ARTP生物育種技術與裝備研發(fā)及其產(chǎn)業(yè)化發(fā)展

吳亦楠，邢新會，，張翀，，李和平，王立言

ARTP生物育種技術與裝備研發(fā)及其產(chǎn)業(yè)化發(fā)展

吳亦楠1，邢新會1，2，張翀1，2，李和平2，3，王立言2

邢新會，清華大學教授，博士生導師，“百人計劃”入選者。主持“國家自然科學基金重大儀器專項”項目、中以國際合作項目，“十二五”科技支撐計劃項目，日本JST CREST等項目；發(fā)表SCI論文150余篇，合作著書8本，譯著教材2部，申請發(fā)明專利100余項，獲得發(fā)明專利60余項，其中1項國際專利。擔任《Journal of Bioscience and Bioengineering》主編，《Biochemical Engineering Journal》副主編，《食品科學》、《生物產(chǎn)業(yè)技術》及5個英文學術期刊編委。獲得第17屆全國發(fā)明展覽會獎銀獎（2007年），北京市科學技術獎三等獎（2008年），中國石油和化學工業(yè)協(xié)會技術發(fā)明獎二等獎（2009年），中國僑界貢獻獎（創(chuàng)新人才）（2010年），高等學校科學研究優(yōu)秀成果獎（科學技術）科技進步獎二等獎（2015年）。E-mail：xhxing@mail.tsinghua.edu.cn

1.工業(yè)生物催化教育部重點實驗室，清華大學化工系生物化工研究所，清華大學合成與系統(tǒng)生物學研究中心，北京 100084

2.清華大學無錫應用技術研究院生物育種中心，無錫 214072

3.清華大學工程物理系，北京 100084

安全高效的微生物誘變和高通量篩選技術與裝備是生物技術科研及產(chǎn)業(yè)發(fā)展的核心，具有重要的研究價值和廣泛的應用前景。筆者研究團隊成功將基于大氣壓射頻輝光放電的常壓室溫等離子體（ARTP）應用于生物誘變育種領域，對其與生物大分子、細胞之間的作用機理進行了系統(tǒng)研究，并研發(fā)了具有自主知識產(chǎn)權的ARTP生物育種儀。因操作安全簡便、突變快、突變率高、獲得的突變體性狀穩(wěn)定等特點，ARTP育種儀已成功應用于百種以上微生物的誘變育種，在行業(yè)引起了廣泛關注，并實現(xiàn)了的國際出口。綜述了ARTP生物育種技術的原理、裝備研發(fā)現(xiàn)狀及其近年來的研究和應用進展，并對其今后的發(fā)展趨勢進行了展望。

ARTP；篩選；生物育種；誘變

自19世紀30年代以來， 生物發(fā)酵技術以其節(jié)能高效、綠色無害的特點被廣泛用于生產(chǎn)各類化學品，服務于食品、醫(yī)藥、材料、環(huán)保、能源等領域。以化石資源為基礎的現(xiàn)代工業(yè)面臨著日益嚴重的資源短缺、環(huán)境污染、氣候變化和能源危機，因此人類對工業(yè)生物技術及其綠色可持續(xù)發(fā)展工業(yè)給予極大的期待，生物經(jīng)濟呼之欲出[1]?？焖龠x育具有高產(chǎn)、高魯棒性、高穩(wěn)定性、高安全性表型的工業(yè)微生物成為生物經(jīng)濟發(fā)展的關鍵技術。

微生物育種技術是生物經(jīng)濟的核心。近年來，隨著分子生物學、代謝工程學、系統(tǒng)生物學及合成生物學等學科的快速發(fā)展，菌株的理性和半理性設計得到了長足的進步。分子育種技術具有一定的定向性，且因其引入了外源基因和合成途徑，能極大地拓寬微生物生產(chǎn)的產(chǎn)品種類和效率，但由于細胞的復雜性，即使采用理性設計，仍無法完全準確預測結(jié)果，因此需要采用設計-構(gòu)建-測試-學習循環(huán)（DBTL）的模式，但理性設計存在技術難度高、周期長，適用微生物種類有限、生物安全性等問題，在實際應用時仍面臨著很多挑戰(zhàn)。相比之下，具有悠久歷史的誘變育種技術因其操作簡單、成本相對較低、產(chǎn)生突變?nèi)菀?、適用范圍廣、屬于非轉(zhuǎn)基因操作等，仍是微生物育種研究和產(chǎn)業(yè)應用的平臺技術。因此，發(fā)展安全高效的新型生物誘變技術具有重要的研究價值。

誘變育種根據(jù)其誘變源的不同可以分為化學誘變[2-3]、物理誘變[4-7]和生物誘變[8-9]。近年來，筆者研究團隊基于大氣壓射頻輝光放電原理，自主研發(fā)的常壓室溫等離子體（ARTP）誘變技術[10]及裝備作為繼離子束注入[6]和大氣壓介質(zhì)阻擋放電等離子體（APDBD）體誘變技術[11-14]之后的又一安全高效誘變新方法。因不需要真空系統(tǒng)，設備結(jié)構(gòu)簡單、成本低；放電均勻、穩(wěn)定、可控，操作簡便，安全性高；等離子體產(chǎn)生條件溫和（常壓、室溫范圍），富含大量活性粒子，突變譜廣，突變率高等，ARTP在工業(yè)微生物育種中得到了廣泛應用并取得良好效果，引起了國內(nèi)外科研機構(gòu)和企業(yè)越來越多的關注。 本文重點介紹ARTP技術和裝備的研究及應用發(fā)展。

圖1 常見的APNED發(fā)生器[17]

1 ARTP生物育種技術原理

ARTP是常壓非平衡放電等離子體（APNED）[15-16]的一種。APNED由帶電粒子（電子、陰離子、陽離子）、自由基、中性粒子（激發(fā)的原子或分子）、光子（可見光和紫外線）和電磁場組成，其各組分比例因等離子體產(chǎn)生方式、放電電壓、氣源種類不同而略有差異。常見的APNED發(fā)生器如圖1所示[17]。APNED因去除了復雜、昂貴的真空系統(tǒng)且溫度較低，其熱效應影響可以忽略而越來越受關注，被廣泛用于細菌、真菌、病毒等病原體的滅活、傷口及醫(yī)療設備的消毒、細胞轉(zhuǎn)染及癌癥細胞的誘導凋亡等研究[18-21]。

大量研究表明，APNED與DNA、蛋白質(zhì)、微生物細胞發(fā)生相互作用[17]，從而產(chǎn)生細胞的致死和亞致死效應。APNED中存在的大量活性氧化物和活性氮化物是引起DNA斷裂、真核細胞DDR響應、原核細胞SOS響應的主要因素[22-24]。APNED中常見的活性物質(zhì)如表1[25]所示，活性物質(zhì)與DNA的作用位點、誘導DNA斷裂的作用過程如圖2[26]和圖3[17]所示。當N-糖苷鍵受到攻擊或脫氧核糖發(fā)生脫氫反應時，DNA會由于一系列變化產(chǎn)生單鏈斷裂；而當不同鏈上的斷鏈位置相近時，能夠產(chǎn)生雙鏈斷裂。裸露的DNA雙鏈、質(zhì)粒經(jīng)由APNED處理后，在短時間內(nèi)就會出現(xiàn)雙鏈斷裂和完全裂解的現(xiàn)象。APNED照射活細胞首先會改變細胞膜的通透性，但具有不同膜結(jié)構(gòu)的細胞對APNED的耐受能力不同[13]。在膜結(jié)構(gòu)被破壞之后，APNED內(nèi)的活性粒子或其與水分子及胞內(nèi)脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等生物分子進一步反應生成的有機氧化物會引發(fā)DNA易錯性修復機制[27]。當APNED照射強度過高時，細胞會死亡；而當強度適中時，細胞則會產(chǎn)生基因突變，胞內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄水平、翻譯水平等都將隨之變化[28-33]。王立言和張雪等[10，34]利用黃嘌呤氧化酶法和FDG與PI熒光染料從細胞水平上解析了上述作用機制。者研究團隊首次用于微生物育種。并且研究團隊揭示了ARTP與生物作用的機理，有良好的應用成效[35]。

表1 APNED中常見的活性物質(zhì)

圖2 等離子體活性物質(zhì)與DNA的可能作用位點[26]

圖3 活性物質(zhì)引起的DNA斷裂[17]

2 ARTP生物育種設備研發(fā)及誘變特點

AR TP生物育種技術的實驗室研究平臺如圖4所示[10]。當工作氣體經(jīng)過兩個通電電極之間時，具有高能量的電子與周圍的中性粒子通過彈性碰撞和非彈性碰撞發(fā)生能量交換，使工作氣體分子分解、激發(fā)或電離，隨著電壓的升高，氣體被擊穿產(chǎn)生放電，形成具有一定電離度的等離子體；在氣流作用下產(chǎn)生的等離子體以一定的速度噴出并與空氣中的組分反應，形成含有氮、氧、羥基等其他活性粒子的等離子體射流。

筆者研究團隊以He為工作氣體對該發(fā)生器的物理特性進行了系統(tǒng)深入的研究，代表性結(jié)果圖5所示。

在大氣壓條件下，ARTP溫度可控制在室溫范圍，適用于各類生物處理[10]；在適宜的電極間距內(nèi)，等離子體發(fā)生器能以α和γ模式實現(xiàn)放電[37]。后者可以用于誘發(fā)純空氣或氧氣的持續(xù)性放電，起到降低氣耗成本的目的[38]，放電均勻、穩(wěn)定[36]。等離子體含有豐富的活性粒子，紫外線強度和臭氧含量極低，具有高效誘變細胞的潛力[22]。

由于不同的活性物質(zhì)作用于DNA的位點不同，造成的氧化損傷、基因突變的偏好性也會有所差異，因此，包含大量不同活性粒子的APNED基因突變范圍廣、突變率高，相比于傳統(tǒng)的物理誘變方法能夠產(chǎn)生更多的基因多樣性和突變譜。ARTP作為APNED中放電最均勻、穩(wěn)定、安全、可控和更溫和的一類低溫等離子體，被筆

圖4 ARTP生物育種設備的實驗室研發(fā)平臺[10]

圖5 ARTP基本物理性質(zhì)[10，22，36]

筆者研究團隊在揭示ARTP對胞外DNA損傷作用[22]的基礎上，對生產(chǎn)阿維菌素的阿維鏈霉菌進行了誘變育種，結(jié)果顯示誘變后的菌株菌落形態(tài)發(fā)生了明顯變化，根據(jù)菌落形態(tài)對突變后的菌株進行篩選，獲得了一株阿維菌素總產(chǎn)量提高18%、抗蟲活性最高的組分B1a產(chǎn)量提高43%的高產(chǎn)菌株，且具有良好的遺傳穩(wěn)定性[35]。利用umu test原理和流式細胞儀，建立了各種誘變源對活細胞DNA損傷強度定量分析方法，結(jié)果顯示ARTP對活細胞DNA的損傷強度遠高于其他方法[10,34]。此外，筆者團隊還通過f uctuation test方法比較了不同強度ARTP、UV、化學誘變的DNA損傷強度與突變率的關系[34]，結(jié)果如圖6所示?；罴毎麅?nèi)DNA損傷強度與誘變率具有一定的正相關性，ARTP誘變的突變率高于其他誘變源，是一種更為高效的誘變源。

為了推進ARTP生物育種技術的廣泛應用，實現(xiàn)技術的裝備化及其產(chǎn)業(yè)化是關鍵，筆者團隊在清華大學無錫應用技術研究院建立了生物育種研發(fā)中心，并孵化了無錫源清天木生物科技有限公司，成功研制了一系列ARTP誘變育種儀，滿足不同應用需求，如圖7所示。該系列儀器獲得授權國家發(fā)明專利10余項，自2012年開始應用以來得到了學術界和工業(yè)界的廣泛關注，并已出口到新加坡和日本等國。

3 ARTP生物育種技術在微生物改造中的應用

ARTP生物育種技術以其操作便捷性、安全性和高效性等特點得到了廣泛應用，在微生物育種領域發(fā)揮著重要作用[39]。表2列舉了近三年來ARTP生物育種技術應用的部分代表性案例，其他應用案例可參考已發(fā)表的綜述論文[37,39]。

目前，ARTP生物育種技術已經(jīng)成功用于百余種微生物的性能改造，包括細菌、真菌、微藻等，涉及生產(chǎn)能力、細胞生長速度及耐受性等表型的改變，服務于80余家國內(nèi)外生物技術龍頭企業(yè)和科研院所。另外，近兩年ARTP生物育種技術在植物[51]和動物育種中的應用也初步獲得了成功，這表明ARTP生物育種技術是具有普適性的誘變方法。以此為契機，發(fā)起并聯(lián)合組建的中國生物發(fā)酵產(chǎn)業(yè)協(xié)會微生物育種分會為行業(yè)提供了平臺支撐。

圖6 ARTP與常規(guī)突變源的DNA損傷強度與突變率的關系（a）及突變率比較結(jié)果（b）[34]

圖7 系列ARTP誘變育種儀

表2 ARTP生物育種技術近三年的部分代表性應用實例

4 ARTP生物育種技術展望

綜上所述，基于ARTP固有的安全、簡便、可控等物理學特點，筆者團隊研發(fā)的ARTP生物育種裝備具有高效構(gòu)建多樣性突變庫、實現(xiàn)全局突變、基因沉默及激活途徑等功能，是生物誘變育種的平臺工具。

針對微生物菌種選育過程復雜、操作周期長的問題，除了發(fā)展快速引起基因組大范圍突變技術之外，還需要將理性設計和非理性進化方法結(jié)合，系統(tǒng)地改造微生物細胞工廠。伴隨著測序技術和生物信息學的飛速發(fā)展，經(jīng)由ARTP誘變構(gòu)建的突變庫將為研究代謝網(wǎng)絡調(diào)控、生物信號傳導、酶促反應機制、表觀遺傳、GWAS等科學問題提供新素材，成為代謝工程和合成生物學等理性設計的重要平臺工具（圖8）。

圖8 面向菌種高效設計與改造的生物育種裝備與進化工程和合成途徑工程技術的整合研究

ARTP作為一種高效的突變工具，能在短時間內(nèi)處理生物細胞并產(chǎn)生104以上的突變體，構(gòu)建大的突變庫。如何從多樣性的大突變文庫中快速精準地篩選具有理想目的性狀的菌株是另一個急需解決的關鍵問題，這也是生物育種技術發(fā)展的前沿[52]。對于目標表型與細胞形態(tài)、顏色無關的工業(yè)微生物的篩選，高通量篩選和適應性進化技術成為未來發(fā)展的重要方向。自動化設備如移液站、Colony picker等的應用大大加快了這一研究的過程，但其通量大小和篩選效率依然有局限性，而且運行成本高。流式細胞儀[53-54]和微液滴技術[55-58]的興起與應用能夠很好的滿足突變庫的高通量篩選需求。兩者能夠通過生物傳感器或熒光檢測試劑將目的產(chǎn)物胞內(nèi)或胞外濃度與熒光強度結(jié)合，以103～104個單菌/s的通量進行突變菌株的高效篩選。對于抗逆表型，適應性進化是有效的選擇手段[59]。但搖瓶傳代培養(yǎng)體系操作繁瑣，耗時耗力；恒化培養(yǎng)體系則對培養(yǎng)設備有較高的要求，而且也存在操作復雜的問題。如果微液滴技術[60]能在芯片上實現(xiàn)長期的恒化培養(yǎng)及自動化操作，開發(fā)出在芯片上自動操作的適應性進化體系，將大幅度提升突變微生物的進化通量。基于此，本團隊提出了將ARTP高效誘變技術與微液滴技術整合的新思路，目標是研制出誘變-篩選一體化的高通量生物進化儀，以實現(xiàn)微生物的定制化改造，為理論進化生物學和工業(yè)微生物育種提供系統(tǒng)、高效的平臺，于2016年獲得了國家自然科學基金委國家重大科研儀器研制專項的支持。

［1］ OECD. The Bioeconomy to 2030 - Main f ndings and conclusions[R]. Paris，OECD，2009.

［2］ MIAO Z H，RAO V A，AGAMA K，et al. 4-nitroquinoline 1-oxide induces the formation of cellular topoisomerase I-DNA cleavage complexes[J]. Cancer Research，2006，66（13）：6540-6545.

［3］ SLAME?OVá D，GáBELOVá A，RU?EKOVá L，et al. Detection of MNNG-induced DNA lesions in mammalian cells; validation of comet assay against DNA unwinding technique，alkaline elution of DNA and chromosomal aberrations[J]. Mutation Research - DNA Repair，1997，383（3）：243-252.

［4］ SINHA R P，H?DER D P. UV-induced DNA damage and repair：a review[J]. Photochemical & Photobiological Sciences，2002，1（4）：225-236.

［5］ DE GRUIJL F R，VAN KRANEN H J，MULLENDERS L H F. UV-induced DNA damage，repair，mutations and oncogenic pathways in skin cancer[J]. Journal of Photochemistry and Photobiology B：Biology，2001，63（1-3）：19-27.

［6］ GU S B，LI S C，F(xiàn)ENG H Y，et al. A novel approach to microbial breeding-low-energy ion implantation[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2008，78（2）：201-209.

［7］ 胡偉，陳積紅，張珍，等. 重離子輻照檸檬酸菌株的誘變選育[J]. 輻射研究與輻射工藝學報，2012，30（1）：53-57.

［8］ COX E C，HORNER D L. Structure and coding properties of a dominant Escherichia coli mutator gene，mutD [J]. Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America，1983，80（8）：2295-2299.

［9］ CHOU H H，KEASLING J D. Programming adaptive control to evolve increased metabolite production [J]. Nature Communications，2013，4（10）：1-8.

［10］ 王立言. 常壓室溫等離子體對微生物的作用機理及其應用基礎研究[D].北京：清華大學，2009. http://166.111.120.42/Thesis/Thesis/ThesisSearch/ Search_DataDetails.aspx?dbcode=ETDQH&dbid=7&sysid=213177.

［11］ JéR?ME F，CHATEL G，DE OLIVEIRA VIGIER K. Depolymerization of cellulose to processable glucans by non-thermal technologies[J]. Green Chem，2016，18（14）：3903-3913.

［12］ HOU Y M，DONG X Y，YU H，et al. Disintegration of biomacromolecules by dielectric barrier discharge plasma in helium at atmospheric pressure[J]. IEEE Transactions on Plasma Science，2008，36（4 PART 3）：1633-1637.

［13］ LU H，PATIL S，KEENER K M，et al. Bacterial inactivation by high-voltage atmospheric cold plasma：Inf uence of process parameters and effects on cell leakage and DNA[J]. Journal of Applied Microbiology，2014，116（4）：784-794.

［14］ YU H，XIU Z L，REN C S，et al. Inactivation of yeast by dielectric barrier discharge （DBD） plasma in helium at atmospheric pressure[J]. IEEE Transactions on Plasma Science，2005，33（4）：1405-1409.

［15］ HAERTEL B，VON WOEDTKE T ，WELTMANN K，et al. Non-thermal atmospheric-pressure plasma possible application in wound healing[J]. Biomolecules & Therapeutics，2014，22（6）：477-490.

［16］ NEHRA V，KUMAR A，DWIVEDI H K. Atmospheric non-thermal plasma sources[J]. International Journal of Engineering，2008，2（1）：53-68.

［17］ ARJUNAN K，SHARMA V，PTASINSKA S. Effects of atmospheric pressure plasmas on isolated and cellular DNA—A Review[J]. International Journal of Molecular Sciences，2015，16（2）：2971-3016.

［18］ FRIDMAN G，SHERESHEVSKY A，JOST M M，et al. Floating electrode dielectric barrier discharge plasma in air promoting apoptotic behavior in Melanoma skin cancer cell lines[J]. Plasma Chemistry and Plasma Processing，2007，27（2）：163-176.

［19］ LEDUC M，GUAY D，LEASK R L，et al. Cell permeabilization using a non-thermal plasma[J]. New Journal of Physics，2009，11（11）：1-12.

［20］ YILDIRIM E D，AYAN H，VASILETS V N，et al. Effect of dielectric barrier discharge plasma on the attachment and proliferation of osteoblasts cultured over poly（ε-caprolactone） scaffolds[J]. Plasma Processes and Polymers，2008，5（1）：58-66.

［21］ MORFILL G E，SHIMIZU T，STEFFES B，et al. Nosocomial infections - A new approach towards preventive medicine using plasmas[J]. New Journal of Physics，2009，11（11）.

［22］ LI G，LI H P，WANG L Y，et al. Genetic effects of radio-frequency，atmospheric-pressure glow discharges with helium[J]. Applied Physics Letters，2008，92（22）：2006-2009.

［23］ GAUNT L F，BEGGS C B，GEORGHIOU G E. Bactericidal action of the reactive species produced by gas-discharge nonthermal plasma at atmospheric pressure：A review[J]. IEEE Transactions on Plasma Science，2006，34（4 II）：1257-1269.

［24］ LACKMANN J W，SCHNEIDER S，EDENGEISER E，et al. Photons and particles emitted from cold atmospheric-pressure plasma inactivate bacteria and biomolecules independently and synergistically[J]. Journal of the Royal Society，2013，10（89）：20130591.

［25］ HALLIWELL B. Oxidative stress and neurodegeneration：Where are we now?[J]. Journal of Neurochemistry，2006，97（6）：1634-1658.

［26］ 隋澎，張翀，王立言. 開發(fā)高效菌株育種技術提升生物產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新能力[J]. 生物產(chǎn)業(yè)技術，2015，3：82-84.

［27］ KALGHATGI S，KELLY C M，CERCHAR E，et al. Effects of non-thermal plasma on mammalian cells[J]. PLoS One，2011，6（1）：1-11.

［28］ SHACKELFORD R E，KAUFMANN W K，PAULES R S. Oxidative stress and cell cycle checkpoint function[J]. Free Radical Biology and Medicine，2000，28（9）：1387-1404.

［29］ BARZILAI A，YAMAMOTO K I. DNA damage responses to oxidative stress[J]. DNA Repair，2004，3（8-9）：1109-1115.

［30］ SIMON H U，HAJ-YEHIA A，LEVI-SCHAFFER F. Role of reactive oxygen species （ROS） in apoptosis induction[J]. Apoptosis，2000，5（5）：415-418.

［31］ CIRCU M L，AW T Y. Reactive oxygen species，cellular redox systems，and apoptosis[J]. Free Radical Biology and Medicine，2010，48（6）：749-762.

［32］ SMITH J，LADI E，MAYER-PROSCHEL M，et al. Redox state is a central modulator of the balance between self-renewal and differentiation in a dividing glial precursor cell[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2000，97（18）：10032-10037.

［33］ DROGE W，DR?GE W. Free radicals in the physiological control of cell function[J]. Physiological Reviews，2002，82（1）：47-95.

［34］ ZHANG X，ZHANG C，ZHOU Q Q，et al. Quantitative evaluation of DNA damage and mutation rate by atmospheric and roomtemperature plasma （ARTP） and conventional mutagenesis[J].Applied Microbiology and Biotechnology，2015，99（13）：5639-5646.

［35］ WANG L Y，HUANG Z L，LI G，et al. Novel mutation breeding method for Streptomyces avermitilis using an atmospheric pressure glow discharge plasma[J]. Journal of Applied Microbiology，2010，108（3）：851-858.

［36］ WANG Z，LE P，GE N，et al. One-dimensional modeling on the asymmetric features of a radio-frequency atmospheric helium glow discharge produced using a co-axial-type plasma[J]. Plasma Chem Plasma Process，2012（32）：859-874.

［37］ 張雪，張曉菲，王立言，等. 常壓室溫等離子體生物誘變育種及其應用研究進展[J]. 化工學報，2014，65（7）：2676-2684.

［38］ LI H P，SUN W T，WANG H B，et al. Electrical features of radio-frequency，atmospheric-pressure，bare-metallic-electrode glow discharges[J]. Plasma Chemistry and Plasma Processing，2007，27（5）：529-545.

［39］ ZHANG X，ZHANG X F，LI H P，et al. Atmospheric and room temperature plasma （ARTP） as a new powerful mutagenesis tool[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2014，98（12）：5387-5396.

［40］ TAN Y，F(xiàn)ANG M，JIN L，et al. Culture characteristics of the atmospheric and room temperature plasma-mutated Spirulina platensis mutants in CO2aeration culture system for biomass production[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering，2015，120（4）：438-443.

［41］ LIU B，SUN Z，MA X，et al. Mutation Breeding of extracellular polysaccharide-producing microalga Crypthecodinium cohnii by a novel mutagenesis with atmospheric and room temperature plasma[J]. International Journal of Molecular Sciences，2015，16（4）：8201-8212.

［42］ ZHANG C，SHEN H，ZHANG X，et al. Combined mutagenesis of Rhodosporidium toruloides for improved production of carotenoids and lipids[J]. Biotechnology Letters，2016，38（10）：1-6.

［43］ KONG X，HE A，ZHAO J，et al. Efficient acetone-butanol-ethanol （ABE） production by a butanol-tolerant mutant of Clostridium beijerinckii in a fermentation-pervaporation coupled process[J]. Biochemical Engineering Journal，2016，105：90-96.

［44］ DONG J，GASMALLA M A A，ZHAO W，et al. Characterisation of a cold adapted esterase and mutants from a psychrotolerant Pseudomonas sp. strain[J]. Biotechnology and Applied Biochemistry，2016.

［45］ ZHANG D，WANG Q，LIANG X. Breeding high producers of enduracidin from Streptomyces fungicidicus by combination of various mutation treatments[J]. Advances in Applied Biotechnology，2014：133-142.

［46］ WANG L，CHEN X，WU G，et al. Improved ε-poly-l-lysine production of Streptomyces sp. FEEL-1 by atmospheric and room temperature plasma mutagenesis and streptomycin resistance screening[J]. Annals of Microbiology，2015，65（4）：2009-2017.

［47］ MA J F，WU M K，ZHANG C Q，et al. Coupled ARTP and ALE strategy to improve anaerobic cell growth and succinic acid production by Escherichia coli[J]. Journal of Chemical Technology and Biotechnology，2016，91（3）：711-717.

［48］ WANG Y，LI Q，ZHENG P，et al. Evolving the L-lysine highproducing strain of Escherichia coli using a newly developed high-throughput screening method[J]. J Ins Microbiol Biotechnol，2016，43（9）：1227-1235.

［49］ ZENG W，DU G，CHEN J，et al. A high-throughput screening procedure for enhancing alpha-ketoglutaric acid production in Yarrowia lipolytica by random mutagenesis[J]. Process Biochemistry，2015，50（10）：1516-1522.

［50］ ZHANG T C，NAKAJIMA M. Evaluation of an ethanol-tolerant acetobacter pasteurianus mutant generated by a new atmospheric and room temperature plasma （ARTP）[J]. Advances in Applied Biotechnology，2015：277-286.

［51］ MEIJIE L. Effects on maize seed and pollen germination by atmospheric and room temperature plasma[J]. Molecular Plant Breeding，2016，14（5）：1262-1267.

［52］ DIETRICH J A，MCKEE A E，KEASLING J D. High-throughput metabolic engineering：advances in small-molecule screening and selection[J]. Annual Review of Biochemistry，2010，79：563-590.

［53］ FANG M，WANG T，ZHANG C，et al. Intermediate-sensor assisted push-pull strategy and its application in heterologous deoxyviolacein production in Escherichia coli[J]. Metabolic Engineering，2016，33：41-51.

［54］ BINDER S，SCHENDZIELORZ G，ST?BLER N，et al. A highthroughput approach to identify genomic variants of bacterial metabolite producers at the single-cell level[J]. Genome Biology，2012，13（5）：R40.

［55］ MAZUTIS L，GILBERT J，UNG W L，et al. Single-cell analysis and sorting using droplet-based microf uidicsz[J]. Nature Protocols，2013，8（5）：870-891.

［56］ BARET J C，MILLER O J，TALY V，et al. Fluorescence-activated droplet sorting （FADS）：eff cient microf uidic cell sorting based on enzymatic activity[J]. Lab Chip，2009，9（13）：1850-1858.

［57］ WANG B L，GHADERI A，ZHOU H，et al. Microfluidic high-throughput culturing of single cells for selection based on extracellular metabolite production or consumption[J]. Nature Biotechnology，2014，5：1-26.

［58］ BROUZES E，MEDKOVA M，SAVENELLI N，et al. Droplet microf uidic technology for single-cell high-throughput screening[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2009，106（34）：14195-14200.

［59］ PORTNOY V A，BEZDAN D，ZENGLER K. Adaptive laboratory evolution—harnessing the power of biology for metabolic engineering[J]. Current Opinion in Biotechnology，2011，22（4）：590-594.

［60］ JAKIELA S，KAMINSKI T S，CYBULSKI O，et al. Bacterial growth and adaptation in microdroplet chemostats[J]. Angewandte Chemie（International ed. in English），2013，52（34）：8908-891 1.

Recent progress on atmospheric and room temperature plasma(ARTP) biobreeding technology, instrumentation and its industrialization

WU Yinan1，XING Xinhui1，2，ZHANG Chong1，2，LI Heping2，3，WANG Liyan2

1. MOE Key Laboratory for Industrial Biocatalysis, Institute of Biochemical Engineering, Department of Chemical Engineering, Center for Synthetic & Systems Biology, Tsinghua University, Beijing 100084, China
2. Biobreeding Research Center, Wuxi Research Institute of Applied Technologies, Tsinghua University, Wuxi 214072, China
3. Department of Engineering Physics, Tsinghua University, Beijing 100084, China

As the core of biotechnological research and industry, development of safe and eff cient microbial mutagenesis technology and high-throughput screening as well as their instrumentation is of importance. Our research group has successfully developed a novel biological mutation breeding technology using atmospheric and room temperature plasma(ARTP) and invented the ARTP biobreeding equipment with our own intellectual property rights. Due to the benef ts of easy operation, rapid mutation capability, high mutation rate, high mutant genetic stability and high safety for the operators, ARTP biobreeding equipment has attracted extensive attention in the industry and academy and has achieved international exports. It has been successfully applied in the breeding of more than 100 kinds of microorganisms. This paper summarizes the recent progress on ARTP biobreeding technology and prospects.

ARTP; screening; biobreeding; mutagenesis

10.3969/j.issn.1674-0319.2017.01.006

吳亦楠，在讀博士，主要從事代謝工程、微生物高通量育種等方面的研究。E-mail：wuyinan14@mails.tsinghua.edu.cn

清華大學自主科研計劃（20161080108），日本JST CREST項目，國家自然科學基金委國家重大科研儀器研制專項（2162780028）