• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    桑樹APX基因的克隆及在擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化研究

    2017-02-25 06:12:53林天寶陳金娥計東風呂志強
    浙江農(nóng)業(yè)科學(xué) 2017年1期
    關(guān)鍵詞:桑樹擬南芥轉(zhuǎn)基因

    劉 巖,朱 燕,林天寶,陳金娥,計東風,呂志強

    (浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑研究所,浙江杭州 310021)

    桑樹APX基因的克隆及在擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化研究

    劉 巖,朱 燕,林天寶,陳金娥,計東風,呂志強1*

    (浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑研究所,浙江杭州 310021)

    利用同源克隆、RACE技術(shù),克隆到桑樹APX全長為1 207 bp,包含867 bp的開放閱讀框,預(yù)測其編碼蛋白分子量為31.83 ku,等電點8.08,與APX家族蛋白具有較高同源性;通過進一步構(gòu)建含MaAPX基因的重組農(nóng)桿菌,再轉(zhuǎn)化擬南芥篩選后,獲得了陽性轉(zhuǎn)基因株,為后續(xù)探究桑樹APX基因功能奠定了基礎(chǔ)。

    抗壞血酸過氧化物酶;RACE;桑樹

    逆境脅迫常常刺激植物產(chǎn)生活性氧物質(zhì)(reactive oxygen species,ROS),包括超氧陰離子()、羥基自由基(OH-)、H2O2與單線態(tài)氧等。若未能及時清除,這些ROS便會與蛋白質(zhì)、核酸、脂類等反應(yīng),引起氧化損傷,導(dǎo)致作物產(chǎn)量和品質(zhì)降低,嚴重時甚至造成植物死亡[1]。

    在長期的適應(yīng)過程中,植物已形成了一套復(fù)雜的抗氧化防御系統(tǒng),包括抗氧化酶,如超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、抗壞血酸過氧化物酶(ascorbate peroxidase,APX)、過氧化氫酶(catalase,CAT),以及非酶類復(fù)合物分子,如抗壞血酸(ascorbic acid,AsA)、甜菜堿、脯氨酸等[2]。其中,APX利用AsA為其電子供體,通過將H2O2催化生成H2O,從而實現(xiàn)對植物內(nèi)源H2O2的清除[3-6]。目前,已有從不同物種中克隆到APX的研究報道,包括擬南芥[7]、大麥[8]、棉花[9]、甜菜[10]、橡膠樹[11]等。不同的研究發(fā)現(xiàn),在鹽、低溫等脅迫下,擬南芥AtAPX(又稱為APX3)轉(zhuǎn)錄上調(diào)[12];過量表達擬南芥APX發(fā)現(xiàn)能增強轉(zhuǎn)基因煙草的耐鹽性[13]??梢夾PX基因的鑒定和功能研究對植物品種選育及遺傳改良等方面具有重要意義。

    桑樹作為我國的一種古老樹種,一直以來都是家蠶的飼料,是蠶絲產(chǎn)業(yè)的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。傳統(tǒng)的桑樹研究主要圍繞蠶絲產(chǎn)業(yè)生產(chǎn)而展開。然而近年來的調(diào)查發(fā)現(xiàn),桑樹對鹽堿、干旱和貧瘠等逆境的適應(yīng)性也較強,可以作為鹽堿地綠化及防沙、治沙等生態(tài)治理方面的主要經(jīng)濟樹種,在陜西黃土高原水土保持、新疆沙漠治理、重慶市石漠化治理、北京沙地治理、廣西石漠化治理等生態(tài)建設(shè)中都發(fā)揮重要功效[14]。為此,本研究從桑樹中克隆APX家族基因,與其他來源的APX進行生物信息學(xué)比對,再將桑樹APX基因借助農(nóng)桿菌系統(tǒng)轉(zhuǎn)化到擬南芥中,篩選陽性轉(zhuǎn)基因株。這深化了人們對APX家族基因的了解,為桑樹抗逆品種的選育提供了候選參考基因。

    1 材料與方法

    1.1 植物材料

    桑樹品種強桑1號具有高產(chǎn)、廣適、耐瘠的優(yōu)良生產(chǎn)性能[15],由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑研究所提供。擬南芥(Col-0)由課題組保存。

    1.2 M aAPX全長基因的克隆

    1.2.1 RNA抽提和cDNA合成

    按照Tranzol Plant(北京全式金生物公司)試劑盒方法提取桑樹葉片總RNA,經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA;3’RACE,5’RACE逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)分別參照Clontech Race kit操作說明進行。

    1.2.2 引物設(shè)計

    根據(jù)NCBI已經(jīng)登錄的擬南芥(AIR登錄號:AT4G35000.1)、煙草(GenBank登錄號:XM-0009806131.1)、水稻(GenBank登錄號:AY382617.1)、番茄(GenBank登錄號:NM_ 001308331.1)、葡萄(GenBank登錄號:EU280159.1)、楊樹(GenBank登錄號:KF309667.1)APX基因的保守區(qū),設(shè)計引物F1、R1。再根據(jù)擴增獲得的保守區(qū)cDNA序列設(shè)計3’RACE(F2)和5’RACE(R2)引物,最后設(shè)計引物擴增全長ORF(F3,R3)序列。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司合成。

    F1:5′-ATGCTYCGHYTVGCRTGGCA-3′,R1:5′-AABGCDTCYTCATCCTTWGCA-3′;F2:5′-TGCT AAACAAGGTGCACCACATC-3′,R2:5′-GCACCTT GTTTAGCATCTGGTAGTCGCC-3′;F3:5′-ATGGCT TTTCCGGTGGTGGACGCTG-3′,R3:5′-CTATTTCT TTCTTTTGCGAACTTCGTAG-3′。其中Y=C/T,H= A/T/C,V=G/A/C,R=A/G,B=G/T/C,D= G/A/T,W=A/T。

    1.2.3 擴增反應(yīng)條件

    保守區(qū)段的PCR程序為:94℃變性4 min;94℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸1 min,35個循環(huán);72℃延伸10 m in。3′RACE和5′RACE參照Clontech公司試劑盒說明進行。

    1.2.4 序列測定、分析

    瓊脂糖凝膠電泳分離PCR擴增產(chǎn)物,割膠回收,與pEASY-T1載體鏈接,轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞,挑選克隆,送由上海生工生物工程技術(shù)公司進行測序。

    獲得序列用Blast比較,分析MaAPX的基因結(jié)構(gòu)信息。再用ORF finder(http://www.ncbi.nlm. nih.gov/gorf/orFig.cgi)預(yù)測基因編碼框,以及在線軟件(http://isoelectric.ovh.org/)分析蛋白分子量和等電點,并通過TMHMM server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)預(yù)測分析MaAPX蛋白的二級結(jié)構(gòu)。利用軟件DNAMAN 5.2來分析APX蛋白間的進化同源性。

    1.3 定量PCR

    200 mmol·L-1NaCl每日澆灌,脅迫處理盆栽的強桑1號苗1周后,分別采集脅迫處理組、正常對照組葉片,同上方法抽提RNA進行反轉(zhuǎn)錄后,設(shè)計引物F4(5′ACTCTCACGGCTCCAACAATG 3′)、R4(5′AGATGTCCCTAAGATGTGGTGC 3′)用于定量擴增MaAPX(產(chǎn)物237 bp)、引物F5(5′TTCCTATCTACGAGGGTTATGC 3′)、R5(5′GT CAAGAGCAATGTAAGCCAAT 3′)和F6(5′CCCTG CTATGTATGTGGCTAT 3′)、R6(5′GCTGTGGTGG TGAAAGAGTAA 3′)分別擴增Maactin基因179 bp和Atactin基因225 bp片段作為內(nèi)參。擴增結(jié)果按2-ΔΔCt方法進行統(tǒng)計分析[16]。

    1.4 重組載體的構(gòu)建

    在引物F3、R3的5′端分別添加XhoⅠ和Bam HⅠ位點,經(jīng)擴增反應(yīng)后,膠回收產(chǎn)物經(jīng)XhoⅠ/Bam HⅠ雙酶切后,亞克隆至FGC-5941載體中,轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101,涂布含卡那霉素和鏈霉素的雙抗YEP培養(yǎng)基,28℃培養(yǎng)48 h后,挑取菌斑進行PCR鑒定。鑒定引物選用特異性的F3、R3引物對,針對菌斑進行菌落PCR鑒定,陽性菌落送測序做進一步的鑒定。

    1.5 轉(zhuǎn)基因擬南芥的轉(zhuǎn)化及鑒定

    挑取經(jīng)過菌落PCR驗證、含有重組質(zhì)粒的陽性GV3101克隆,加到含有抗生素的LB液體培養(yǎng)基中,待D600為0.6時,收集菌體;用5%蔗糖溶液、稀釋重懸菌體,浸花法轉(zhuǎn)化擬南芥,收取轉(zhuǎn)化植株的種子,在含10μg·mL-1BASTA除草劑的MS培養(yǎng)基上篩選陽性苗,并利用定量PCR方法檢測轉(zhuǎn)基因株的MaAPX轉(zhuǎn)錄表達水平。

    1.6 統(tǒng)計分析

    利用Excel和SPSS19 version進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析,試驗數(shù)據(jù)為3次重復(fù)的平均值±標準誤,采用單因素方差分析和最小顯著差異法分析不同數(shù)據(jù)組間的差異。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 全長M aAPX cDNA的獲得

    利用簡并引物對桑葉cDNA樣品擴增,克隆獲得584 bp長度產(chǎn)物(圖1中A),測序結(jié)果證實該段序列與NCBI登錄的APX家族基因具有高度同源性。據(jù)此序列進行3′和5′RACE擴增,進一步獲得822 bp和429 bp片段。經(jīng)拼接得到全長的MaAPX cDNA序列(圖1中B),序列全長1 207 bp,含一個完整的開放閱讀框867 bp,編碼288個氨基酸,編碼蛋白包含植物過氧化酶結(jié)構(gòu)域(圖1中C),其分子量為31.83 ku;等電點p I 8.08。C端包含一個“AVGVAVAA”典型的富含纈氨酸和丙氨酸的過氧化酶體導(dǎo)肽序列(圖1中B),同時,TMHMM的分析顯示其包含一個跨膜域(圖1中D)。

    2.2 桑樹APX的進化比較分析

    桑樹MaAPX蛋白與同類蛋白同源性較高,在分析序列中平均高達75.92%。其中,與陸地棉(Gossypium hirsute,GenBank:NP_001314208.1)來源的APX蛋白同源性最高,達86.8%;其次是煙草(GenBank:XP_009804433.1)、番茄(GenBank:NP_001295260.1),分別高達86.4%和85.4%。相比之下,MaAPX與葡萄(GenBank:EU280159.1)、橡膠樹(GenBank:AAO14118.1)、楊樹(GenBank:KF309667.1)同源性相對較低,只有64.3%~65.9%。根據(jù)APX蛋白在不同物種間的保守性差異,繪制出進化樹(圖2)。

    圖1 MaAPX的擴增及序列特點

    2.3 鹽脅迫下桑樹MaAPX的轉(zhuǎn)錄表達分析

    200 mmol·L-1鹽脅迫處理后,檢測MaAPX在盆栽桑樹苗葉片中的轉(zhuǎn)錄表達水平發(fā)現(xiàn),與正常未脅迫的對照組桑苗相比,脅迫后葉片中MaAPX的轉(zhuǎn)錄表達水平明顯上調(diào)(P<0.05,圖3),證實MaAPX響應(yīng)鹽脅迫的刺激,參與脅迫條件下的植物適應(yīng)性反應(yīng)。

    2.4 重組載體的構(gòu)建及農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化

    利用PCR和基因重組技術(shù),將MaAPX片段構(gòu)建入pFGC5941的Xho I和Bam H I限制性內(nèi)切酶位點之間,經(jīng)酶切和測序鑒定后,成功構(gòu)建獲得重組表達載體pFGC-MaAPX(圖4中A)。轉(zhuǎn)化GV3101農(nóng)桿菌,涂布含卡那霉素(50μg·m L-1)和鏈霉素(50μg·m L-1)的抗性平板篩選,利用引物F3、R3,針對生長的農(nóng)桿菌菌落進行PCR檢測,結(jié)果挑選克隆均擴增到特異的MaAPX產(chǎn)物條帶(圖4中B)。

    2.5 不同轉(zhuǎn)基因擬南芥株系間的表達豐度檢測

    在Basta(10μg·m L-1)抗性的MS培養(yǎng)平板上,轉(zhuǎn)基因植株能正常生長,而未轉(zhuǎn)入基因的植株不能正常萌發(fā)。選擇抗性篩選下長勢良好的幼苗經(jīng)PCR檢測確定陽性后,將獲得株系MaAPX移栽入營養(yǎng)土盆缽中。分別單株收轉(zhuǎn)基因株系種子,重復(fù)以上抗性篩選過程,獲得純化轉(zhuǎn)基因株系。利用熒光定量PCR檢測了MaAPX在轉(zhuǎn)基因株系中的轉(zhuǎn)錄表達量(圖5)。

    圖2 桑樹MaAPX與幾種已報道APX蛋白的同源性及進化比較

    圖3 脅迫后MaAPX在桑葉中的轉(zhuǎn)錄表達

    圖4 重組pFGCc-MaAPX的構(gòu)建及在轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌中的PCR檢測

    圖5 不同擬南芥轉(zhuǎn)基因株系中的MaAPX表達豐度

    3 討論

    本研究從目前生產(chǎn)廣泛應(yīng)用的強桑品種中克隆到MaAPX基因,對其進行了一系列的生物信息學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)MaAPX具有保守的植物過氧化物酶體結(jié)構(gòu)域(圖1),氨基酸組成上與APX家族蛋白同源性較高(圖2)。MaAPX的C段包含序列“AVGVAVAA”即為典型的富含纈氨酸和丙氨酸的過氧化酶體導(dǎo)肽,Mullen等[17]報道含有這種過氧化物酶體定位導(dǎo)肽的酶錨定在過氧化酶體,蛋白分子向外暴露于胞質(zhì)。推測MaAPX可能也是定位于過氧化酶體的同工酶,與毛白楊相似[18]。雖然同為過氧化酶體定位的APX,桑樹APX與陸地棉、煙草等同源性卻遠高于與毛白楊A(yù)PX(圖2),由于植物體內(nèi)執(zhí)行過氧化物酶功能的有一大類家族蛋白,不同APX基因在不同物種間可能表現(xiàn)出不同的作用模式。

    H2O2是一種重要的活性氧基團,在植物體內(nèi)可由多種刺激(如脅迫、激素等)誘導(dǎo)產(chǎn)生。高濃度的H2O2對細胞具有較強的損傷能力,能夠氧化細胞內(nèi)多種重要的酶分子,甚至損傷DNA,對植物細胞造成不可逆的傷害。鑒于APX可以清除逆境產(chǎn)生的自由基,近年來植物耐逆性研究中的一個熱點就是向植物中導(dǎo)入APX基因,提高植物體內(nèi)的APX蛋白活性[19]。Wang等[20]在番茄中過量表達APX證實轉(zhuǎn)基因番茄的抗寒和抗鹽能力得到顯著提高;Sarowar等[21]將一個辣椒APX基因轉(zhuǎn)入煙草,同樣提高了轉(zhuǎn)基因煙草的抗氧化脅迫與抗真菌能力,而許傳俊等[22]從蝴蝶蘭中克隆了APX基因,研究其在蝴蝶蘭體內(nèi)的時空表達情況及對機械傷害和高鹽脅迫的響應(yīng)。本研究為后續(xù)開展桑樹APX生理功能及其相關(guān)的抗氧化機理研究提供了基礎(chǔ)。

    [1] BADAW IG H,KAWANO N,YAMAUCH I Y,et al.Overexpression of ascorbate peroxidase in tobacco chloroplasts enhances the tolerance to salt stress and water deficit[J]. Physiologia Plantarum,2004,121(2):231-238.

    [2] ASADA K.The water-water cycle in chloroplasts:Scavenging of active oxygens and dissipation of excess photons[J].Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology,1999,50:601-639.

    [3] ASADA K.Production and scavenging of reactive oxygen species in chloroplasts and their functions[J].Plant Physiology,2006,141(2):391-396.

    [4] LU Z,LIU D,LIU S.Two rice cytosolic ascorbate peroxidases differentially improve salt tolerance in transgenic Arabidopsis[J].Plant Cell Reports,2007,26(10):1909-1917.

    [5] GILL S S,TUTEJA N.Reactive oxygen species and antioxidant machinery in abiotic stress tolerance in cropplants[J].Plant Physiology&Biochem istry,2010,48(12):909-930.

    [6] SH IGEOKA S,ISHIKAWA T,TAMOI M,et al.Regu lation and function of ascorbate peroxidase isoenzymes[J].Journal of Experimental Botany,2002,53(372):1305-1319.

    [7] ZHANG H,WANG J,NICKEL U,et al.Cloning and expression of an Arabidopsis gene encoding a putative peroxisomal ascorbate peroxidase[J].Plant Molecular Biology,1997,34(6):967-971.

    [8] SH IW M,MURAMOTO Y,UEDA A,et al.Cloning of peroxisomal ascorbate peroxidase gene from barley and enhanced thermos tolerance by overexpressing in Arabidopsis thaliana[J].Gene,2001,273(1):23-27.

    [9] SHEN G,KUPPU S,VENKATARAMANI S,et al.Ankyrin repeat-containing protein 2A is an essentialmolecular chaperone for peroxisomal membrane-bound ascorbate peroxidase3 in Arabidopsis[J].Plan t Cell,2010,22(3):811-831.

    [10] DUNAJSKA-ORDAK K,SKORUPA-K?APUTM,KURNIK K,et al.Cloning and expression analysis of a gene encoding for ascorbate peroxidase and responsive to salt stress in beet(Beta υulgaris)[J].Plant Molecular Biology Reporter,2014,32(1):162-175.

    [11] CHAO J,ZHANG S,CHEN Y,et al.Cloning,heterologous exp ression and characterization of ascorbate peroxidase(APX)gene in laticifer cells of rubber tree(Heυea brasiliensis Muell. Arg.)[J].Plant Physiology&Biochemistry,2015,97:331-338.

    [12] ZHANG H,WANG J,NICKEL U,et al.Cloning and expression of an Arabidopsis gene encoding a putative peroxisomal ascorbate peroxidase[J].Plant Molecular Biology,1997,34(6):967-971.

    [13] BADAW I GH,KAWANO N,YAMAUCH I Y,et al.Overexpression of ascorbate peroxidase in tobacco chloroplasts enhances the tolerance to salt stress and water deficit[J]. Physiologia Plantarum,2004,121(2):231-238.

    [14] VIJAYAN K,SRIVASTAVAA P P,RAGHUNATHB M K,et al.Enhancement of stress tolerance in mulberry[J].Scientia Horticulturae,2011,129:511-519.

    [15] 呂志強,計東風,周勤,等.桑樹新品種強桑1號的選育[J].蠶業(yè)科學(xué),2011,37(1):9-12.

    [16] LIVAK K J,SCHMITTGEN T D.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-DeltaDeltaC(T))method[J].Methods,2001,25(4):402-408.

    [17] MULLEN R T,TRELEASE R N.The sorting signals for peroxisomalmembrane-bound ascorbate peroxidase are within its C-terminal tail[J].Journal of Biological Chem istry,2000,275(21):16337-16344.

    [18] 潘翔,李娜,李印軍,等.毛白楊抗壞血酸過氧化物酶基因PtAPX2的克隆表達及分析[J].北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報,2013,35(1):36-44.

    [19] ISHIKAWA T,SAKAI K,YOSHIMURA K,et al.cDNAs encoding sp inach stromal and thylakoid-bound ascorbate peroxidase,differing in the presence or absence of their 3’-coding regions[J].FEBS Letters,1996,384(3):289-293.

    [20] WANG Y J,W ISNIEWSKI M,MEILAN R,et al. Overexpression of cytosolic ascorbate peroxidase in tomato con fers tolerance to chilling and salt stress[J].Journal of American Society for Horticultural Science,2005,130(2):167-173.

    [21] SAROWAR S,KIM E N,KIM Y J,et al.Overexpression of a pepper ascorbate p roxidase-like 1 gene in tobacco plants enhances tolerance to oxidative stress and pathogens[J].Plant Science,2005,169(1):55-63.

    [22] 許傳俊,孫敘卓,李玲,等.蝴蝶蘭抗壞血酸過氧化物酶基因克隆及其表達研究[J].園藝學(xué)報,2012,39(4):769-776.

    (責任編輯:張 韻)

    S888

    A

    0528-9017(2017)01-0155-05

    文獻著錄格式:劉巖,朱燕,林天寶,等.桑樹APX基因的克隆及在擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化研究[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué),2017,58(1):155-159.

    10.16178/j.issn.0528-9017.20170149

    2016-08-23

    現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(蠶桑)(CARS-22-ZJ0105);浙江省農(nóng)業(yè)新品種選育重大科技專項

    劉 巖(1976-),女,河南焦作人,副研究員,從事桑蠶分子生物學(xué)研究工作,E-mail:lymorus@gmail.com。

    呂志強(1965-),研究員,從事桑樹育種學(xué)研究工作,E-mail:1398131715@139.com。

    猜你喜歡
    桑樹擬南芥轉(zhuǎn)基因
    擬南芥:活得粗糙,才讓我有了上太空的資格
    探秘轉(zhuǎn)基因
    轉(zhuǎn)基因,你吃了嗎?
    馬桑樹兒搭燈臺
    桑樹變身增收“搖錢樹”
    尿黑酸對擬南芥酪氨酸降解缺陷突變體sscd1的影響
    奶奶家的桑樹
    兩種LED光源作為擬南芥生長光源的應(yīng)用探究
    擬南芥干旱敏感突變體篩選及其干旱脅迫響應(yīng)機制探究
    哭泣的桑樹
    亚洲视频免费观看视频| 一区在线观看完整版| 日本五十路高清| 日日爽夜夜爽网站| 久久 成人 亚洲| 一进一出抽搐动态| 国产成人影院久久av| 欧美日韩乱码在线| 亚洲一码二码三码区别大吗| 这个男人来自地球电影免费观看| 中国美女看黄片| 久久久久国内视频| 一区在线观看完整版| 国产成人欧美在线观看| 国产高清videossex| 亚洲精品久久午夜乱码| 精品卡一卡二卡四卡免费| 女性被躁到高潮视频| 一级黄色大片毛片| 欧美性长视频在线观看| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 在线天堂中文资源库| 成年人黄色毛片网站| 久久影院123| 在线观看66精品国产| 日本 av在线| 亚洲av熟女| 中出人妻视频一区二区| 99国产精品一区二区三区| av天堂在线播放| av有码第一页| 操美女的视频在线观看| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 久久人人精品亚洲av| 天天添夜夜摸| 婷婷丁香在线五月| 九色亚洲精品在线播放| 欧美午夜高清在线| 麻豆国产av国片精品| 久久热在线av| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 91成年电影在线观看| 精品熟女少妇八av免费久了| 久久久久久久久中文| 嫩草影视91久久| 国产午夜精品久久久久久| 欧美日韩一级在线毛片| 国产成人精品久久二区二区免费| 日韩成人在线观看一区二区三区| 人成视频在线观看免费观看| 多毛熟女@视频| 97人妻天天添夜夜摸| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 免费人成视频x8x8入口观看| 国产精品 欧美亚洲| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 精品国产一区二区三区四区第35| 麻豆av在线久日| 国产人伦9x9x在线观看| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 黄色视频不卡| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 亚洲欧美日韩无卡精品| 亚洲精华国产精华精| 成人18禁在线播放| 国产一区二区三区视频了| 深夜精品福利| 精品无人区乱码1区二区| 久久久久久久久中文| 午夜免费成人在线视频| 精品国产乱码久久久久久男人| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 国产乱人伦免费视频| 国产高清激情床上av| 麻豆av在线久日| 最新美女视频免费是黄的| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 欧美精品一区二区免费开放| 在线国产一区二区在线| 国产精品影院久久| 男女下面插进去视频免费观看| 久久精品国产99精品国产亚洲性色 | 亚洲熟妇中文字幕五十中出 | 国产欧美日韩一区二区三区在线| 欧美日韩乱码在线| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 国产亚洲av高清不卡| 国产精品国产av在线观看| 午夜免费激情av| 精品一区二区三区av网在线观看| 亚洲 国产 在线| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 中亚洲国语对白在线视频| 级片在线观看| 国产深夜福利视频在线观看| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 国产成人欧美在线观看| 91精品国产国语对白视频| 国产成人欧美在线观看| 日韩欧美一区视频在线观看| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 精品国产一区二区久久| 黄色a级毛片大全视频| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 一级a爱片免费观看的视频| 亚洲av日韩精品久久久久久密| a在线观看视频网站| √禁漫天堂资源中文www| 日韩免费高清中文字幕av| 夜夜看夜夜爽夜夜摸 | 母亲3免费完整高清在线观看| 午夜精品在线福利| 大码成人一级视频| 99国产精品99久久久久| 天堂俺去俺来也www色官网| 亚洲成人精品中文字幕电影 | 桃红色精品国产亚洲av| 日本vs欧美在线观看视频| 我的亚洲天堂| 午夜激情av网站| 99久久人妻综合| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 免费人成视频x8x8入口观看| 成年女人毛片免费观看观看9| 韩国av一区二区三区四区| 波多野结衣高清无吗| 久久亚洲精品不卡| 99热只有精品国产| 午夜福利免费观看在线| 日本a在线网址| 亚洲人成伊人成综合网2020| 91大片在线观看| 精品国内亚洲2022精品成人| 成人永久免费在线观看视频| 精品一区二区三区视频在线观看免费 | 日本黄色视频三级网站网址| 亚洲片人在线观看| 日韩欧美免费精品| 男人操女人黄网站| 国产片内射在线| 老司机亚洲免费影院| 神马国产精品三级电影在线观看 | 麻豆国产av国片精品| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 欧美久久黑人一区二区| 91字幕亚洲| 国产精品爽爽va在线观看网站 | 日日干狠狠操夜夜爽| 男女高潮啪啪啪动态图| 午夜视频精品福利| 大型av网站在线播放| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 无遮挡黄片免费观看| 麻豆av在线久日| 啦啦啦在线免费观看视频4| 久久久国产欧美日韩av| 香蕉国产在线看| 色播在线永久视频| 久久亚洲精品不卡| 色婷婷av一区二区三区视频| 日韩中文字幕欧美一区二区| 欧美日韩乱码在线| 亚洲色图综合在线观看| 午夜a级毛片| 国产熟女午夜一区二区三区| 国产精品99久久99久久久不卡| 老汉色av国产亚洲站长工具| www.精华液| 国产成人欧美| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 9色porny在线观看| 国产一区在线观看成人免费| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 国产精品秋霞免费鲁丝片| 欧美激情久久久久久爽电影 | 真人一进一出gif抽搐免费| 黑人操中国人逼视频| 久久亚洲精品不卡| 女人精品久久久久毛片| 亚洲精品在线美女| av在线天堂中文字幕 | 搡老岳熟女国产| 91国产中文字幕| 亚洲欧美一区二区三区久久| 日本精品一区二区三区蜜桃| 亚洲精品国产一区二区精华液| 国产99白浆流出| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 美女高潮到喷水免费观看| 大码成人一级视频| www.自偷自拍.com| 日韩人妻精品一区2区三区| 国产精品电影一区二区三区| 男人舔女人下体高潮全视频| 无人区码免费观看不卡| 亚洲中文字幕日韩| 午夜亚洲福利在线播放| 久久 成人 亚洲| 午夜福利欧美成人| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 激情视频va一区二区三区| 国产av精品麻豆| 国产av一区在线观看免费| 亚洲精品中文字幕在线视频| 男女下面进入的视频免费午夜 | 大型黄色视频在线免费观看| 久久久水蜜桃国产精品网| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 看黄色毛片网站| av中文乱码字幕在线| 久久久久久久精品吃奶| 久久影院123| 色婷婷久久久亚洲欧美| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 两性夫妻黄色片| 欧美乱码精品一区二区三区| 日韩成人在线观看一区二区三区| 99国产精品一区二区蜜桃av| 黄色丝袜av网址大全| 日韩中文字幕欧美一区二区| 啦啦啦 在线观看视频| 夜夜夜夜夜久久久久| 午夜激情av网站| 久久久水蜜桃国产精品网| 成人亚洲精品一区在线观看| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 淫妇啪啪啪对白视频| 午夜福利影视在线免费观看| 久久狼人影院| 在线观看舔阴道视频| 丝袜在线中文字幕| 国产精品九九99| 国产成人影院久久av| 免费观看精品视频网站| 色哟哟哟哟哟哟| 国产午夜精品久久久久久| 首页视频小说图片口味搜索| 无限看片的www在线观看| 天天影视国产精品| 久久精品成人免费网站| svipshipincom国产片| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 久久久精品欧美日韩精品| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 日韩成人在线观看一区二区三区| 黄频高清免费视频| 校园春色视频在线观看| av免费在线观看网站| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 99热国产这里只有精品6| 精品国产国语对白av| 亚洲国产精品999在线| 男女下面插进去视频免费观看| 国产精品永久免费网站| 激情视频va一区二区三区| 一个人免费在线观看的高清视频| 精品熟女少妇八av免费久了| netflix在线观看网站| 亚洲,欧美精品.| 99久久综合精品五月天人人| 91成人精品电影| 久久香蕉激情| 不卡一级毛片| 久久性视频一级片| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 99久久99久久久精品蜜桃| 99国产精品免费福利视频| 亚洲国产中文字幕在线视频| 纯流量卡能插随身wifi吗| 国产三级黄色录像| 嫁个100分男人电影在线观看| 国产精品国产av在线观看| 天堂中文最新版在线下载| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 9热在线视频观看99| 久久中文看片网| 黄色女人牲交| 国产黄a三级三级三级人| 制服诱惑二区| 日韩大尺度精品在线看网址 | 窝窝影院91人妻| 男女午夜视频在线观看| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 曰老女人黄片| a级片在线免费高清观看视频| 国产熟女午夜一区二区三区| 在线观看舔阴道视频| av欧美777| 男人操女人黄网站| 欧美乱码精品一区二区三区| 国产高清激情床上av| 国产av又大| 亚洲一区二区三区不卡视频| 在线免费观看的www视频| 免费在线观看黄色视频的| 久久国产亚洲av麻豆专区| 1024香蕉在线观看| 国产高清国产精品国产三级| 亚洲激情在线av| 人妻久久中文字幕网| 神马国产精品三级电影在线观看 | 一a级毛片在线观看| 国产97色在线日韩免费| 国产三级在线视频| 亚洲成a人片在线一区二区| 亚洲全国av大片| 制服诱惑二区| 老司机靠b影院| 国产黄色免费在线视频| 欧美成人午夜精品| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 国产精品一区二区在线不卡| 国产91精品成人一区二区三区| www.精华液| 精品一区二区三卡| 婷婷丁香在线五月| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 日本wwww免费看| 老熟妇仑乱视频hdxx| 91国产中文字幕| 久久香蕉精品热| 麻豆av在线久日| 水蜜桃什么品种好| 在线观看午夜福利视频| 亚洲欧美激情在线| 国产精品偷伦视频观看了| 在线观看66精品国产| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 18禁美女被吸乳视频| 亚洲专区字幕在线| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 日韩av在线大香蕉| 亚洲色图av天堂| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 国产极品粉嫩免费观看在线| 国产精品综合久久久久久久免费 | 十分钟在线观看高清视频www| 国产精品99久久99久久久不卡| 91精品三级在线观看| 三级毛片av免费| 成人永久免费在线观看视频| 亚洲国产看品久久| 久久香蕉激情| 女同久久另类99精品国产91| 性色av乱码一区二区三区2| 怎么达到女性高潮| 日本 av在线| 国产国语露脸激情在线看| 在线观看66精品国产| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 国产成人系列免费观看| 久久亚洲真实| 日日摸夜夜添夜夜添小说| avwww免费| 免费在线观看黄色视频的| 成年版毛片免费区| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 成人三级做爰电影| 免费在线观看影片大全网站| 亚洲黑人精品在线| 亚洲中文日韩欧美视频| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 国产麻豆69| 亚洲成人免费电影在线观看| 俄罗斯特黄特色一大片| 亚洲情色 制服丝袜| 在线观看一区二区三区激情| 成年人黄色毛片网站| 女性被躁到高潮视频| av福利片在线| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 久久久水蜜桃国产精品网| 欧美最黄视频在线播放免费 | 国产人伦9x9x在线观看| 欧美av亚洲av综合av国产av| 成年人免费黄色播放视频| 男女下面插进去视频免费观看| 亚洲色图综合在线观看| 亚洲,欧美精品.| 国产精品久久电影中文字幕| 无遮挡黄片免费观看| 精品福利永久在线观看| 国产在线精品亚洲第一网站| 另类亚洲欧美激情| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 黄色视频不卡| 搡老熟女国产l中国老女人| 亚洲九九香蕉| 亚洲色图av天堂| 免费看十八禁软件| 麻豆久久精品国产亚洲av | 曰老女人黄片| 久久久久九九精品影院| 欧美亚洲日本最大视频资源| 日韩有码中文字幕| 色在线成人网| 多毛熟女@视频| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 亚洲色图综合在线观看| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 一区二区三区国产精品乱码| 国产亚洲精品久久久久5区| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 人成视频在线观看免费观看| 夜夜看夜夜爽夜夜摸 | 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 中文欧美无线码| 老司机靠b影院| 热99re8久久精品国产| 99国产极品粉嫩在线观看| 精品久久蜜臀av无| 精品国产美女av久久久久小说| 最新美女视频免费是黄的| 一二三四社区在线视频社区8| 一级毛片精品| 国产有黄有色有爽视频| 亚洲色图av天堂| 桃红色精品国产亚洲av| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 99久久精品国产亚洲精品| 亚洲第一av免费看| 搡老乐熟女国产| 91精品三级在线观看| 精品高清国产在线一区| 高清黄色对白视频在线免费看| 亚洲色图av天堂| 超色免费av| 国产精品综合久久久久久久免费 | 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 一进一出好大好爽视频| 日日爽夜夜爽网站| 黄频高清免费视频| 国产亚洲av高清不卡| 欧美精品一区二区免费开放| 久久久久亚洲av毛片大全| 十分钟在线观看高清视频www| 好男人电影高清在线观看| 国产精品偷伦视频观看了| 亚洲午夜理论影院| 女性被躁到高潮视频| 亚洲,欧美精品.| 首页视频小说图片口味搜索| 正在播放国产对白刺激| 日韩中文字幕欧美一区二区| 中亚洲国语对白在线视频| 岛国在线观看网站| 亚洲九九香蕉| 精品高清国产在线一区| 天堂√8在线中文| 国产成人av激情在线播放| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 成熟少妇高潮喷水视频| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 国产亚洲欧美98| 国产精品影院久久| 美女 人体艺术 gogo| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 嫁个100分男人电影在线观看| 黄色 视频免费看| 很黄的视频免费| 在线观看一区二区三区| 亚洲情色 制服丝袜| 国产成人精品在线电影| 欧美激情久久久久久爽电影 | 性欧美人与动物交配| 亚洲国产看品久久| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 亚洲性夜色夜夜综合| 97人妻天天添夜夜摸| 两性夫妻黄色片| av中文乱码字幕在线| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 亚洲成av片中文字幕在线观看| netflix在线观看网站| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 国产免费男女视频| 亚洲一区二区三区欧美精品| 精品电影一区二区在线| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 国产欧美日韩精品亚洲av| 午夜福利影视在线免费观看| 99riav亚洲国产免费| ponron亚洲| 精品欧美一区二区三区在线| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| av电影中文网址| 老鸭窝网址在线观看| 一进一出抽搐gif免费好疼 | 一二三四社区在线视频社区8| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 一级,二级,三级黄色视频| 三上悠亚av全集在线观看| 色婷婷av一区二区三区视频| 免费av毛片视频| 国产成人精品久久二区二区免费| 电影成人av| 999久久久国产精品视频| 91麻豆av在线| 一二三四社区在线视频社区8| 欧美乱色亚洲激情| 一区二区三区精品91| 新久久久久国产一级毛片| www.熟女人妻精品国产| 国产成人精品在线电影| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 一进一出抽搐动态| 一区二区日韩欧美中文字幕| 国产精品野战在线观看 | 国产成人欧美| 婷婷丁香在线五月| 亚洲精品美女久久av网站| 热99国产精品久久久久久7| 嫁个100分男人电影在线观看| 99国产极品粉嫩在线观看| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 成人免费观看视频高清| 国产精品1区2区在线观看.| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 国产主播在线观看一区二区| 美女福利国产在线| 麻豆av在线久日| 乱人伦中国视频| 天堂影院成人在线观看| 久久中文字幕人妻熟女| 久久精品91蜜桃| 国产成人欧美在线观看| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 国产一区二区三区在线臀色熟女 | av免费在线观看网站| 午夜福利在线观看吧| 亚洲一区二区三区色噜噜 | 国产97色在线日韩免费| 无遮挡黄片免费观看| 在线观看日韩欧美| 国产精品野战在线观看 | 久久精品国产综合久久久| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 精品久久久久久成人av| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 久久伊人香网站| 18禁国产床啪视频网站| 国产精品电影一区二区三区| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 亚洲视频免费观看视频| 黄色a级毛片大全视频| 99在线人妻在线中文字幕| 国产成人精品久久二区二区免费| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 女性被躁到高潮视频| 国产精华一区二区三区| 激情视频va一区二区三区| 99国产精品一区二区蜜桃av| 高清欧美精品videossex| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 国产精品国产高清国产av| 在线观看午夜福利视频| 少妇粗大呻吟视频| 99热国产这里只有精品6| 18禁观看日本| 国产单亲对白刺激| 两个人免费观看高清视频| 精品一区二区三区av网在线观看| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 久久 成人 亚洲| 成在线人永久免费视频| 亚洲专区字幕在线| 1024视频免费在线观看| 三上悠亚av全集在线观看| 在线av久久热| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 亚洲av成人av| 看黄色毛片网站| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 国产伦一二天堂av在线观看| 69av精品久久久久久| 一二三四在线观看免费中文在| 麻豆av在线久日| 黄色 视频免费看| 性少妇av在线| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 怎么达到女性高潮| 日韩视频一区二区在线观看| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 精品国产乱码久久久久久男人| a级毛片黄视频| 这个男人来自地球电影免费观看| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 国产97色在线日韩免费| 日韩欧美一区视频在线观看| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 精品久久久久久久毛片微露脸| 岛国在线观看网站| 超色免费av| 99久久人妻综合| 成人亚洲精品av一区二区 | 女警被强在线播放| 免费少妇av软件| xxx96com| 黑丝袜美女国产一区| 精品福利观看| 久久午夜亚洲精品久久| 国产野战对白在线观看| 高清在线国产一区| 久久久久久久午夜电影 |