重離子束輻照在優(yōu)良工業(yè)微生物新菌株創(chuàng)建中的應(yīng)用實(shí)踐

陳積紅，胡偉，李文建

中國(guó)科學(xué)院近代物理研究所，蘭州 730000

重離子束輻照在優(yōu)良工業(yè)微生物新菌株創(chuàng)建中的應(yīng)用實(shí)踐

陳積紅，胡偉，李文建

中國(guó)科學(xué)院近代物理研究所，蘭州 730000

陳積紅，中國(guó)科學(xué)院近代物理研究所正研級(jí)高級(jí)工程師，碩士生導(dǎo)師，主要從事重離子束輻射生物學(xué)以及高附加值甜高粱生物產(chǎn)品的應(yīng)用基礎(chǔ)研究。主持包括科技部農(nóng)業(yè)成果轉(zhuǎn)化項(xiàng)目，中國(guó)科學(xué)院科技支甘工程項(xiàng)目，中國(guó)科學(xué)院STS項(xiàng)目子課題，以及企業(yè)委托項(xiàng)目等在內(nèi)的國(guó)家和省部級(jí)課題8項(xiàng)；以第一作者或通訊作者在國(guó)內(nèi)外期刊發(fā)表20余篇論文，其中SCI論文6篇；完成了2項(xiàng)科技成果轉(zhuǎn)化應(yīng)用；取得省部級(jí)科技進(jìn)步獎(jiǎng)2項(xiàng)。E-mail：chjh@impcas.ac.cn

性能優(yōu)良的工業(yè)微生物菌種是企業(yè)保持競(jìng)爭(zhēng)力的重要保障，因此培育優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)的微生物新菌種依舊是生物育種產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新發(fā)展的核心內(nèi)容之一。重離子束輻照作為一種高效的誘變手段，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于我國(guó)工業(yè)微生物育種實(shí)踐中。重點(diǎn)回顧了重離子束輻照誘導(dǎo)生物體DNA突變的分子機(jī)制研究以及重離子束微生物育種的研究進(jìn)展。同時(shí)，也展望了我國(guó)重離子束育種專用裝置的產(chǎn)業(yè)化前景。

重離子束；工業(yè)微生物；育種

1 重離子束輻照微生物育種的技術(shù)優(yōu)勢(shì)

工業(yè)微生物與現(xiàn)代生物釀造工業(yè)、生物化工工業(yè)以及食品工業(yè)等行業(yè)的關(guān)系極為密切[1]。常用的物理誘變手段，如X射線誘變、紫外線誘變、激光誘變、快中子誘變等，已經(jīng)在微生物育種領(lǐng)域占據(jù)越來(lái)越重要的位置[2]，但傳統(tǒng)物理誘變育種手段存在的缺點(diǎn)也隨之顯現(xiàn)，如突變率低、突變譜窄或突變表型不穩(wěn)定等。因此，開發(fā)高效的誘變?cè)矗岣呶⑸锿蛔兟?，擴(kuò)大突變譜，已成為育種工作者要解決的首要問題。

近年來(lái)，隨著物理學(xué)科與生命學(xué)科相互交叉和滲透，一些高效的新型物理誘變手段相繼涌現(xiàn)，例如重離子束輻照誘變和ARTP等離子體誘變等，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于工業(yè)微生物的育種實(shí)踐（黑曲霉[3]、微藻[4]以及阿維鏈霉菌[5]等），并表現(xiàn)出極大的育種優(yōu)越性。

重離子束即剝離或部分剝離原子序數(shù)大于2的原子核外圍電子形成具有能量的帶電離子束[6]，按照輻射類別和電離方式來(lái)分，重離子束屬于粒子輻射和直接電離輻射的范疇。為了區(qū)別其他學(xué)科中正電荷離子，通常采用“束”對(duì)其界定。重離子束與常用的物理誘變手段相比，如X射線誘變、γ射線誘變和快中子誘變等，在物理學(xué)效應(yīng)和生物學(xué)效應(yīng)上表現(xiàn)出很大的不同，也與帶負(fù)電荷、質(zhì)量很輕的電子束差別很大。重離子束在穿越介質(zhì)過(guò)程中，具有較高的LET，在其離子穿透徑跡上有較大的能量沉積，屬致密電離輻射，能夠誘發(fā)更多的生物損傷。因此，相同劑量輻照情況下，重離子束與低LET的誘變手段相比（如X射線誘變、γ射線誘變和快中子誘變等），具有更高的相對(duì)生物學(xué)效應(yīng)（relative biological effectiveness，RBE）。重離子束在能量沉積過(guò)程中，其射程末端存在一個(gè)尖銳的能量損失峰，即Bragg峰（圖1）。在峰值范圍內(nèi)，注入離子與生物體的相互作用是局部的、多重的和不易修復(fù)的。因此，重離子束用于誘變育種時(shí)可能在輕損傷的情況下獲得較高的突變率[7-11]。簡(jiǎn)而言之，重離子束輻照穿透誘變是一種具有能量沉積、動(dòng)量傳遞、質(zhì)量沉積和電荷交換聯(lián)合作用的誘變?cè)?，相?dāng)于一種復(fù)合誘變?cè)?，使該技術(shù)比其他誘變方法產(chǎn)生更為廣泛的誘變圖譜。

圖1 80MeV/u的12C6+離子束在水中的相對(duì)劑量分布

2 重離子束加速器裝置的國(guó)內(nèi)外分布

重離子束的產(chǎn)生方式主要有兩種：一是在宇宙空間中存在的帶電粒子束；二是通過(guò)地面重離子加速器裝置將原子部分或全部外圍電子的帶電原子核剝離，這也是獲得重離子束的最重要手段。至今為止，世界范圍內(nèi)僅有幾家重離子加速器裝置，主要分布在中國(guó)（中國(guó)科學(xué)院近代物理研究所）、日本（NIRS、RIKEN）、德國(guó)（GSI）、美國(guó)（LBL）、法國(guó)（GANIL）、意大利（LNS）等。

中國(guó)科學(xué)院近代物理研究所（IMP）創(chuàng)建于1957年，是國(guó)內(nèi)最大的重離子物理研究中心，現(xiàn)已發(fā)展成為一家以重離子物理及其相關(guān)交叉學(xué)科為主要研究方向、相應(yīng)發(fā)展粒子加速器和核技術(shù)的基地型研究所。由中國(guó)科學(xué)院近代物理所負(fù)責(zé)設(shè)計(jì)建造的國(guó)家“九五”重大科學(xué)工程——蘭州重離子加速器冷卻儲(chǔ)存環(huán)（HIRFL-CSR）于2008年7月通過(guò)國(guó)家驗(yàn)收。HIRFL-CSR是我國(guó)目前規(guī)模最大、加速離子種類最多、能量最高、束流品質(zhì)最好的重離子加速器系統(tǒng)。目前，蘭州重離子加速器國(guó)家實(shí)驗(yàn)室能加速多種重離子種類，如16O6+、12C6+、20Ne10+、36Ar18+、40Ca12+、129Xe27+等，其中12C6+離子束主要被用于微生物育種和植物育種，它主要是由分離扇回旋加速器（SSC，K=450）加速出來(lái)，能量范圍約80～1000MeV/u[12]。

3 重離子束誘導(dǎo)生物體DNA突變的分子機(jī)制研究

近年來(lái)，重離子束輻照微生物和植物育種已經(jīng)為生物發(fā)酵產(chǎn)業(yè)和農(nóng)業(yè)做出了巨大貢獻(xiàn)，產(chǎn)生了極大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。重離子束誘導(dǎo)生物體突變的分子機(jī)制研究更是引起了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注，也是進(jìn)一步指導(dǎo)重離子束誘變育種的關(guān)鍵控制點(diǎn)。例如，Shikazono等[13]利用220 MeV/u的碳離子束輻照擬南芥（ecotype Columbia），獲得了兩株擬南芥突變體，然后對(duì)野生型和突變型的29個(gè)等位基因進(jìn)行了突變機(jī)理研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明有14個(gè)基因發(fā)生了相似位點(diǎn)的突變，而另外15個(gè)基因則表現(xiàn)出發(fā)生了重組突變，包括缺失、移位、倒置和插入等突變類型，其研究結(jié)果同時(shí)也表明高LET的碳離子束輻照比其他低LET的射線輻照，表現(xiàn)出更豐富的基因組DNA的突變類型；Raychaudhuri等[14]利用7Li、12C和16O重離子束輻照巴氏甲烷八疊球菌DSM 804發(fā)現(xiàn)，古生真菌DSM 804可以修復(fù)重離子束誘導(dǎo)的DNA雙鏈斷裂，且修復(fù)過(guò)程與重離子束的傳能線密度相關(guān)；Okayasu等[15]的研究結(jié)果表明，與低LET X射線和γ射線相比，高LET重離子束可以誘導(dǎo)雙鏈DNA表現(xiàn)出更復(fù)雜的損傷（DNA double strand break）和團(tuán)簇?fù)p傷；Matuo等[16]比較了能量為220MeV/u的12C5+離子束和60Co γ射線對(duì)釀酒酵母URA3基因的突變影響，發(fā)現(xiàn)12C5+離子束誘導(dǎo)URA3基因突變頻率是60Co γ射線的10倍，突變類型包括移碼突變（13.7%）、顛換突變（68.7%）和刪除與插入（17.6%），且突變位點(diǎn)主要位于核小體連接區(qū)域，而60Co γ射線引起的突變位點(diǎn)則貫穿整個(gè)URA3基因；Yoshihara等[17]比較了不同物理誘變手段對(duì)擬南芥的誘變效應(yīng)，結(jié)果表明208 MeV/u12C5+離子束誘導(dǎo)擬南芥DNA大于2bp的缺失/插入突變的概率更大，γ射線則誘導(dǎo)擬南芥DNA的-1/-2移碼突變；Toyoshima等[18]通過(guò)比較高LET的12C5+、20Ne8+、12C6+等重離子束與低LET的γ射線對(duì)米曲霉的突變效應(yīng)和致死效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)LET=121keV/μm的12C5+離子束誘導(dǎo)米曲霉的致死率是低LET的γ射線（0.2keV/μm）的3.6倍，12C5+離子束引起米曲霉移碼突變大于20bp的基因刪除突變現(xiàn)象更為明顯；Shi等[19]比較了太空輻照和12C6+離子束輻照對(duì)水稻基因組DNA的輻照影響，發(fā)現(xiàn)太空輻照和低劑量的12C6+離子束輻照都可以引起水稻基因組和表觀基因組發(fā)生明顯的突變影響。

4 我國(guó)重離子束微生物育種的研究進(jìn)展

目前，僅有日本和中國(guó)在開展相應(yīng)的重離子束育種工作。其中，日本主要是進(jìn)行花卉和農(nóng)作物育種；中國(guó)僅有中國(guó)科學(xué)院等離子所的低能離子束注入裝置以及中國(guó)科學(xué)院近代物理所的中、高能重離子束輻照裝置可以開展相應(yīng)的重離子束育種工作，且在微生物改良、花卉輻照育種以及農(nóng)作物育種方面做出了巨大的貢獻(xiàn)。利用蘭州重離子加速器國(guó)家實(shí)驗(yàn)室提供的中能重離子束（能量為80～126MeV/u12C6+離子束）輻照誘變微生物菌株，為生物發(fā)酵產(chǎn)業(yè)提供高產(chǎn)能、高轉(zhuǎn)化率以及低耗能的微生物新菌種并使之產(chǎn)業(yè)化，已顯示出極大的優(yōu)勢(shì)和先進(jìn)性。例如，嚴(yán)亞平等[20]利用能量為100MeV/u的12C6+離子束對(duì)出發(fā)酒精酵母菌YY進(jìn)行輻照處理，以紅四氮唑作為篩選指示劑進(jìn)行篩選，最終獲得了一株突變酵母菌T4，基于優(yōu)化的培養(yǎng)條件，10L發(fā)酵罐實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，以甜高粱汁為原料，突變酵母菌T4比出發(fā)酵母菌YY產(chǎn)酒精能力和發(fā)酵率都提高了12%；王菊芳等[21]利用80MeV/u的12C6+離子束輻照黏紅酵母AY 91015，建立了磺基-磷-香草醛快速篩選高產(chǎn)油脂酵母菌模型，最終篩選出一株突變菌株M16，相對(duì)于出發(fā)菌株AY 91015，其生物量增加了8.8%，油脂濃度增加了68.8%；薛林貴等[22]利用能量為80MeV/u，LET為 35.5keV/μm的12C6+離子束輻照處理芽孢桿菌P-9，利用尼羅藍(lán)熒光染料輔助篩選，最終獲得一株突變株G15，與出發(fā)菌株相比，其β-羥基丁酸酯（PHB）的產(chǎn)量增加了1.5倍；李師翁等[23]利用80MeV/u的12C6+離子束輻照土曲霉CA99，最終篩選獲得一株突變株Z15-7，與出發(fā)菌株相比，其洛伐他汀產(chǎn)量提高了4倍，最大洛伐他汀產(chǎn)量達(dá)916.7μg/mL；胡光榮等[24]利用12C6+離子束輻照產(chǎn)油微藻Desmodesmus sp. S1，借助50μmol（photons）/（m2·s）低亮度光輻照篩選，最終獲得了一株產(chǎn)油率提高了20.6%的突變株D90G-19；馬玉彬等[25]利用80MeV/u的12C6+離子束輻照微擬球藻IMET1，同樣也借助50μmol（photons）/（m2·s）低亮度光輻照篩選，最終也得到了一株突變株HP-1，與出發(fā)微藻相比，其最大生長(zhǎng)率提升了6%、生物量提高了19%、油脂濃度提高了28%；王芝瑤等[26]利用80MeV/u的12C6+離子束對(duì)微擬球藻NannochloropsisoceanicaOZ-1進(jìn)行輻照處理，借助儀器Imaging-PAM 和酶標(biāo)儀進(jìn)行篩選，獲得了兩株生長(zhǎng)速率明顯加快的微擬球藻突變株，HP-1 和 HP-2，進(jìn)一步分析了突變株HP-1和HP-2的生物量積累和油脂積累，與出發(fā)藻種相比，發(fā)現(xiàn)HP-1生物量升高了18%，油脂產(chǎn)率提升到295mg/（L·d），HP-2生物量升高了26%，油脂產(chǎn)率提升至275mg/（L·d）；Zhou等[27]利用207MeV/u和162MeV/u的12C6+離子束輻照酪丁酸梭菌ATCC 25755，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)12C6+離子束輻照可以誘導(dǎo)酪丁酸梭菌的酸耐受力發(fā)生變化，增加丁酸的生物代謝生產(chǎn)。胡偉等[3，28]利用80MeV/u的12C6+離子束輻照處理檸檬酸生產(chǎn)菌，最終成功選育出一株高產(chǎn)突變菌株H4002，以玉米淀粉為原料，該菌株可以快速積累檸檬酸；將玉米液化糖濃度控制在163～170g/L，與野生型菌株相比，H4002號(hào)菌株積累檸檬酸的速率顯著增加，糖酸轉(zhuǎn)化率也顯著增強(qiáng)；進(jìn)一步調(diào)高玉米液化糖濃度至200～237g/L，高產(chǎn)H4002號(hào)菌株仍擁有快速積累檸檬酸的能力，尤其當(dāng)玉米液化糖濃度為210g/L時(shí)，高產(chǎn)H4002號(hào)菌株能積累（187.5±0.7）g/L的檸檬酸，產(chǎn)酸率高達(dá)3.13g/（L·h）。成果通過(guò)甘肅省科技廳組織的成果鑒定，達(dá)到了同類研究的國(guó)際先進(jìn)水平；2012年8月，課題組成功地將該成果技術(shù)的使用權(quán)轉(zhuǎn)讓給了我國(guó)著名檸檬酸生產(chǎn)企業(yè)，目前科研成果技術(shù)已經(jīng)在大生產(chǎn)中得到了很好的應(yīng)用。

綜上所述，正是基于重離子束對(duì)生物體DNA的損傷具有多樣性以及復(fù)雜性，重離子束誘變微生物育種是完全可行的，而且能誘發(fā)微生物表現(xiàn)出高產(chǎn)的特性，已有的研究結(jié)果表明重離子束輻照育種是近年來(lái)我國(guó)工業(yè)微生物育種領(lǐng)域發(fā)展起來(lái)的新型誘變手段，已經(jīng)為我國(guó)生物發(fā)酵產(chǎn)業(yè)注入了新的發(fā)展動(dòng)力。

5 展 望

基于重離子束可誘導(dǎo)微生物表現(xiàn)出突變譜寬、突變率高以及突變易穩(wěn)定等技術(shù)優(yōu)勢(shì)，越來(lái)越受到科研人員的青睞。正是在這樣的研究背景下，依托中國(guó)科學(xué)院近代物理研究所先進(jìn)的重離子加速器設(shè)備和其他公用工程條件，充分發(fā)揮輻照育種方面的技術(shù)優(yōu)勢(shì)，甘肅省輻照誘變育種工程實(shí)驗(yàn)室獲得了甘肅省發(fā)展和改革委員會(huì)批復(fù)，正在甘肅省武威市籌建。該工程實(shí)驗(yàn)室主要從事包括育種專用輻照終端的建設(shè)和植物、微生物誘變育種的研究。育種專用輻照生物實(shí)驗(yàn)終端主要包括束流控制系統(tǒng)（束流照射系統(tǒng)、束流掃描系統(tǒng)）、在束實(shí)時(shí)監(jiān)控系統(tǒng)（劑量和照射位置）、樣品固定和定位系統(tǒng)、軟件系統(tǒng)、樣品自動(dòng)換樣系統(tǒng)和輻射輻照防護(hù)系統(tǒng)，還包括劑量檢測(cè)、監(jiān)控系統(tǒng)、自動(dòng)換樣系統(tǒng)、劑量標(biāo)定設(shè)備、樣品定位裝置等（圖2）。該工程實(shí)驗(yàn)室建成后將是一個(gè)便捷、高效的輻照育種專用平臺(tái)，必將為微生物育種添加有用的利器，服務(wù)于我國(guó)生物發(fā)酵產(chǎn)業(yè)。

圖2 甘肅省輻照誘變育種工程實(shí)驗(yàn)室生物育種平臺(tái)

工程實(shí)驗(yàn)室另一主要研究?jī)?nèi)容是從技術(shù)和原理上完善重離子束輻照誘變技術(shù)，并開展重離子束誘變育種高突變率的機(jī)理研究。以制藥、能源、環(huán)境微生物為研究對(duì)象，探討微生物的突變率、突變譜與重離子的種類、能量、劑量等參數(shù)的關(guān)系，為制定微生物育種最佳誘變方案提供參考數(shù)據(jù)，結(jié)合基因組、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序等方法，探討重離子束誘變機(jī)理，為后續(xù)研究提供分子生物學(xué)基礎(chǔ)。

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The application of heavy ion irradiations for creating promising new strains of industrial microorganisms

CHEN Jihong，HU Wei，LI Wenjian

Institute of Modern Physics, Chinese Academy of Sciences, Lanzhou 730000, China

The excellent performance of the industrial microbial strains is important for enterprise to keep a sustainable competitive advantage. Therefore, it is still one of the core content to cultivate new microbial strains of high quality and high yield for the innovation and development of biological breeding industry. As an effective mutation method, heavy ion irradiations have been widely used in biological breeding industry. This paper mainly reviews the molecular mechanism of DNA mutation induced by heavy ion irradiations in living organism, and relative research progress of microbial breeding in China. Meanwhile, the application of special equipment for heavy ion breeding is dicussed.

heavy ion beams; industrial microbial strains; breeding

10.3969/j.issn.1674-0319.2017.01.007

國(guó)家自然科學(xué)基金（11605259）