

焦磷酸測序技術(shù)實際上是一種適用于對已知短序列的實時DNA測序分析技術(shù)，其重復(fù)性、精確性高，具有操作簡單、檢測速度快等優(yōu)點。Lin等[23]通過測定ropB、inhA、katG、ahpC、gyrA、rrs突變的方法檢測相應(yīng)基因的突變，結(jié)果顯示焦磷酸測序法的基因型耐藥檢測結(jié)果與表型耐藥的一致性分別為INH(94.3%)、RFP(98.7%)、FQs(97.6%)、Am(99.2%)，Cm(99.2%)、Km(96.4%)；對臨床菌株結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群檢測的靈敏度為98.4%，耐藥檢測的靈敏度為95.8%。Engstr?m等[24]用焦磷酸測序法和藥敏試驗法對Mtb臨床分離株進(jìn)行檢測，與藥敏試驗結(jié)果相比，焦磷酸測序法檢測MDR菌株的靈敏度和特異度分別為94.6%和100.0%，檢測XDR菌株的靈敏度和特異度則分別為86.9%和99.3%。Zheng等[25]的研究發(fā)現(xiàn)，與藥敏試驗結(jié)果相比，焦磷酸測序法檢測臨床分離株的藥物耐藥基因的準(zhǔn)確度分別為INH(79.2%)、RFP(95.0%)、氧氟沙星(91.1%)、Am(96.5%)、乙胺丁醇(70.3%)、鏈霉素(96.5%)；檢測痰標(biāo)本的準(zhǔn)確度分別為INH(83.3%)、RFP(83.3%)、氧氟沙星(91.7%)、Am(87.5%)、乙胺丁醇(60.9%)、鏈霉素(83.3%)。

6 恒溫擴增檢測技術(shù)

恒溫擴增檢測技術(shù)主要包括環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增法和RNA恒溫擴增實時檢測等2種方法。

6.1 環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增法 環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增法(loop mediated isothermal amplification,LAMP)可在等溫條件下直接擴增臨床標(biāo)本中MtbDNA，用肉眼就可以觀察結(jié)果，是2013年WHO重點推薦的一種商業(yè)化的應(yīng)用于Mtb DNA擴增的診斷新方法；該法在菌陽標(biāo)本和涂陰培陽標(biāo)本中的靈敏度分別達(dá)到97.0%～98.2%和53.0%～62.0%，特異度為93.9%～96.3%[26]。有研究報道，IS6110-LAMP與Amplicor Mtb PCR測試、in-house IS6110-PCR和巢式PCR相比，對Mtb的靈敏度分別達(dá)到89.6%、76.6%、79.2%、59.7%，陰性預(yù)測值分別為75.0%、57.1%、60.0%、43.6%；IS6110-LAMP特異度和陽性預(yù)測值均為100.0%[27]。

6.2 RNA恒溫擴增實時檢測 RNA恒溫擴增實時檢測(simultaneous amplification and testing,SAT)法既有操作簡便，反應(yīng)速度快，污染率低的特點，同時還具有靈敏度和特異度高的優(yōu)點，是一項很有市場前景的Mtb診斷新技術(shù)[28-29]。沙巍等[30]使用SAT、Mtb培養(yǎng)法和熒光PCR檢測172例疑似肺結(jié)核患者痰液標(biāo)本，以后兩者的檢測結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較，SAT檢測的靈敏度為97.8%(89/91)，特異度為97.5%；而以臨床診斷為標(biāo)準(zhǔn)則SAT診斷的靈敏度和特異度分別為58.3%、100.0%，對菌陽患者和菌陰患者SAT檢測的陽性率分別為84.9%，19.0%。

7 高分辨率熔解曲線分析

高分辨率熔解曲線分析法檢測耐藥基因突變，目前已在INH、RFP、Sm、FQ藥物和PZA中得到驗證。Pholwat等[31]采用高分辨率熔解曲線分析法對98株臨床分離株的pncA基因進(jìn)行分析，結(jié)果與MGIT960藥敏結(jié)果進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，測序結(jié)果和高分辨率熔解曲線分析法檢測的一致率為94.0%，測序結(jié)果和HRM檢測與吡嗪酰胺藥敏結(jié)果的一致率分別為84.0%和82.0%。Lee等[32]對92例Mtb臨床分離株的gyrA，rpsL和rrs基因進(jìn)行高分辨率熔解曲線分析法檢測，以DNA測序結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，同DST相比，高分辨率熔解曲線分析法檢測FQs耐藥的靈敏度和特異度分別為74.1%和100.0%，檢測鏈霉素耐藥的靈敏度和特異度分別為87.5%和100.0%。此外，高分辨率熔解曲線分析法分析還可用于分枝桿菌的分類研究[33]。

8 質(zhì)譜技術(shù)

質(zhì)譜技術(shù)主要是通過形成質(zhì)譜圖，然后檢測標(biāo)本得到的質(zhì)譜圖與已知的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行匹配后，匹配率最高的為鑒定結(jié)果，具有高敏感度、高通量和快速的特點。Zhang 等[34]綜述了MALDI-TOFMS質(zhì)譜技術(shù)在菌種鑒定中的應(yīng)用。另外，該技術(shù)還可對結(jié)核病患者的血清蛋白進(jìn)行分析，用于結(jié)核病的診斷。王琳等[35]對180例菌陰肺結(jié)核患者進(jìn)行血清蛋白質(zhì)組學(xué)研究，選取5個蛋白峰(1028.49,4796.56，7564.77,8048.02，11526.75)組成診斷模型，在與肺炎鑒別診斷中的總體有效率為84.2%，靈敏度為82.5%，特異度為85.9%，陽性預(yù)測值86.7%，陰性預(yù)測值為81.7%，而在鑒別肺炎、菌陰肺結(jié)核與健康者之間，總有效率則達(dá)89.4%，敏感度為84.2%，特異度為100.0%。Liu等[36]對391份血清樣本(活動性肺結(jié)核180份；對照組211份，其中健康志愿者91份，肺癌患者40份，肺炎患者40份，COPD患者40份)采用SELDI-TOF質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)有35個與結(jié)核病相關(guān)的差異表達(dá)蛋白質(zhì)中，有4種蛋白峰(2554.6、4824.4、5325.7和8606.8)可以將結(jié)核病與對照組區(qū)分開，其敏感度為83.8%，特異度為84.2%。

9 其他分子診斷技術(shù)

實時定量PCR技術(shù)是可用于診斷結(jié)核，Darban-Sarokhalil等[37]采用實時定量PCR技術(shù)、直接痰檢和培養(yǎng)三種方法對呼吸道標(biāo)本進(jìn)行檢測，與兩者的診斷結(jié)果相比較，實時定量PCR總的敏感度為90.2%、特異度為97.8%、陽性預(yù)測值為97.1%和陰性預(yù)測值為92.3%。寡核苷酸微矩陣法可檢測出氟喹諾酮的耐藥突變基因gyrA和gyrB，以及與阿米卡星和卷曲霉素耐藥相關(guān)的rrs基因和啟動子的eis基因，Zimenkov等[38]使用該法檢測65株對氧氟沙星、左氧氟沙星、莫西沙星、卡那霉素和卷曲霉素具有耐藥性的臨床分離株，結(jié)果顯示檢測耐氟喹諾酮的敏感度和特異度分別為98.0%和100.0%，卡那霉素為97.0%和94.0%，卷曲霉素為100.0%和94.0%。

目前納米金探針已被廣泛地用于病原體的核酸檢測和區(qū)分，包括Mtb。Hussain等[39]開發(fā)了一種特異性檢測MtbC的快速納米金粒子(14 nm)，對Mtb的16SrDNA區(qū)域進(jìn)行PCR擴增，并對未擴增的DNA基因使用納米金檢測。結(jié)果顯示檢測的45例DNA基因陽性樣本與自動化液體培養(yǎng)系統(tǒng)(Bactec MGIT)和半巢PCR的結(jié)果完全符合(一致率100.0%)，檢測用時1h。

速度-寡結(jié)核分枝桿菌直接測定法可直接檢測標(biāo)本中的MtbC,并可鑒別MtbC和NTM，有研究者采用速度-寡結(jié)核分枝桿菌直接測定法對566份樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示SO-DMT的靈敏度為76.0%，特異度為99.0%，陽性預(yù)測值85.0%，陰性預(yù)測值97.0%[40]。

基因探針擴增直接試驗是一種直接在標(biāo)本中檢測Mtb的技術(shù)，具有靈敏度高等優(yōu)點。Papaventsis等[41]使用基因探針擴增直接試驗檢測兒童結(jié)核病標(biāo)本，其靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值分別為100.0%、85.0%、50.0%、100.0%。

另外，目前還有諸如變性高效液相色譜分析、PCR限制性酶切分析以及直接測序法等分子診斷技術(shù)被大量研究開發(fā)和證實。

10 小 結(jié)

結(jié)核病分子診斷技術(shù)通常具有操作簡單、反應(yīng)快速、靈敏度高、特異度高等優(yōu)點，但同時也存在著成本高，實驗環(huán)境要求嚴(yán)格，不便于基層推廣等現(xiàn)實性問題，且分子診斷結(jié)果通常只能做輔助診斷。因此，目前仍期待一款新的實用的低成本、反應(yīng)條件要求低的結(jié)核病分子診斷技術(shù)。

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