3D打印技術(shù)在細胞打印方面的應(yīng)用與發(fā)展

魏玉雪，劉曉秋，李迪，呂珊珊，魏珍

(吉林大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院修復(fù)科1、黏膜科2、牙體牙髓病科3，吉林 長春 130021)

3D打印技術(shù)在細胞打印方面的應(yīng)用與發(fā)展

魏玉雪1，劉曉秋1，李迪1，呂珊珊2，魏珍3

(吉林大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院修復(fù)科1、黏膜科2、牙體牙髓病科3，吉林 長春 130021)

3D打印技術(shù)是一種快速成型技術(shù)。本文對3D打印的概念、發(fā)展、現(xiàn)狀作了簡要的概括，重點介紹了3D打印技術(shù)在細胞打印方面的應(yīng)用，分析了各種細胞打印技術(shù)的原理及其優(yōu)缺點，并對3D細胞打印的發(fā)展趨勢進行了展望。

3D打??；生物打??；組織工程；細胞打印

從1986年3D打印技術(shù)問世以來，應(yīng)用領(lǐng)域逐步擴展，包括生活用品、航空航天、機械制造、建筑工業(yè)造型和醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域甚至是活體器官[1]，而它在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用則是當(dāng)前研究的最前沿領(lǐng)域。美國克萊姆森大學(xué)的Thomas Boland教授2000年首次提出“生物3D打印”的概念[2]。

當(dāng)前在醫(yī)學(xué)界面臨著用于器官移植的供體器官極度短缺的重大難題，為了解決供體器官的問題，學(xué)者們開展了多方面的研究。一些人工機械器官早已應(yīng)用于人體，且已市場化，但具有副作用，如人工心臟會引起心功能下降；而異種器官移植特別是轉(zhuǎn)基因動物器官的應(yīng)用，雖然大大降低了移植后發(fā)生急性免疫排斥反應(yīng)的概率，但潛在傳播動物病毒的危險，且患者長期服用免疫抑制劑，可能會對心理產(chǎn)生一定的影響；再生醫(yī)學(xué)通過基因治療或干細胞移植在修復(fù)受損或疾病器官方面是一種有前景且相對更成熟的技術(shù)，但它只是在疾病的早期起作用，在疾病的后期或者對于已經(jīng)發(fā)生器質(zhì)性病變的組織，還需要器官移植；運用組織工程技術(shù)在體外培養(yǎng)各種人類細胞，將形成的仿生組織和器官用于器官移植，比如已經(jīng)有了應(yīng)用組織工程技術(shù)制造的胃、食管、脊髓、皮膚、骨等[3-7]；雖然有專家稱該技術(shù)能夠徹底治療疾病[8-12]，但傳統(tǒng)的組織工程技術(shù)目前尚無法實現(xiàn)工程化生產(chǎn)人造組織和器官，它還有很多不足之處[8]，譬如：支架技術(shù)的空間分辨率限制了細胞滲透到支架材料內(nèi)部的速度，且不能實現(xiàn)高效率均勻貫穿整個支架；無法精確地將不同種類的細胞按照人體組織器官的結(jié)構(gòu)準確定位，并形成類似于天然組織器官的三維結(jié)構(gòu)；固體支架由聚乳酸(PLA)制成，較堅硬，在制造可收縮性的組織如心臟血管方面效果不好；用固體支架接種細胞會導(dǎo)致血管化的缺失，氧供不足，易引起組織或器官的壞死。

2003年Mironov等[13]基于生物自組裝原理，提出“細胞打印”的設(shè)想。細胞打印技術(shù)能夠?qū)⒓毎?、生長因子和支架結(jié)合在一起形成一個完整的整體結(jié)構(gòu)，且各種類型的細胞能夠按照正常的解剖結(jié)夠準確定位，通過細胞、生長因子、支架之間的相互作用，行駛正常的生物學(xué)功能，因此，細胞打印被認為是組織工程中最有潛力的技術(shù)[14]。目前應(yīng)用于細胞打印的技術(shù)主要有以下幾種：

1 激光引導(dǎo)直寫(laser-guided direct writing，LGDW)

20世紀90年代密歇根理工大學(xué)的Odde提出激光輔助的細胞直寫方式[15]，該技術(shù)利用激光對材料的熱沖擊進行打印。關(guān)于該技術(shù)學(xué)者們提出了兩種不同的理論：在液體中流動的細胞在激光光束的光壓作用下沉積到成形平面上；將空心光纖中耦合入激光，細胞通過毫米量級的空心光纖后傳輸?shù)侥繕顺尚螌由?。Odde等[16-17]利用激光對細胞產(chǎn)生梯度力來沉積細胞，實現(xiàn)活細胞的平面直寫，并將其在三維空間上精確定位，結(jié)果顯示細胞生長良好。Gao等[18]證明了活細胞也可被作為操控對象進行組裝。Lin等[19]利用MAPLE DW打印了活性酵母細胞，證明有些打印過程中發(fā)生細胞損傷，但經(jīng)過24 h可以自行修復(fù)，且打印細胞的修復(fù)能力與激光能量密度有關(guān)。Ringeisen等[20]和Barron等[21]證明了多功能鼠胚胎癌細胞和人類骨肉瘤細胞的細胞打印都可以采用激光直寫方式實現(xiàn)。激光直寫方式的優(yōu)點：設(shè)備沒有噴孔，不存在由于細胞懸浮液黏度大或者細胞凝聚造成的噴孔堵塞問題，因此可打印黏度高的生物墨水；激光直寫操控細胞液滴的體積在fL至nL的范圍內(nèi)，分辨率可達到5 μm[22]。缺點：細胞容易受損傷[23]；由于激光打印需要預(yù)先制作細胞基片，所以多種細胞的混合打印難以實現(xiàn)；細胞打印效率低，不適合未來臨床實際應(yīng)用的需要。

2 立體光刻印刷(stereo lithography，SLA)

該技術(shù)需要控制激光逐層照射，最終成形為所需結(jié)構(gòu)體三維模型。2002年，Liu等[24]用掩膜和紫外曝光固化利用光敏性水凝膠將人肝癌細胞與聚乙二醇雙丙烯酸酯共混。2004年，Dhariwala等[25]采用光敏性水凝膠PEO與中國倉鼠卵巢細胞CHOB2細胞共混，他們均構(gòu)建了含有細胞的立體結(jié)構(gòu)。但紫外曝光對細胞有害，光固化誘導(dǎo)劑又具有與劑量相關(guān)的細胞毒性，這些都使細胞成活率降低低。

3 細胞直接三維受控組裝技(three-dimension cell-assembly technique)

2003年由清華大學(xué)顏永年教授提出，通過控制計算機使細胞共混物進入針管或噴腔從而逐層打印出所需要的三維結(jié)構(gòu)[26-27]。三維結(jié)構(gòu)打印完成后為了使其在今后長期培養(yǎng)和植入的過程中長時間的保持穩(wěn)定性，再使用戊二醛等進行后續(xù)的化學(xué)交聯(lián)作用。結(jié)果顯示90%以上細胞成活[28]。

4 聲控打印(acoustic cell bioprinting)

聲控細胞打印是利用傳感器產(chǎn)生表面聲波，達到在細胞懸浮液表面形成焦點的目的，通過控制聲波使焦點處的聲壓超過液體表面張力，從而產(chǎn)生聲控打印液滴[29]。Demirci等[30]和Utkan[31]運用聲控技術(shù)打印了老鼠胚胎干細胞、纖維母細胞、肝細胞等，實驗結(jié)果表明對于大多數(shù)種類的細胞來說，成活率都高于89.9%，證明聲控方式可以打印活性細胞。聲控打印優(yōu)點：沒有噴嘴，液滴的大小和噴射的過程都不受噴孔幾何形狀的影響，無細胞堵塞的現(xiàn)象；在噴射過程中細胞液滴不會受到高溫和高壓的影響產(chǎn)生傷害。缺點：在打印含單細胞液滴時，聲控技術(shù)有時會打印出不含有細胞的液滴，可靠性較弱，重復(fù)性較差，有待進一步提高。

5 基于細胞噴射的生物繪圖/生物三維打印技術(shù)(3D-Bioplotter)

Utkan[31]和Landers等[32]提出了基于細胞噴射的生物繪圖技術(shù)，EnvisionTec于2002年使用了三維生物繪圖機，并將其商用機型投向市場。這一設(shè)備的主要特點就是成形過程是在液體的繪圖介質(zhì)中進行的，噴頭是由雙層金屬套筒包裹的玻璃針管，套筒間通熱油有效的避免了噴頭堵塞，擠出的壓力源來自通過聚四氟乙烯封裝連接的壓縮空氣。Fedorovich等[34]使用該技術(shù)打印了骨髓間充質(zhì)干細胞，用于混合細胞的基質(zhì)材料分別是藻酸鹽、甲基纖維素、瓊脂糖等水凝膠材料，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細胞存活率不等，以藻酸鹽為基質(zhì)的細胞存活率可達90%。缺點：細胞打印效率低；細胞經(jīng)打印后存活率低和功能喪失；打印成本昂貴。

6 噴墨細胞打印(Inkjet printing cells)

噴墨打印主要采用微熱泡或壓電驅(qū)動器噴射液滴，實現(xiàn)細胞打印。2003年克萊姆森大學(xué)的Boland首次提出細胞打印技術(shù)，打印機能夠精確的將細胞懸液噴射到有良好生物學(xué)特性的熱可逆凝膠上的指定位置，層層打印并固化，最終形成一個三維多細胞/凝膠結(jié)構(gòu)體[8]。通過有效的控制最小凝膠層的厚度，實現(xiàn)層與層細胞有效的融合[35]。2003年，Xu等[36]利用熱發(fā)泡式噴墨打印機打印了中國倉鼠卵巢細胞和胚胎運動神經(jīng)元細胞，在大豆瓊脂和膠原蛋白凝膠上形成預(yù)先設(shè)定好的結(jié)構(gòu)，打印結(jié)束之后，通過測定胞質(zhì)內(nèi)乳酸鹽脫氫酶的含量來判斷細胞的活性，結(jié)果顯示細胞保持超過90%的存活率，實現(xiàn)了活細胞打印[37]。2006年Xu等[38]用壓電式噴墨打印人類成纖維細胞懸液，打印后94%～98%的細胞存活。Lee等[39]對比了打印前后大鼠胚胎神經(jīng)元細胞和星形膠質(zhì)細胞活力，發(fā)現(xiàn)細胞活力無差異。

2013年底，英國研究人員使用噴墨打印技術(shù)首次打印了鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)節(jié)細胞和神經(jīng)膠質(zhì)細胞，這兩種成視網(wǎng)膜細胞通過特定電脈沖噴射而出，通過一個不到1 mm的噴嘴“打印”出來。結(jié)果表明，打印出的細胞生長正常。雖然該成果還處于初步研究階段，但這是培育替代組織來修復(fù)受損或病變器官的一個實際步驟，為未來的視網(wǎng)膜修復(fù)提供了可能[40]。2014年蔡昊等[41]簡化了壓電式噴墨打印頭的幾何模型，并將模擬的實驗結(jié)論應(yīng)用到真實打印場景中，對比分析可知與模擬的實驗數(shù)據(jù)基本吻合，這可以優(yōu)化細胞打印相關(guān)的實驗方案和相關(guān)工藝參數(shù)的設(shè)計。He等[42]建立了一個單細胞打印中細胞被噴射在介質(zhì)表面這一過程的新模型，模擬表明打印過程中細胞經(jīng)歷顯著應(yīng)力變化(0～數(shù)十千帕)和局部的膜表面面積的應(yīng)變(0～70%)。2015年Lee等[43]通過壓電式噴墨打印噴射出的速度更快、精度更高液滴在聚酰亞胺表面形成精細線條圖案。

噴墨打印的優(yōu)點：噴嘴與細胞培養(yǎng)液是相互分開的，可以防止相互交叉感染；細胞打印的過程比較簡單；成本低于其他打印方式。由于上述優(yōu)勢，噴墨打印技術(shù)成為目前應(yīng)用較多的一種細胞打印的方式，但也有一些缺點：當(dāng)打印黏度高的“墨水”時，噴嘴容易堵塞，影響打印效果；熱噴墨打印時，噴嘴的最高溫度在300℃以上，容易對細胞造成熱損傷。

7 批量細胞打印(block-cell-printing)

美國休斯頓衛(wèi)理公會研究院的研究人員開發(fā)了批量細胞打印技術(shù)，該技術(shù)是利用一個有鉤狀陷阱的硅膠模具達到活細胞打印的目的，這里活細胞進入模具是在微流體的引導(dǎo)下進行的，這項技術(shù)可以實現(xiàn)讓細胞打印到任何表面和形狀上。他們打印成功了癌變細胞和神經(jīng)細胞還有腦細胞網(wǎng)格，這對于神經(jīng)元信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和軸突再生的研究有很大的意義，可以說是阿爾茨海默氏病和其他神經(jīng)退行性疾病患者的福音。BloC打印優(yōu)點：可以半個小時內(nèi)使用不同類型的細胞打印出細胞緊密到接近5 μm(大多數(shù)動物細胞在10～30 μm寬)的2D細胞陣列；細胞存活率高。缺點：不能實現(xiàn)多層結(jié)構(gòu)打印[44]。

8 結(jié) 語

隨著科學(xué)技術(shù)的進步，3D打印技術(shù)已經(jīng)有了很大的發(fā)展。在細胞打印方面，該技術(shù)還停留在對單細胞打印的研究上，多細胞三維打印的研究還存在很多技術(shù)瓶頸，國內(nèi)外的發(fā)展還都處于初級階段，尤其是國內(nèi)在這方面的報道還很少。而隨著我國物質(zhì)、文化生活水平，以及科學(xué)技術(shù)總體水平的提高，人們對生命質(zhì)量和健康有了更高的要求。3D打印技術(shù)拋棄了傳統(tǒng)的批量化固定尺寸成品生產(chǎn)的模式，可以便捷、快速的為患者量體裁衣，制備個性化的植入物，生產(chǎn)周期明顯縮短，打破了傳統(tǒng)制造業(yè)時間和空間的限制，具有重要的社會效益。細胞打印在給我們帶來驚喜的同時也給我們帶來了很多挑戰(zhàn)。因此，細胞三維打印的研究尤其是多細胞三維打印的研究將是今后很長時間內(nèi)三維打印的研究熱點。

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Application and development of 3D printing technology in cell printing

WEI Yu-xue1,LIU Xiao-qiu1,LI Di1,LV Shan-shan2,WEI Zhen3.Department of Rehabilitation1,Department of Mucous Membrane2,Department of Dental Pulp3, Jilin University Dental Hospital,Changchun 130021,Jilin,CHINA

3D printing technology is a kind of rapid prototyping technology.This paper gives a brief summary of the concept,development and current situation of 3D printing,mainly introduces the application of 3D printing in cell printing,and analyzes the principle,advantages and disadvantages of various cell printing,as well as the development trend of 3D printing in the future.

3D printing;3D-Bioprinting;Tissue engineering;Cell printing

R329.2

A

1003—6350（2017）05—0801—04

2016-07-04)

國家自然科學(xué)基金(編號：813711841014238)；吉林省科技廳資助項目(編號：20160519017JH)

魏玉雪。E-mail：lisa44080809@163.com

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.05.038