微生物代謝工程的研究進(jìn)展和展望

顧洋，李江華，堵國成，2，陳堅，2，劉龍，2

1.江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，無錫 214122

2.江南大學(xué)糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點實驗室，無錫 214122

微生物代謝工程的研究進(jìn)展和展望

顧洋1，李江華1，堵國成1，2，陳堅1，2，劉龍1，2

1.江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，無錫 214122

2.江南大學(xué)糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點實驗室，無錫 214122

劉龍，江南大學(xué)生物工程學(xué)院教授，博士生導(dǎo)師，國家優(yōu)秀青年科學(xué)基金獲得者。主要從事利用系統(tǒng)與合成生物技術(shù)構(gòu)建微生物細(xì)胞工廠高效合成功能營養(yǎng)品的應(yīng)用基礎(chǔ)研究。主持國家“863”項目、“973”子課題、國家自然科學(xué)基金等國家和省部級課題10項；以第一作者或通訊作者在《Nature Communications》、《Biotechnology Advances》、《Metabolic Engineering》、《Biotechnology and Bioengineering》等工業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域權(quán)威期刊發(fā)表SCI論文60余篇；出版著作和教材3部；獲25項中國授權(quán)發(fā)明專利和2項美國授權(quán)發(fā)明專利。獲聘任英文期刊《Scientific Reports》和《Frontiers in Bioengineering and Biotechnology》的編委。2014年獲評江蘇省“青藍(lán)工程”優(yōu)秀青年骨干教師，2015年入選江蘇省“六大人才高峰”高層次人才支持計劃，2016年被評為江蘇省教育工作先進(jìn)個人。獲國家技術(shù)發(fā)明二等獎(2015)、霍英東教育基金會青年教師獎三等獎(2016)、中國輕工業(yè)聯(lián)合會技術(shù)發(fā)明一等獎(2013)以及國際學(xué)術(shù)獎勵1項(IFIBiop優(yōu)秀青年科學(xué)家獎)。E-mail: longliu@jiangnan.edu.cn

代謝工程技術(shù)是構(gòu)建微生物細(xì)胞工廠的重要方法，其主要目標(biāo)是通過基因工程等手段將目標(biāo)代謝產(chǎn)物產(chǎn)量最大化。然而基因工程等操作往往會影響細(xì)胞生長速率，導(dǎo)致其生產(chǎn)強度降低。隨著合成生物學(xué)及相關(guān)技術(shù)的發(fā)展，多種調(diào)控策略被應(yīng)用于代謝工程領(lǐng)域以解決上述問題。通過這些調(diào)控可以有效地解決細(xì)胞生長與產(chǎn)物合成之間的競爭關(guān)系，平衡代謝途徑，避免中間代謝產(chǎn)物的過量積累。對這些策略的研究及應(yīng)用進(jìn)行了概述和展望。

代謝工程；動態(tài)調(diào)控；合成生物學(xué)；發(fā)酵

微生物發(fā)酵生產(chǎn)具有可持續(xù)、綠色環(huán)保等特點，隨著傳統(tǒng)石油資源的日益枯竭，微生物發(fā)酵生產(chǎn)將是替代傳統(tǒng)石油化工的重要技術(shù)手段[1-3]。作為細(xì)胞工廠，微生物已被用于多種同源及異源代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)，包括發(fā)酵型產(chǎn)物、氨基酸以及眾多次級代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)[4-5]。從經(jīng)濟(jì)角度考慮，微生物發(fā)酵生產(chǎn)大宗化學(xué)品和生物燃料應(yīng)具有高轉(zhuǎn)化率、高生產(chǎn)強度、高得率的特點[6]。

代謝工程技術(shù)作為構(gòu)建微生物細(xì)胞工廠的重要方法，已經(jīng)被成功應(yīng)用于多種生物基產(chǎn)品的工業(yè)化生產(chǎn)，如青蒿素、N-乙酰氨基葡萄糖、黃銅類化合物等。傳統(tǒng)代謝工程優(yōu)化細(xì)胞生產(chǎn)性能時，通常是經(jīng)過一輪工程改造后，驗證并鑒定限速步驟，然后進(jìn)行下一輪代謝改造，消除新的限速步驟，提高細(xì)胞生產(chǎn)能力，之后再鑒定限速步驟，再進(jìn)行代謝改造[7-8]。通常情況下，研究者會對關(guān)鍵代謝節(jié)點的基因進(jìn)行過量表達(dá)，以期獲得較高的轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)量。然而實際上，并不是所有的代謝改造都能達(dá)到提高目的產(chǎn)物的效果，因為過表達(dá)的合成途徑會與宿主自身的代謝途徑競爭共同的資源和能量，嚴(yán)重時會導(dǎo)致細(xì)胞進(jìn)入應(yīng)急狀態(tài)，使得胞內(nèi)代謝流量產(chǎn)生不平衡，造成中間代謝產(chǎn)物的大量積累，最終抑制胞內(nèi)代謝活動，降低菌體的生理活性和發(fā)酵性能。代謝工程操作常常會影響細(xì)胞生長，降低其生長速率，甚至還會形成生長速率極慢的“病態(tài)”菌株[9]。此外，蛋白質(zhì)、維生素、能源化合物及藥物的微生物發(fā)酵合成，常常需要在宿主細(xì)胞中表達(dá)多個異源代謝途徑，增加菌體的代謝負(fù)擔(dān)。所以工程菌株，通常會存在下列問題：①代謝途徑不平衡造成中間代謝積累，降低產(chǎn)物得率；②細(xì)胞生長與產(chǎn)物合成途徑競爭共同底物，影響產(chǎn)物得率和生產(chǎn)強度；③產(chǎn)物合成途徑影響細(xì)胞正常代謝，導(dǎo)致限速步驟產(chǎn)生，抑制生物合成；④有毒代謝物的產(chǎn)生，抑制菌體生長。

為了解決上述問題，多種新的策略與工具被應(yīng)用于代謝工程領(lǐng)域，如代謝進(jìn)化（metabolic evolution）、支架結(jié)構(gòu)平衡代謝工程、模塊途徑工程、系統(tǒng)代謝工程以及代謝工程的動態(tài)調(diào)控策略。隨著合成生物學(xué)的發(fā)展，通過合成生物學(xué)理念設(shè)計新的生物元件和裝置，可以有效地、簡便地實現(xiàn)對大規(guī)模生物途徑的構(gòu)建。

1 代謝進(jìn)化

代謝進(jìn)化是通過對微生物進(jìn)行馴化培養(yǎng)，以獲得提高生長速率、產(chǎn)量、轉(zhuǎn)化率和生產(chǎn)強度的菌體[10]。該策略的具體方法是：首先通過代謝改造，阻斷副產(chǎn)物的合成，提高生產(chǎn)菌株的目的代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率，使目的代謝產(chǎn)物合成途徑成為消耗還原力（NADH）的主要途徑，然后在反應(yīng)器中進(jìn)行連續(xù)傳代培養(yǎng)，篩選出生長速率較快的突變株。因為細(xì)胞在利用底物生長的過程中會產(chǎn)生能量（ATP）和還原力，由于副產(chǎn)物合成途徑已經(jīng)被阻斷，細(xì)胞只能通過合成目的代謝產(chǎn)物才能平衡胞內(nèi)還原力（NADH）的水平，所以此類細(xì)胞會將能量代謝和還原力代謝偶聯(lián)，在提高菌體生長性能的同時也能提高發(fā)酵性能。Ingram等[11]在代謝改造發(fā)酵生產(chǎn)D-乳酸的研究中，就是利用該策略成功篩選出生長較好的高性能突變株。該菌在含有10%葡萄糖的LB培養(yǎng)基中能更高效地合成乳酸，其產(chǎn)量比代謝進(jìn)化之前提高13%，生產(chǎn)強度提高73%。同時，該課題組也利用該策略改善了L-乳酸、L-丙氨酸、乙醇代謝工程菌的發(fā)酵性能[11-13]。

2 基于支架結(jié)構(gòu)的合成代謝途徑

基于支架結(jié)構(gòu)的合成代謝途徑是通過將合成途徑中的酶固定于特定支架結(jié)構(gòu)上，使得途徑酶可以在空間距離上靠近，從而提高途徑酶間的催化效率[14-16]。同時，可以通過調(diào)整酶之間的距離和比例進(jìn)一步調(diào)控合成途徑的相對活性，達(dá)到平衡胞內(nèi)代謝的目的，避免中間代謝產(chǎn)物的過量積累[13，17]。目前已經(jīng)建立的支架結(jié)構(gòu)有蛋白支架、RNA支架以及DNA支架[18]。Keasling等[14]設(shè)計出一種特殊的蛋白支架用于固定甲羥戊酸合成途徑中3個關(guān)鍵酶，并優(yōu)化了催化效率。該策略成功地將甲羥戊酸的產(chǎn)量提高了77倍，避免了胞內(nèi)中間代謝物的過量積累，有效緩解了細(xì)胞代謝負(fù)擔(dān)。該團(tuán)隊還將同樣的蛋白支架應(yīng)用到葡萄糖二酸的生產(chǎn)中，改造后的工程菌葡萄糖二酸的產(chǎn)量提高了3倍，有效證明了支架結(jié)構(gòu)工具的有效性。Delebecque等[15]研究表明通過RNA支架可以更高效地實現(xiàn)途徑酶之間的調(diào)控。支架結(jié)構(gòu)可以有效降低途徑酶之間的空間位阻，提升酶的催化效率，被證明是一種調(diào)控代謝途徑及提高菌體生產(chǎn)性能的十分有效的方法。Conrado等[16]使用質(zhì)粒構(gòu)建DNA支架，并將這一方法應(yīng)用于不同代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)，如甲羥戊酸、白藜蘆醇、1,2-丙二醇。其研究結(jié)果表明使用DNA支架也能有效增加代謝產(chǎn)物產(chǎn)量，提高細(xì)胞生產(chǎn)性能。

3 模塊途徑工程

傳統(tǒng)代謝工程通常是進(jìn)行代謝改造，然后鑒定限速步驟，再進(jìn)行代謝改造[7-8]。但往往一個限制性因素剛被解決，新的代謝瓶頸又會出現(xiàn)。在這樣的背景下，模塊工程策略被提出用于代謝網(wǎng)絡(luò)的全局優(yōu)化。研究者將胞內(nèi)的代謝途徑絡(luò)分成不同模塊，然后利用調(diào)控元件構(gòu)建不同活性模塊，再將不同活性模塊組裝進(jìn)代謝網(wǎng)絡(luò)[18-20]。最后通過調(diào)整模塊間的活性，得到代謝模塊相對活性平衡的最優(yōu)重組菌[21-22]。具體方法是通過對模塊中關(guān)鍵基因的拷貝數(shù)和啟動子進(jìn)行優(yōu)化，達(dá)到對整個模塊的調(diào)整。Liu等[23]利用該技術(shù)優(yōu)化了枯草芽孢桿菌生產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc），他們將枯草芽孢桿菌胞內(nèi)代謝途徑分為3個模塊，分別為GlcNAc合成模塊、糖酵解模塊和肽聚糖合成模塊。該研究小組首先優(yōu)化了GlcNAc合成途徑中關(guān)鍵酶GlmS和Gna1的啟動子，敲除了乙酸和乳酸合成相關(guān)的基因ldh、pta，阻斷了副產(chǎn)物的產(chǎn)生，得到活性較強的GlcNAc合成模塊；之后，通過sRNA與Hfq蛋白的組合，調(diào)控6-磷酸果糖激酶（Pfk）和1-磷酸氨基葡萄糖變位酶（GlmM）的表達(dá)水平，獲得不同活性的糖酵解模塊和肽聚糖合成模塊；最后將不同活性強度的3個模塊進(jìn)行組合組裝，篩選活性相對平衡的最優(yōu)重組菌，成功地提高了GlcNAc的產(chǎn)量。通過模塊途徑工程改造后單位菌體的最高GlcNAc產(chǎn)率達(dá)到2.0g/g，是改造前的4.3倍。Wu等[24]利用模塊化策略優(yōu)化黃酮骨架化合物的從頭合成途徑，通過4個不同拷貝數(shù)的質(zhì)粒來改變模塊的代謝通量，優(yōu)化代謝網(wǎng)絡(luò)。生松素和柚皮素的產(chǎn)量分別達(dá)到40mg/L和50.2mg/L。然而，研究者發(fā)現(xiàn)芳香族氨基酸到黃酮骨架物質(zhì)的合成途徑是整個合成途徑的瓶頸，因此再次引入模塊優(yōu)化策略對該步驟進(jìn)行精細(xì)改造。最終生松素和柚皮素的產(chǎn)量分別提高至84.2mg/L和105.1mg/L[25]。

4 系統(tǒng)代謝工程

系統(tǒng)代謝工程是將組學(xué)分析技術(shù)與傳統(tǒng)代謝工程及下游工程技術(shù)相結(jié)合，主要過程為：①進(jìn)行局部代謝改造，構(gòu)建起始工程菌株；②進(jìn)行組水平系統(tǒng)分析和計算模擬代謝分析，獲得下一步代謝改造靶點；③系統(tǒng)分析重組代謝網(wǎng)絡(luò)，揭示產(chǎn)物合成的限制性因素；④進(jìn)行工業(yè)水平發(fā)酵過程優(yōu)化，進(jìn)一步提高菌體性能。Lee等[26]在改造大腸桿菌生產(chǎn)纈氨酸時，利用基因工程手段首先去除了胞內(nèi)纈氨酸的反饋抑制、轉(zhuǎn)錄消除效應(yīng)以及纈氨酸的競爭代謝途徑，并過表達(dá)了合成途徑關(guān)鍵基因，獲得一株轉(zhuǎn)化率達(dá)到0.66g/g葡萄糖的工程菌株；然后通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)的分析，找出其他能夠促進(jìn)纈氨酸合成的基因，強化這些基因的表達(dá)，重組大腸桿菌的轉(zhuǎn)化率提高了一倍；之后通過代謝網(wǎng)絡(luò)模型的分析，又獲得了改造靶點，刪除這些基因后，轉(zhuǎn)化率達(dá)到0.378g/g葡萄糖。Park等[27]首先通過隨機(jī)誘變技術(shù)獲得一株高產(chǎn)精氨酸的突變株，并對突變株進(jìn)行基因組測序，找出突變位點，驗證突變位點對精氨酸合成的影響；然后通過系統(tǒng)代謝工程進(jìn)一步提高菌體的生產(chǎn)性能，具體方法包括去除負(fù)向調(diào)控因子、優(yōu)化胞內(nèi)的NADPH水平、增加合成前體、強化限速 步驟。最終發(fā)酵罐精氨酸產(chǎn)量達(dá)到81.2g/L，轉(zhuǎn)化率為0.35g/g（葡萄糖和蔗糖），達(dá)到精氨酸工業(yè)化生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)。

5 動態(tài)調(diào)控策略

動態(tài)調(diào)控指是通過某些策略和方法可以實現(xiàn)動態(tài)的調(diào)控或者改變胞內(nèi)代謝流流向（圖1）[9，28，29]。Mahadevan等[28]于2008年首先提出動態(tài)代謝工程（dynamic metabolic engineering）的概念。動態(tài)調(diào)控主要包括過程水平的兩階段調(diào)控、基因水平的兩階段調(diào)控、基因水平的持續(xù)調(diào)控[9]?；蛩降某掷m(xù)動態(tài)調(diào)控系統(tǒng)應(yīng)具有可以監(jiān)測胞內(nèi)某種信號的感應(yīng)元件，并且可以有效地根據(jù)信號信息的變化調(diào)控基因的表達(dá)[30-31]?；蛩降膭討B(tài)調(diào)控系統(tǒng)中最理想的調(diào)控元件是一些轉(zhuǎn)錄因子，這類轉(zhuǎn)錄因子能夠根據(jù)胞內(nèi)代謝物的變化精確地調(diào)控相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)[9，32]。然而大部分的調(diào)控元件會受到菌體自身調(diào)節(jié)機(jī)制的限制無法應(yīng)用于動態(tài)調(diào)控，與此同時細(xì)胞內(nèi)很多代謝途徑和代謝產(chǎn)物的調(diào)控機(jī)制還未完全解析，因此使得代謝途徑的動態(tài)調(diào)控的實現(xiàn)變得異常困難[9，31，33]。特別是異源表達(dá)的合成途徑，由于這類合成途徑及代謝產(chǎn)物往往在宿主中缺乏調(diào)控機(jī)制，容易造成中間代謝物的積累，導(dǎo)致限速步驟產(chǎn)生，抑制產(chǎn)物的合成[34]。近年來，微生物發(fā)酵動態(tài)調(diào)控策略受到眾多研究者的關(guān) 注，越來越多的調(diào)控元件被發(fā)現(xiàn)并應(yīng)用。

5.1 過程水平的兩階段調(diào)控

微生物發(fā)酵過程中最常見的動態(tài)調(diào)控的策略就是過程水平的兩階段調(diào)控，該調(diào)控策略可以實現(xiàn)將菌體生長與產(chǎn)物合成階段簡單的分開，使得細(xì)胞能夠在生長階段快速并大量的積累，之后改變發(fā)酵條件迫使細(xì)胞進(jìn)入到產(chǎn)物合成階段。該調(diào)控策略已成功應(yīng)用于乳酸的生產(chǎn)，菌體在有氧的條件下迅速生長，菌體生長完成后進(jìn)入?yún)捬醢l(fā)酵狀態(tài)，開始大量合成乳酸。兩階段發(fā)酵生產(chǎn)乳酸與傳統(tǒng)完全厭氧發(fā)酵相比優(yōu)勢更加明顯，生產(chǎn)強度達(dá)到3.32g/（L·h），是傳統(tǒng)厭氧發(fā)酵的10倍[11，35]。目前該策略也被應(yīng)用于1,4-丁二醇的微生物發(fā)酵。另外pH也常被用于過程水平的兩階段調(diào)控，如酮戊二酸、丙酮酸的生產(chǎn)[36]。張等[37]在發(fā)酵生產(chǎn)α-酮戊二酸時，通過控制初期pH為6.0、菌體生長至10g/L后，讓pH自然降至3.0，并保持到發(fā)酵結(jié)束。α-酮戊二酸的產(chǎn)量達(dá)到54.0g/L，產(chǎn)量和生產(chǎn)強度分別比控制pH為6.0時提高了19.3%和17.8%。過程水平的兩階段發(fā)酵也常應(yīng)用于蛋白和酶制劑的微生物發(fā)酵。通常情況下，蛋白的合成會與菌體生長競爭共同底物，進(jìn)而抑制菌體生長。因此在微生物發(fā)酵生產(chǎn)蛋白和酶制劑時需要先讓菌體生長起來，然后通過添加誘導(dǎo)物（IPTG等）誘導(dǎo)相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)入蛋白合成階段[38]。然而過程水平的兩階段調(diào)控因其應(yīng)用條件的局限性和昂貴的誘導(dǎo)物也限制了該策略的廣泛應(yīng)用。

圖1 微生物動態(tài)調(diào)控策略

5.2 基因水平的兩階段調(diào)控

近年來，單一的基因開關(guān)以及由多個基因開關(guān)相互關(guān)聯(lián)組成的復(fù)雜的基因開關(guān)已被用來調(diào)控代謝途徑和研究細(xì)胞內(nèi)代謝調(diào)控[39]。Zhou等[40]將重組大腸桿菌的染色體上ldhA（乳酸脫氫酶基因）的原始啟動子（ldhAp）替換成γ噬菌體的溫敏型啟動子Pr和PL（圖2a），通過調(diào)控發(fā)酵培養(yǎng)條件控制乳酸脫氫酶基因的表達(dá)水平，實現(xiàn)了動態(tài)、高效的調(diào)控重組大腸桿菌乳酸合成與菌體量的積累，將好氧菌體轉(zhuǎn)化率提高了9%，發(fā)酵階段體積生產(chǎn)強度提高了51%，乳酸比合成速率提高了46%，化學(xué)純度提高到98.6%，有效解決了菌體生長與產(chǎn)物合成之間的代謝與調(diào)控的矛盾。Williams等[30]在釀酒酵母中通過使用RNA干擾（RNAi）調(diào)控生長必須基因ARO7的表達(dá)實現(xiàn)了對羥基苯甲酸合成途徑的兩階段調(diào)控（圖2b）。在菌體處于生長階段時，對羥基苯甲酸合成途徑相關(guān)基因被抑制，菌體可以迅速的大量生成，當(dāng)菌體積累一定量后RNA干擾特異的關(guān)閉基因ARO7的表達(dá)，菌體進(jìn)入對羥基苯甲酸合成階段。Soma等[41]在大腸桿菌發(fā)酵法生產(chǎn)異丙醇的研究中（圖2c），構(gòu)建了可以控制菌體生長和產(chǎn)物合成基因表達(dá)的轉(zhuǎn)換器（inverter）開關(guān)，菌體生長完成后向培養(yǎng)體系中添加IPTG，抑制菌體生長相關(guān)基因，迫使代謝流流向產(chǎn)物合成途徑，實現(xiàn)了大腸桿菌生產(chǎn)異丙醇的兩階段發(fā)酵，有效提高了異丙醇的產(chǎn)量。

5.3 基因水平的持續(xù)調(diào)控

微生物發(fā)酵培養(yǎng)時，細(xì)胞所處的環(huán)境是不斷變化的，通過簡單的兩階段調(diào)控（過程水平和基因水平）并不能真正意義上地解決菌體生長和合成途徑競爭的關(guān)系。在此背景下，研究者提出了持續(xù)調(diào)控的策略，通過設(shè)計感應(yīng)元件動態(tài)檢測細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的變化，并能根據(jù)信號反饋即時地調(diào)控細(xì)胞代謝活動。Koffas等[33]構(gòu)建了能夠識別胞內(nèi)丙二酸單酰輔酶A水平的生物開關(guān)，根據(jù)細(xì)胞本身的狀態(tài)，細(xì)胞自身能夠決定哪些基因需要激活或者抑制（圖2d）。當(dāng)細(xì)胞感知到胞內(nèi)的丙二酸單酰輔酶A水平較低時，就會增加合成丙二酸單酰輔酶A的基因的表達(dá)。相反，當(dāng)細(xì)胞感知到丙二酸單酰輔酶A水平較高時，就會促進(jìn)合成脂肪酸合酶，從而消耗積累的丙二酸單酰輔酶A。其生物開關(guān)主要是基于兩個轉(zhuǎn)錄調(diào)控的啟動子，這兩個啟動子對細(xì)胞內(nèi)的丙二酸單酰輔酶A表現(xiàn)出相反的轉(zhuǎn)錄活性，當(dāng)胞內(nèi)丙二酸單酰輔酶A積累時，其中一個啟動子能夠關(guān)閉丙二酸單酰輔酶A的合成途徑，當(dāng)胞內(nèi)丙二酸單酰輔酶A較少時，另一個啟動子能夠打開丙二酸單酰輔酶A的合成途徑。這一動態(tài)調(diào)控策略優(yōu)化了丙二酸單酰輔酶A的生物合成，克服了自然界中微生物不能過量合成脂肪酸的瓶頸。Dahl等[42]通過增加胞內(nèi)合成途徑的中間代謝產(chǎn)物的濃度對菌體施加壓力，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)，通過DNA芯片技術(shù)，對微生物細(xì)胞內(nèi)的mRNA進(jìn)行分析，比較原始菌和被施加壓力菌的轉(zhuǎn)錄組，鑒定出變化顯著的基因，找出相應(yīng)的啟動子并構(gòu)建相應(yīng)的啟動子文庫，利用這些啟動子調(diào)控細(xì)胞代謝和目的產(chǎn)物的合成。Mahadevan等[28]通過將群體感應(yīng)系統(tǒng)（quorum-sensing system）與雙穩(wěn)態(tài)開關(guān)進(jìn)行組合并整合至細(xì)胞的基因組上，使得細(xì)胞自身能夠感應(yīng)反應(yīng)器中細(xì)胞密度，并自動調(diào)控pta（與生長相關(guān)且是副產(chǎn)物的編碼基因）基因的表達(dá)。在生長階段，pta能夠正常表達(dá)，菌體可以快速生長；當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到一定程度后，菌體會自動關(guān)閉pta基因的表達(dá)，進(jìn)入產(chǎn)物合成階段從而提高代謝產(chǎn)物乙醇和琥珀酸的產(chǎn)量和生產(chǎn)強度。

圖2 動態(tài)代謝工程

5.4 動態(tài)調(diào)控策略的問題

持續(xù)動態(tài)調(diào)控策略雖然能夠很有效地提高微生物發(fā)酵的生產(chǎn)強度和效率，但是由于調(diào)控元件的特異性，這類元件很難應(yīng)用于其他產(chǎn)品中，因此針對特定的化合物研究者還需要花費大量時間和精力去開發(fā)、尋找新的調(diào)控元件[9，29，40，42]。同時，由于合成生物學(xué)技術(shù)的限制，動態(tài)代謝工程尚存在諸多待改進(jìn)的地方：①部分動態(tài)調(diào)控策略使用的基因開關(guān)的起始需要添加誘導(dǎo)劑或者改變培養(yǎng)條件，增加調(diào)控系統(tǒng)的不穩(wěn)定性；②眾多的調(diào)控系統(tǒng)還建立于質(zhì)粒水平，相對來說質(zhì)粒的遺傳穩(wěn)定性較差，容易丟失；③在細(xì)胞中構(gòu)建群體感應(yīng)調(diào)控系統(tǒng)，一般需要合成額外的信號物質(zhì)，增加了菌體的負(fù)擔(dān)；④部分特殊代謝途徑的關(guān)閉需要消耗特定的生物大分子，導(dǎo)致代謝途徑不能被及時調(diào)控；⑤基因水平的動態(tài)調(diào)控，雖然可以在很短時間內(nèi)關(guān)閉相關(guān)基因的表達(dá)，但已存在的酶和蛋白往往需要幾個小時或者更長的時間才會失活。因此，動態(tài)調(diào)控策略還有待繼續(xù)完善，需要綜合考慮轉(zhuǎn)錄水平、翻譯水平和翻譯后水平。近年來，動態(tài)調(diào)控受到越來越多研究者的關(guān)注。目前，過程水平的兩階段調(diào)控已廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。

6 展 望

代謝反應(yīng)速率受到很多因素的影響，包括中間代謝物的濃度、途徑酶表達(dá)的水平、酶的催化能力等。目前代謝工程的研究主要都集中于控制不同途徑酶的表達(dá)水平來平衡各個代謝途徑，比如模塊代謝工程。然而很少研究途徑酶自身的性質(zhì)，如與底物的結(jié)合能力等，往往這些不確定的因素就導(dǎo)致了限速步驟的產(chǎn)生。因此，系統(tǒng)地將酶工程和代謝工程相結(jié)合，將有利于突破產(chǎn)物合成途徑的瓶頸。

隨著合成生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，新的基因編輯工具的陸續(xù)出現(xiàn)，給研究者提供了更多的方法來系統(tǒng)探究細(xì)胞基因組綜合改造或者遺傳上的重新編碼對微生物發(fā)酵或者生產(chǎn)能力的影響。如在真核細(xì)胞內(nèi)，RNA干擾技術(shù)已經(jīng)發(fā)展成為一種便捷有效的調(diào)節(jié)基因表達(dá)的工具；在原核細(xì)胞內(nèi)，反義RNA技術(shù)、小RNA調(diào)控技術(shù)、CRISPR技術(shù)等也提供了有效的基因編輯工具，促進(jìn)了胞內(nèi)代謝網(wǎng)絡(luò)及調(diào)控機(jī)制的解析。隨著新的調(diào)控機(jī)制的闡明和調(diào)控元件的開發(fā)，動態(tài)代謝工程將會成為構(gòu)建微生物細(xì)胞工廠和代謝調(diào)控的重要方法。

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Progress and prospect in microbial metabolic engineering

GU Yang1，LI Jianghua1，DU Guocheng1，2，CHEN Jian1，2，LIU Long1，2

1. Jiangnan University, Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, Wuxi 214122, China
2. Key Laboratory of Carbohydrate Chemistry and Biotechnology, Ministry of Education, Wuxi 214122, China

Metabolic engineering has been proven crucial for the construction of microbial cell factories. The main objective of metabolic engineering is to increase the titer, yield and productivity of target chemicals through genetic engineering. However, genetic manipulations usually result in lower productivity due to growth impairment. With the development of tools in synthetic biology, there has been increasing interest in the dynamic regulation of metabolic f ux to overcome the issues. Some metabolic engineering strategies allow trade-offs between growth and production to be better managed and can help avoid build-up of undesired intermediates. This paper summarizes the recent progress in the metabolic engineering and also prospects the future trends in this f eld.

metabolic engineering; metabolic control; synthetic biology; fermentation

10.3969/j.issn.1674-0319.2017.01.010

顧洋，博士研究生。研究方向：代謝工程。

E-mail：857597623@qq.com

國家優(yōu)秀青年基金（31622001），自然基金面上項目（31671845）