囊泡膜核苷酸轉運體在核苷酸囊泡轉運機制的研究進展

陳立強，王洋洋，司艷輝，梁潔玲，李海珠

(肇慶市第一人民醫(yī)院，廣東 肇慶 526060)

核苷酸在細胞內的運輸不能自由穿過細胞膜，其儲存與運輸必須以囊泡運輸?shù)姆绞竭M行跨膜轉運，當囊泡與胞膜融合時將核苷酸等內容物質釋放到細胞外[1]。要探討細胞外核苷酸/核苷激發(fā)的信號通路，就必須要理解三磷酸腺苷(ATP)和其他核酸是如何從細胞內釋放出來的，而這也是生理學上的一個重要問題[2]；自從囊泡膜核苷酸轉運體(vesicular nucleotide transporter，VNUT)被發(fā)現(xiàn)，其就作為ATP轉運的關鍵因子而被廣泛關注[3]；現(xiàn)將VNUT在核苷酸囊泡轉運機制的研究最新進展進行綜述。

1 VNUT

神經內分泌信號的傳達需要大量不同種類的囊泡儲存信號分子參與和調節(jié)。這些非肽類復合物的儲存和轉運都必須通過特定的囊泡轉運蛋白進行運輸，所有這些轉運蛋白都屬于溶質載體蛋白家族(solute carrier family，SLC)[4]。研究表明囊泡轉運體內包含多種神經遞質而每種神經遞質都需要特定的囊泡轉運體進行轉運，而且囊泡里面還包含ATP和大量不同種類的核苷酸，囊泡內各種生物成分的相互作用，共同完成信號的激發(fā)和傳播。囊泡一旦釋放，囊泡內儲存的ATP和核苷酸分子會與囊泡分泌細胞或者相鄰細胞表面的特定P2X離子通道性受體或者P2Y代謝型受體相結合并產生生物學效應[5]。

VNUT屬于solute carrier family 17 member 9(SLC17A9)，其定位于不同的ATP貯存器的囊泡膜上(如嗜鉻顆粒和突觸囊泡等)。VNUT通過由液泡膜質子泵產生囊泡膜電位差，形成的作用力從而主動運輸ATP。VNUT特點是包括：(1)VNUT在轉運囊泡中大量存在；(2)VNUT的抑制劑可使ATP的轉運受到嚴重影響；(3)利用小干擾RNA對VNUT進行基因敲除可減少細胞ATP的分泌[6]；VNUT是由430個氨基酸殘基組成的蛋白質分子，該蛋白分子有12個跨膜區(qū)間并且蛋白N和C末端都定位在細胞內。對VNUT進行熒光標識定位發(fā)現(xiàn)其與突觸結合蛋白之間均存在于囊泡膜的相同位置，顯示兩種蛋白在囊泡轉運中可能相互連接并共同完成囊泡轉運和釋放過程。通過小干擾RNA技術對VNUT蛋白進行敲除，可明顯減少KCl誘導的ATP的分泌反應[7]。運用分子檢測技術對VNUT蛋白的深入研究，發(fā)現(xiàn)VNUT在胃、腸道、肝臟、肺部、骨骼肌、甲狀腺、脾、血細胞、上皮細胞和角化細胞中均有表達，顯示VNUT調節(jié)活性分子進入分泌囊泡的生物反應不僅僅存在于腦組織和神經內分泌組織中，故VNUT在許多細胞和組織包裝ATP進入分泌囊泡和釋放過程中發(fā)揮著關鍵作用[8]。

2 核苷酸轉運機制

人類基因組至少有19種含有嘌呤受體的核苷酸/核苷激活細胞存在，一旦嘌呤受體激活，可激活受體下游信號通路而引起一系列機體的生理反應。嘌呤受體包括三個亞型，分別是(1)ATP門控離子通道P2X受體；(2)G蛋白偶聯(lián)P2Y受體，該受體可與ATP、ADP、UTP、UDP和糖化UDP相結合；(3)G蛋白偶聯(lián)腺苷酸受體；該類受體在ATP的催化、轉換和合成ADP、UDP和腺苷酸的過程中發(fā)揮著關鍵作用[9]。ATP、神經遞質和其他活性分子在神經內分泌組織和細胞中是以囊泡形式進行儲存和釋放的，包囊物質通過電化學電位梯度(Δψ)和囊泡膜鑲嵌的V-type H+-ATPase (V/H+-ATPase) 提供pH梯度產生的作用力進行轉運。例如交感節(jié)前神經元嗜鉻細胞在依賴鈣離子的情況下利用梯度作用力將囊泡轉運至胞膜，當細胞接收到釋放信號，囊泡會與胞膜融合而釋放囊泡內的信號物質到細胞外[10]。另外，研究顯示ATP的囊泡釋放過程存在于許多細胞，例如胰腺腺泡細胞、杯狀細胞、肥大細胞、胰腺β細胞和其他外分泌或內分泌組織。囊泡的分泌過程需要有可溶性N-乙基馬來酰亞胺敏感因子附著蛋白受體(soluble N-ethyl maleimidesensitive factor attachment protein receptor，SNARE)受體蛋白家族共同完成的，v-SNARE和t-SNARE受體家族會相互協(xié)調共同完成囊泡的轉運、定位連接和融合[11]。SNARE的主要組成包括t-SNAREs突觸融合蛋白、SNAP-25和v-SNARE突觸囊泡蛋白(v-SNARE synaptobrevin，VAMP)。突觸融合復合物的初始形成由突觸融合蛋白、SNAP-25和突觸囊泡蛋白；此外還需要其他蛋白的共同參與，包括Rabs和Muncs等蛋白，這些蛋白復合體共同形成SNARE的構成[12]。在神經遞質釋放的后期，突觸融合蛋白/SNAP 25復合體會與突觸囊泡蛋白結合，在依賴Ca2+的情況下，激發(fā)突觸囊泡蛋白向細胞膜轉移且與胞膜融合，囊泡膜融合并釋放神經遞質[13]。轉運蛋白轉移胞質的ATP進入分泌囊泡和通過囊泡和胞質的融合將囊泡內容物分泌到細胞外。

3 VNUT參與核苷酸囊泡轉運

組織和細胞在ATP的分泌過程中VNUT充當著重要角色存在，例如T細胞受體(T cell receptors，TCR)被激活可導致淋巴細胞快速并大量分泌ATP，ATP的大量釋放可激活P2X受體誘導的生理反應，如細胞增殖等[14]。通過利用巴佛洛霉素A1對囊泡轉運和釋放進行抑制，可發(fā)現(xiàn)TCR在依賴Ca2+的情況下誘導T淋巴細胞分泌ATP的機制受到嚴重影響；另外對VNUT基因進行敲除，可發(fā)現(xiàn)TCR誘導T淋巴細胞分泌ATP會明顯下降。大量研究表明，VNUT在不同組織中對ATP轉運和分泌均起到關鍵作用，例如在星形膠質細胞、肝細胞、肺泡上皮細胞A549和腸系膜上皮細胞、成骨細胞和食管角質形成細胞等都有相關研究報道[15]；通過利用這些ATP存量豐富的細胞系的試驗，更能體現(xiàn)ATP的儲存和釋放過程VNUT扮演的角色和價值。

在許多細胞中，ATP不通過囊泡運輸進行釋放，而且巴佛洛霉素A1對這類細胞ATP釋放的抑制作用不明顯；而利用阻礙囊泡轉運和融合的囊泡抑制劑對細胞進行作用，發(fā)現(xiàn)該類抑制劑對細胞ATP的釋放亦不產生影響[16]。多藥耐藥基因(multidrug resistance，MDR-1)蛋白，Cl-跨膜電導調節(jié)器(CF transmembrane conductance regulator，CFTR)，線粒體電壓依賴性陰離子通道-1( mitochondrial voltage-dep -endent anion channel-1，VDAC -1)被認為是激發(fā)ATP釋放的通路或者促進了ATP的釋放，對這類蛋白的深入研究有利于了解ATP釋放信號激發(fā)和傳導過程，為準確描述ATP信號通路提供有價值的素材。研究表明ATP的轉運與釋放與兩種質膜通道相關，一是Cl-離子通道，例如maxi陰離子通道電壓門控通道等；二是孔型連接蛋白、泛連接蛋白Pannexins家族和 P2X7受體等[17]。在胰腺腺泡細胞中，ATP與胰腺消化酶共同儲存于囊泡細胞，在受到釋放信號的刺激下，ATP與胰腺酶原顆粒(zymogen granules，ZG)一起釋放到腺泡細胞外；而在ATP轉運到ZG的分子動力學和藥理學特性的研究中表明ATP必須VNUT的參與與調節(jié)。例如，ATP的囊泡轉運會被巴佛洛霉素A1抑制和通過Cl-誘導激發(fā)，同時表現(xiàn)出KM通道和pH通道的依賴性，這些分子特性都與VNUT的生理特性一致，而且通過Western blot實驗顯示在分離的ZG中，VNUT表現(xiàn)出很強的免疫反應性[18]。

研究表明有許多蛋白參與ATP傳導通道，包括Panx 1和連接蛋白(connexins，Cx)可協(xié)助ATP和UDP從胞質轉運到細胞外；VNUT負責將ATP轉運到儲存囊泡內，在Ca2+通道激發(fā)狀態(tài)下協(xié)助分泌囊泡與薄膜融合并釋放ATP。UDP-葡萄糖(UDPG)和ATP可通過位于內質網/高爾基體的類似于SLC-35轉運體的協(xié)助下，分別利用UMP和AMP作為逆向轉運體的底物而逆向轉運到分泌通路中。內質網/高爾基體核苷酸進行糖基化反應并產生能量驅動作用，該驅動作用力為囊泡運輸提供能量來源，而內質網/高爾基體的代謝分子也能通過囊泡分泌旁路伴隨核苷酸共同分泌到胞質中或者細胞外[19]。利用基因敲除技術對VNUT基因進行敲除，發(fā)現(xiàn)ATP的囊泡儲存與釋放受到了嚴重影響，ATP胞外釋放的量嚴重減少，從而認證了VNUT在ATP轉運到囊泡和囊泡ATP的胞外釋放過程中均發(fā)揮著關鍵作用[20]。

4 小結

VNUT參與核苷酸囊泡轉運過程且發(fā)揮著關鍵作用，其作用一是在核苷酸的囊泡內轉運儲存，為囊泡的細胞內運輸提供能量支持；其二是ATP等高能分子的釋放可激活一系列的細胞信號通路，導致細胞產生相應的生物學效應[21]。對VNUT蛋白及其調控因素的深入研究，有利于更加深入了解VNUT蛋白在囊泡運輸未知的相關機制，從而為揭示囊泡運輸過程提供更為可靠的科學依據(jù)。

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