高耐性醬油酵母選育及其高密度發(fā)酵調(diào)控

陳雄，李欣，王志，代俊

湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院，發(fā)酵工程教育部重點實驗室，工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，武漢 430068

高耐性醬油酵母選育及其高密度發(fā)酵調(diào)控

陳雄，李欣，王志，代俊

湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院，發(fā)酵工程教育部重點實驗室，工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，武漢 430068

陳雄，教授，湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院副院長，湖北省有突出貢獻中青年專家，湖北省食品安全標(biāo)準(zhǔn)審評委員會委員，湖北工業(yè)大學(xué)“南湖學(xué)者”特聘教授。《生物資源》、《化學(xué)與生物工程》雜志編委，曾榮獲“湖北省先進工作者”、“湖北五一勞動獎?wù)隆?、“湖北師德?biāo)兵”、“湖北青年五四獎?wù)隆钡葮s譽。主要研究領(lǐng)域為酵母工程、釀造工程和食品生物技術(shù)。主持縱橫向科研項目40余項，發(fā)表三大檢索收錄論文30余篇，榮獲國家、省級科技成果獎勵6項，其中國家科技進步二等獎1項，湖北省科技進步一等獎1項。E-mail：cx163_qx@163.com，chenxiong@ mail.hbut.edu.cn

高耐性酵母廣泛應(yīng)用于食品、釀造、飼料、生物能源等行業(yè)，酵母的耐受性對其生產(chǎn)和應(yīng)用有著決定性影響。高耐性酵母菌種改良是酵母資源利用的關(guān)鍵步驟，高密度發(fā)酵是克服耐性酵母產(chǎn)業(yè)化的主要瓶頸技術(shù)。對傳統(tǒng)釀造食品醬油生產(chǎn)中常用的耐高鹽酵母菌株的選育、耐性機制及其高密度發(fā)酵技術(shù)研究進展進行了綜述。

高耐性醬油酵母；選育；抗逆機制；高密度發(fā)酵

酵母是目前唯一年產(chǎn)量超過百萬噸的微生物制品，其應(yīng)用范圍覆蓋了食品和化學(xué)工業(yè)、健康產(chǎn)業(yè)、基礎(chǔ)生物學(xué)、生物醫(yī)藥工程和環(huán)境工程等多個領(lǐng)域[1]。我國是世界上醬油產(chǎn)銷量最多的國家，2015年產(chǎn)量約1000萬噸，約占世界總產(chǎn)量的65%。在傳統(tǒng)釀造醬油發(fā)酵過程中，存在7個屬23個種的耐鹽酵母菌[2]，其中與醬油質(zhì)量關(guān)系最密切的是魯氏酵母、易變球擬酵母、埃契氏球擬酵母和醬醪接合酵母等。在醬油高鹽稀態(tài)醬醪發(fā)酵過程中，主要使用的耐鹽產(chǎn)香酵母是T酵母（Torulopsis versatilis）、S酵母（Zygosaccharomyces rouxii）和C酵母（Candida versatilis）[3]。魯氏酵母是生產(chǎn)醬油、日本味（miso）和泰國發(fā)酵魚制品（plaa-som）等發(fā)酵制品的重要菌株[4-5]。作為醬油發(fā)酵過程中的主發(fā)酵酵母，魯氏酵母參與醬油釀造中后期風(fēng)味物質(zhì)形成，可產(chǎn)生乙醇、異戊醇等小分子醇類和甘油、阿拉伯糖醇等糖醇類，以及4-基呋喃酮類等風(fēng)味成分[6]。球擬酵母是后熟酵母，通過合成4-乙基愈創(chuàng)木酚、4-乙基愈苯酚等酚類物質(zhì)，賦予醬油主體香味[7]。

1 高耐性醬油酵母選育

魯氏酵母具有典型的酵母菌落形態(tài)特征，是最常見的嗜高滲透壓酵母菌。在18%NaCl條件下生長正常，在24%NaCl濃度時仍具有生長能力；能在Aw0.62的果糖溶液以及Aw0.65的葡萄糖/甘油溶液中生長[8]。球擬酵母，多邊芽殖，菌體呈球形、卵形或略長形。在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)時有沉渣及環(huán)產(chǎn)生，有時生成菌璞，不形成孢子[9]。

受限于食品工業(yè)中對微生物菌種安全的要求，高耐性酵母菌的育種技術(shù)主要是基于傳統(tǒng)的方法和原理，如直接篩選、誘變育種和原生質(zhì)體融合等。耐性釀造酵母天然存在于腌制品（如醬菜、醬類等）、醬油、蜜餞和一些高糖分的水果中，因此基于高效的篩選策略從這些原料中獲取優(yōu)良菌株是最直接的途徑，而且，能保證菌株的安全性。施安輝[10]在醬菜中分離出一株耐鹽產(chǎn)酯酵母（編號為產(chǎn)酯酵母8號），產(chǎn)乙酸乙酯能力為119.14mg/ dL，在12%～14%NaCl培養(yǎng)基中生長良好。陳雄等[11]利用高通量篩選技術(shù)從我國不同地區(qū)的不同民間釀造食品中獲得能在24%鹽濃度下生長，且具有0～60%葡萄糖耐受能力的風(fēng)味魯氏酵母菌株CCTCC M 2013310，可產(chǎn)生苯乙醇、正丁醇等風(fēng)味物質(zhì)。

誘變育種是將這些高產(chǎn)菌種經(jīng)過一些物理（紫外線、等離子、γ射線等）或者化學(xué)誘變（氯化鋰、亞硝基胍等）處理后再逆境篩選。實際使用的菌株大多采用此方法選育。王弋博等[12]從天水市秦安縣和甘谷縣鹽堿地分離出的YB-9菌株經(jīng)紫外線與亞硝酸復(fù)合誘變后，得到具有240g/L耐鹽度的YB-9-N1菌株，比出發(fā)菌株的耐鹽度提高了84.6%。通過對產(chǎn)酯酵母（Saccharomyces sp.）用紫外線、硫酸二乙酯復(fù)合誘變處理和TTC培養(yǎng)基篩選，于同立等[13]共篩選出代謝活力強的菌株385個，通過耐鹽性、嗜熱性實驗，篩選出4株可在7%～13%NaCl和42℃培養(yǎng)條件下，正常生長、繁殖代謝能力強的優(yōu)良菌株。司曉光等[14]以產(chǎn)丙酮酸的光滑球擬酵母（Torulopsis glabrata）Tp19為出發(fā)菌株，采用常壓室溫等離子誘變系統(tǒng)（atmospheric and room temperature plasma，ARTP）進行誘變，根據(jù)CaCO3篩選平板透明圈與菌落直徑比以及100孔板產(chǎn)酸量快速篩選丙酮酸高產(chǎn)突變株。最后通過搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，選育出一株遺傳穩(wěn)定的突變株A214，丙酮酸產(chǎn)量達到37.43g/L，比出發(fā)菌株提高了13.69%。因此，以ARTP技術(shù)為代表的新一代高通量誘變篩選技術(shù)能快捷安全高效地獲得目標(biāo)菌株，在高耐性酵母細(xì)胞育種中的應(yīng)用有望逐漸展開。

原生質(zhì)體融合/雜交技術(shù)于20世紀(jì)60年代建立，通過將遺傳性狀不同的兩個細(xì)胞的原生質(zhì)體進行融合/雜交以獲得兼有雙親優(yōu)良遺傳性狀的穩(wěn)定重組子，現(xiàn)已成為一種常用的微生物育種技術(shù)，也是工業(yè)酵母選育的有效途徑之一。韓德權(quán)等[15]對一株耐鹽性魯氏接合酵母的原生質(zhì)體化及再生條件進行了實驗研究，發(fā)現(xiàn)較好的原生質(zhì)體化條件為：在1.5mol/L山梨糖醇、細(xì)胞壁溶解酶Zymolyase20T濃度為0.5mg/mL（10unit/mL）、0.1mol/L磷酸鉀緩沖液（pH6.0）中，30℃處理60min，魯氏酵母原生質(zhì)體化率可達99%以上, 再生率達30%以上?；谧贤饩€及甲基磺酸乙酯誘變和原生質(zhì)體融合技術(shù)，通過NaCl梯度逆境篩選，獲得了具有更高耐鹽性的釀酒酵母S3-4菌株，其耐鹽性由100g/L提高到180g/L，可以有效提高乙酸乙酯、乙醇、乳酸乙酯、乙酸等物質(zhì)的含量[16]。Kim等[17]通過魯氏接合酵母和易變球擬酵母雜交獲得一株能在醬油中產(chǎn)生一些特征性香味化合物的新的雜交種。部分醬油酵母菌種如表1所示。

表1 醬油酵母的選育

2 醬油酵母抗逆機制

作為一種典型的耐性酵母，醬油酵母在細(xì)胞和代謝水平上的耐鹽機制被廣泛研究。Watanabe等[18]總結(jié)了魯氏酵母耐鹽機制主要有：一是合成胞內(nèi)滲透壓調(diào)節(jié)物；二是通過Na+/H+-反向轉(zhuǎn)運蛋白和Na+-ATP酶，維持胞內(nèi)陽離子的動態(tài)平衡。鹽脅迫下，以甘油為主的多元醇和海藻糖被誘導(dǎo)合成作為魯氏酵母抗?jié)B物；細(xì)胞形態(tài)維持結(jié)構(gòu)也發(fā)生變化，細(xì)胞膜麥角固醇的含量和種類發(fā)生改變，細(xì)胞壁變得更薄，細(xì)胞壁幾丁質(zhì)含量下降，脂類組成也發(fā)生變化以降低甘油的滲漏[19-22]。同時，鹽對魯氏酵母的脅迫除表現(xiàn)為胞內(nèi)積累鈉離子脅迫和滲透壓脅迫外，還會產(chǎn)生次級的氧化脅迫，即產(chǎn)生活性氧（ROS）造成氧化損傷[23]。

很多學(xué)者對魯氏酵母耐鹽機理從分子水平進行了研究[24-27]。魯氏酵母耐鹽性是個多基因現(xiàn)象，相關(guān)基因主要有ZrSOD2、ZrSOD22、SAT1、HOG1、ZrATP2、ZrPMA1、ZrNHA1和ENA1/PMR2A等。其中，由ZrSOD2編碼的Na+/H+-反向轉(zhuǎn)運蛋白對魯氏酵母耐鹽性起到非常重要的作用。Iwaki等[24]對ZrSOD2克隆和基因缺失的研究表明，該轉(zhuǎn)運蛋白依賴質(zhì)膜上ATP酶產(chǎn)生的跨膜H+梯度，將細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的Na+外排，實現(xiàn)魯氏酵母在高鹽環(huán)境中的生長。有趣的是，耐鹽魯氏酵母只有一種類型的序列高度相似、不同等位基因的反向轉(zhuǎn)運蛋白基因，如Zr-SOD2、ZrSOD22和ZrSOD2-22，其中，ZrSOD2-22存在于魯氏酵母CBS732T，而ZrSOD2和ZrSOD22存在于魯氏酵母ATCC42981，這兩者都能增強釀酒酵母鹽敏感菌株的耐鹽性，但是只有ZrSOD2能在魯氏酵母中轉(zhuǎn)錄。

相比魯氏酵母，球擬酵母的耐性機制研究較少。Chen等[28]針對莫格球擬酵母從細(xì)胞、代謝和酶水平研究了高鹽耐受機理。結(jié)果表明酵母細(xì)胞發(fā)生了多方面的變化以適應(yīng)高鹽環(huán)鏡，如細(xì)胞壁增厚、細(xì)胞膜飽和度增加、空泡化程度降低、胞內(nèi)生物相容性物濃度上升及PM-ATPase活力提升等。這些變化有利于維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性，降低鈉離子對胞內(nèi)代謝的毒性。徐沙等基于表達譜芯片技術(shù)和二維蛋白電泳等組學(xué)技術(shù)，研究了光滑球擬酵母（Torulopsis glabrata）在不同鹽濃度下的差異。結(jié)果表明高滲會誘導(dǎo)多類基因的表達和蛋白水平提升，特別是細(xì)胞壁和細(xì)胞膜合成相關(guān)基因、中心代謝途徑蛋白和相容性溶質(zhì)氨基酸合成途徑蛋白[29-30]?？梢姡驍M酵母對鹽逆境的響應(yīng)是多方面和多層次的過程。

3 醬油酵母高密度發(fā)酵調(diào)控技術(shù)

現(xiàn)代發(fā)酵工業(yè)中，細(xì)胞密度是影響目標(biāo)產(chǎn)物最終產(chǎn)量的關(guān)鍵因素。高密度的細(xì)胞數(shù)能為發(fā)酵生產(chǎn)代謝物提供大量的合成者。隨著分子生物學(xué)和遺傳工程的崛起，高密度發(fā)酵調(diào)控技術(shù)研究領(lǐng)域從傳統(tǒng)的菌種篩選、培養(yǎng)基篩選與優(yōu)化、發(fā)酵過程控制、補料策略研究向遺傳特性改造、外源蛋白改造等方面擴展。對于食品工業(yè)中的酵母，為保證安全性，通過分子手段改造以達到細(xì)胞高密度生長的方法受到嚴(yán)格限制，因此，發(fā)酵調(diào)控技術(shù)依然是現(xiàn)在的主要手段。高密度發(fā)酵調(diào)控技術(shù)的關(guān)鍵是細(xì)胞代謝流的再分配，即通過過程調(diào)控和補料策略強化細(xì)胞繁殖相關(guān)代謝的通量（圖1）。

圖1 微生物細(xì)胞高密度發(fā)酵調(diào)控

酵母高密度發(fā)酵技術(shù)最初是為了解決釀酒酵母活細(xì)胞數(shù)低的問題，現(xiàn)已取得巨大成功。目前，工廠規(guī)模的釀酒酵母濕重一般為180～200g/L。醬油活性干酵母能有效提升醬油生產(chǎn)效率[31-32]。相比釀酒酵母和畢赤酵母，醬油酵母的高密度發(fā)酵技術(shù)長期得不到足夠的關(guān)注，其活性干酵母的高效生產(chǎn)與制備受到極大的限制，嚴(yán)重影響了其在醬油釀造中的生產(chǎn)應(yīng)用。筆者團隊針對高耐性醬油酵母發(fā)酵強度低的問題，研究了魯氏酵母發(fā)酵培養(yǎng)基，優(yōu)化了10L發(fā)酵罐發(fā)酵參數(shù)，并整合營養(yǎng)條件-過程控制-指數(shù)流加策略，有效控制了代謝副產(chǎn)物的生成并提升了營養(yǎng)物向生物量轉(zhuǎn)化效率，最終建立了高耐受性酵母高密度發(fā)酵過程[33-35]。在搖瓶階段，魯氏酵母活菌數(shù)超過100億，比已報道的文獻[36]提高近10倍；10L機械攪拌通風(fēng)發(fā)酵罐，最大生物量超過70g/L（干重）[35]。更重要的是，該酵母的耐鹽能力在高密度繁殖后沒有降低，為大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用奠定了良好的基礎(chǔ)。

4 展 望

隨著人們生活質(zhì)量的提高，傳統(tǒng)釀造食品正處于技術(shù)升級的新階段。優(yōu)良的耐逆境酵母菌株能有效提升醬油生產(chǎn)效率和產(chǎn)品品質(zhì)及風(fēng)味，高耐性酵母的高密度發(fā)酵技術(shù)是體現(xiàn)經(jīng)濟效益和工作效率的關(guān)鍵。因此，基于新技術(shù)誘變篩選高品質(zhì)醬油酵母及其高密度細(xì)胞發(fā)酵技術(shù)將為釀造食品的升級換代提供堅實的基礎(chǔ)。

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Breeding and high density fermentation control research of high tolerance soy sauce yeast

CHEN Xiong，LI Xin，WANG Zhi，DAI Jun

Key Laboratory of Fermentation Engineering (Education Ministry), Hubei Collaborative Innovation Center for Industrial Fermentation, Bioengineering and Food Science College, Hubei University of Technology, Wuhan 430068, China

High tolerance yeast is widely used in many industries, especially in food, brewing, feed, and bio-energy f eld. The tolerance capability of yeast has a decisive inf uence on its production and application. The improvement of yeast strains is the key step in the utilization of yeast resources, and high density fermentation technology is the main bottle-neck for the yeast industrialization. In this paper, the breeding, tolerance mechanism, and high density fermentation of the halophilic yeast strains used in the traditional brewing food soy sauce are reviewed.

soy sauce yeast; breeding; resistant mechanism; high density fermentation

10.3969/j.issn.1674-0319.2017.01.011

湖北省自然科學(xué)基金重點項目（2012FFA058）