基因組工程在微生物細(xì)胞工廠構(gòu)建中的應(yīng)用進(jìn)展

何慶，王茜，朱清華，方宏清

1.德州學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，德州 253023

2.安徽大學(xué)健康科學(xué)研究院，合肥 230601

基因組工程在微生物細(xì)胞工廠構(gòu)建中的應(yīng)用進(jìn)展

何慶1，王茜1，朱清華1，方宏清2

1.德州學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，德州 253023

2.安徽大學(xué)健康科學(xué)研究院，合肥 230601

微生物細(xì)胞工廠是以可再生資源為原料，通過微生物細(xì)胞轉(zhuǎn)化制備人類所需的能源、藥物、化工原料等等，或者利用微生物治理日益惡化的環(huán)境。應(yīng)用基因組工程改造目標(biāo)微生物可以進(jìn)一步提升其應(yīng)用潛力，更好地解決當(dāng)今所面臨的健康、能源和環(huán)保等問題。簡述了目前主要的基因組改造技術(shù)及其在構(gòu)建大腸桿菌、酵母、鏈霉菌、枯草芽孢桿菌和乳酸菌細(xì)胞工廠中的應(yīng)用研究進(jìn)展。

基因組工程；微生物細(xì)胞工廠；合成生物學(xué)

基因組工程是指為了實(shí)現(xiàn)某一目標(biāo)對復(fù)制系統(tǒng)進(jìn)行有意的、廣泛的遺傳修飾。目前，人們對基因組工程的研究正處于快速上升時(shí)期。以微生物細(xì)胞工廠替代傳統(tǒng)化工廠，將可再生資源轉(zhuǎn)化為人類所需的能源、藥物、化工原料等，是綠色發(fā)展的重要途徑之一。目前，以基因組工程為基礎(chǔ)的微生物細(xì)胞工廠的構(gòu)建主要有兩條技術(shù)路線：合成簡約化的基因組；剔除贅余基因以獲得簡約化的基因組。第一條技術(shù)路線是以人們對生物體系研究所獲得的技術(shù)與知識為基礎(chǔ)，將零部件一步步組建成生物體，重塑生命是其核心思想。第二條技術(shù)路線為大多數(shù)研究人員所采用，它主要針對遺傳背景較為清晰的微生物，通過對其基因組的結(jié)構(gòu)和序列進(jìn)行分析，分批次敲除非必需或贅余的基因序列，或通過添加DNA序列增加新的功能，提高細(xì)胞對底物和能量的利用率以及生產(chǎn)性能。

1 基因組改造技術(shù)

基因組靶向編輯指在基因組DNA的預(yù)定位點(diǎn)上，精確地改變DNA序列，包括插入、缺失和置換等，進(jìn)而改變基因的結(jié)構(gòu)或功能。該技術(shù)是微生物細(xì)胞工廠構(gòu)建中最常用的技術(shù)。

1.1 λ Red同源重組和CRISPR技術(shù)

λ Red同源重組是一項(xiàng)可在染色體水平進(jìn)行遺傳操作的技術(shù)，只需較短的同源序列，不需要特定的限制性酶切位點(diǎn)，即可在生物體內(nèi)完成重組過程。而CRISPR/Cas9（clustered regularly interspersed short palindromic repeats/Cas9）技術(shù)是由RNA指導(dǎo)Cas9蛋白對靶基因進(jìn)行修飾，具有組成簡單、價(jià)格低廉、安全性高、切點(diǎn)相對精確、具有可逆性、可同時(shí)對多個(gè)基因位點(diǎn)進(jìn)行編輯的優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用在不同微生物中（表1）。

目前，人們致力于將λ Red重組酶與CRISPR/ Cas技術(shù)相結(jié)合，結(jié)合后的系統(tǒng)不僅能夠發(fā)揮λ Red重組酶高效重組的優(yōu)點(diǎn)，還利用了CRISPR/Cas識別特異性序列并產(chǎn)生雙鏈斷裂的特點(diǎn)。如Reisch等[10]發(fā)明的 no-SCAR（scarless Cas9 assisted recombineering）利用λ Red促進(jìn)供體DNA的基因組整合，然后利用Cas9切割的雙鏈DNA來篩選突變株，可實(shí)現(xiàn)無痕基因組編輯。Carlotta等[11]在MAGE技術(shù)的基礎(chǔ)上結(jié)合CRISPR/Cas9與λ Red重組，創(chuàng)造出了一種適用于大腸桿菌的高效快速的基因組工程方法CRMAGE，該方法對3個(gè)基因組靶標(biāo)的重組效率高達(dá)96.5%～99.7%。

表1 CRISPR/Cas9技術(shù)在不同微生物中的應(yīng)用

1.2 大片段捕獲、合成及組裝

DNA片段的克隆和組裝技術(shù)是分子生物學(xué)的重要工具。近年來，隨著合成生物學(xué)的發(fā)展，對大片段的捕獲和有效組裝顯得尤為關(guān)鍵。雖然傳統(tǒng)的利用Ⅱ型限制性內(nèi)切酶連接克隆的策略仍然在發(fā)揮著重要作用，但由于酶切位點(diǎn)的限制，其在多DNA片段組裝或者平行無縫克隆方面不足之處也盡顯無遺[12]。為此，人們基于PCR、非典型酶切連接、單鏈退火拼接、同源重組等原理，開發(fā)出了一系列大片段DNA克隆與組裝技術(shù)，為微生物細(xì)胞工廠的構(gòu)建提供了有效的操作工具。但這些方法均有其各自的適用范圍，還沒有一種方法可以在滿足快速平行組裝（無痕、無序列依賴性、可按預(yù)設(shè)順序組裝）的同時(shí)，適用于生物合成途徑乃至基因組的組裝。因此，目前最常用的策略是依據(jù)目標(biāo)DNA分子尺度、序列的同源性程度和能否容忍疤痕的存在，將幾項(xiàng)最合適的技術(shù)聯(lián)合使用。

一些新方法和新技術(shù)的出現(xiàn)，使大片段捕獲、合成及組裝操作變得簡單。如應(yīng)用Red重組直接從體內(nèi)克隆染色體上大于10kb的DNA序列非常困難，但朱瑩等利用一種抗性拆分-融合策略成功地將供體菌基因組上約48kb的大片段DNA捕獲至質(zhì)粒載體上，并將其移植到了受體菌的染色體上，一次敲除了基因組中4個(gè)非必需區(qū)，該方法的發(fā)明將有利于基因組組裝和大片段DNA的功能研究[13]。 Red/ET重組是一種基于體內(nèi)同源重組的技術(shù)，該技術(shù)不受限制位點(diǎn)位置和DNA片段大小的限制。Bian等[14]利用RecE/EecT介導(dǎo)的大腸桿菌線性加線性同源重組（linear plus linear homologous recombination, LLHR）從丁香假單胞菌的基因組中直接克隆了syringolin基因簇，并在大腸桿菌中成功地進(jìn)行了異源表達(dá)。Huang等[15]更是將用迭代重組的方法組裝得到的多殺菌素基因簇替換了糖多孢菌體內(nèi)天然紅霉素聚酮化合物合酶基因，并獲得了成功的表達(dá)。

此外，還有許多其他的基因組改造方法，如RNA干擾[16]、PCR介導(dǎo)染色體分裂技術(shù)[17]等。

2 基因組工程在不同微生物細(xì)胞工廠中的應(yīng)用

2.1 基因組工程在大腸桿菌細(xì)胞工廠中的應(yīng)用

大腸桿菌是使用最廣泛的異源表達(dá)宿主菌。各大類天然產(chǎn)物，如非核糖體肽類、聚酮類、苯丙烷類和萜類化合物，都能在大腸桿菌內(nèi)異源合成。自2002年發(fā)表了第一篇大腸桿菌基因組簡約化的報(bào)道后，關(guān)于大腸桿菌基因組精簡的報(bào)道如雨后春筍。Shalini等[18]構(gòu)建了一系列可用于單拷貝DNA序列整合或者啟動(dòng)子區(qū)置換的模板質(zhì)粒，如pSD1xx和pSD2xx，并通過實(shí)驗(yàn)證明了其有效性。Wei等[19]利用基因組工程方法構(gòu)建了大腸桿菌突變株DOPA-30N，3,4-二羥基苯基-L-丙氨酸（L-DOPA）產(chǎn)量在5L發(fā)酵罐中60h能夠達(dá)到8.67g/L。上述研究成果表明，基因組的精簡往往能夠獲得意想不到的優(yōu)良屬性，同時(shí)也大大鼓舞了人們構(gòu)建大腸桿菌細(xì)胞工廠的想法。

將λ Red重組與CRISPR/Cas9相結(jié)合的策略，不僅能夠解決DNA大片段或者代謝途徑組裝過程中面臨的問題，而且已經(jīng)在很多研究中獲得了成功。如Chung等[1]基于上述策略發(fā)明了一種大片段基因精確整合的方法，能夠?qū)?kb的雙鏈DNA整合到大腸桿菌基因組中，且效率超過了60%。Pyne等[2]開發(fā)了一種三質(zhì)粒方法，不僅能夠?qū)Χ虇捂湽押塑账徇M(jìn)行高效重組，還能用大片段的PCR產(chǎn)物替換染色體延伸片段上的多基因。上述基因組編輯的方法將在大腸桿菌細(xì)胞工廠的構(gòu)建中發(fā)揮越來越重要的作用。

2.2 基因組工程在釀酒酵母細(xì)胞工廠中的應(yīng)用

釀酒酵母是代謝工程中應(yīng)用最廣泛的模式生物之一，是人們研究細(xì)胞周期、蛋白質(zhì)相互作用的首選模式生物。酵母細(xì)胞工廠對于真菌和植物來源的次級代謝途徑有良好的適應(yīng)性，然而質(zhì)?？截悢?shù)控制不佳和對持續(xù)選擇壓力的需求限制了其在工業(yè)發(fā)酵上的穩(wěn)定性。因此，更多先進(jìn)的基因組編輯技術(shù)在酵母中使用并獲得了成功。如Murakami等[17]通過分析釀酒酵母染色體基因，利用PCR介導(dǎo)染色體分裂技術(shù)，獲得了缺失531.5kb的基因組簡化菌株，其乙醇和甘油產(chǎn)量分別是野生株的1.8倍和2倍。

目前，人們已經(jīng)能夠利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對酵母菌進(jìn)行基因插入和敲除。Bao等[3]開發(fā)了HICRISPR（homology-integrated CRISPR-Cas） 技 術(shù)并首次在釀酒酵母內(nèi)一步成功敲除了CAN1、LYP1和ADE2基因。Shi等[4]研制出Di-CRISPR（delta integration CRISPR-Cas）平臺，利用該平臺可實(shí)現(xiàn)無痕的多基因整合，甚至完整代謝途徑的整合將成為可能。

總之，同源重組技術(shù)結(jié)合CRISPR/Cas9技術(shù)后，將成為無痕、一步基因敲除與整合、多基因生物合成途徑組裝的強(qiáng)有力的工具。再通過利用靈巧的多gRNA克隆表達(dá)元件，將來一定能夠?yàn)槿藗兲峁┓€(wěn)定性更強(qiáng)的工程化的酵母基因組[20]。

2.3 基因組工程在鏈霉菌細(xì)胞工廠中的應(yīng)用

鏈霉菌細(xì)胞工廠的優(yōu)點(diǎn)主要體現(xiàn)在3個(gè)方面：①作為多種次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生菌，鏈霉菌體內(nèi)豐富的初級代謝途徑可以提供充足的前體供應(yīng)；②鏈霉菌具有獨(dú)特的轉(zhuǎn)錄后修飾系統(tǒng)，如磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶催化的反應(yīng)是Ⅰ型聚酮合酶（polyketide synthase, PKS）及非核糖體肽合成酶（nontibosomal peptide synthetase, NRPS）中關(guān)鍵的蛋白修飾；③如果在鏈霉菌自身優(yōu)良特性的基礎(chǔ)上，能夠利用基因組工程開發(fā)出培養(yǎng)條件、遺傳操作和生長速度接近大腸桿菌的突變株，將成為合成生物學(xué)領(lǐng)域的標(biāo)志性成果[21]。因此，全世界的科學(xué)家一直對鏈霉菌基因組工程的研究情有獨(dú)鐘。

目前，鏈霉菌細(xì)胞工廠的構(gòu)建主要包括以下幾種策略：基因組的精簡和優(yōu)化、對各類調(diào)控子進(jìn)行改造和增加前體供應(yīng)。在此基礎(chǔ)上，人們已開發(fā)出阿維鏈霉菌、天藍(lán)鏈霉菌、變鉛青鏈霉菌、白色鏈霉菌和委內(nèi)瑞拉鏈霉菌等鏈霉菌底盤宿主。Wang等[22]以鏈霉菌FR008為初始菌株，經(jīng)過遺傳改造后獲得了一系列優(yōu)勢底盤，這些底盤遺傳操作非常容易，且是目前常見鏈霉菌中生長速度最快的。

CRISPR/Cas9技術(shù)的出現(xiàn)能夠解決鏈霉菌基因組編輯過程費(fèi)時(shí)費(fèi)力的難題。人們已經(jīng)用Ⅱ型CRISPR/Cas系統(tǒng)在變鉛青鏈霉菌、白色鏈霉菌和產(chǎn)綠色鏈霉菌中成功地進(jìn)行了多基因的缺失，編輯效率大于70%[5]。如Cobb等[6]利用含有嵌合gRNA的pCRISPomyces-2系統(tǒng)不僅高效地完成了單基因和雙基因的敲除，還實(shí)現(xiàn)了30kb大基因簇的缺失。Hu等[23]將CRISPR/Cas9和CodA（sm）組合后，發(fā)明了能夠快速、高效地編輯鏈霉菌基因組的CRISPR/ Cas9-CodA（sm）系統(tǒng)。Huang等[24]構(gòu)建了一個(gè)適合鏈霉菌基因操作的高效CRISPR/Cas9基因組編輯質(zhì)粒pKCcas9dO。相信在未來，隨著類似于CRISPR/ Cas的技術(shù)在鏈霉菌中廣泛應(yīng)用，將誕生更多性能優(yōu)越的鏈霉菌宿主，為鏈霉菌細(xì)胞工廠的構(gòu)建以及新藥的研制提供強(qiáng)有力的支持。

2.4 基因組工程在枯草芽孢桿菌細(xì)胞工廠中的應(yīng)用

枯草芽孢桿菌是工業(yè)生產(chǎn)中許多生物制品的宿主菌。作為一種底盤細(xì)胞，人們已經(jīng)致力于用多種基因組工程的方法對其基因組進(jìn)行精簡以提高它的性能和適用性。如Toya等[25]構(gòu)建的纖維素酶產(chǎn)生菌MGB874精簡了約20.7%的基因組，在生產(chǎn)堿性纖維素酶和蛋白酶時(shí)表現(xiàn)出了明顯的優(yōu)勢。除了能夠生產(chǎn)多種酶類之外，枯草芽孢桿菌還可以用來生產(chǎn)一些小分子化學(xué)物質(zhì)，如核苷、核黃素、2,3-丁二醇和乙酰甲基原醇等。Li等[26]對枯草芽孢桿菌168的基因組進(jìn)行了581.9～814.4 kb的精簡，構(gòu)建了多株突變株，發(fā)現(xiàn)它們在生長速率、產(chǎn)孢率、轉(zhuǎn)化效率等方面呈下降趨勢。但重新引入外源基因后，鳥嘌呤和胸腺嘧啶產(chǎn)量分別是野生株的4.4倍和5.2倍。

新的基因組編輯技術(shù)在枯草芽孢桿菌中的應(yīng)用也日益增多。如Josef等[7]構(gòu)建了一個(gè)可用于枯草芽孢桿菌基因組編輯的單質(zhì)粒系統(tǒng)，成功地敲除了枯草芽孢桿菌染色體上的兩個(gè)大片段，并對枯草芽孢桿菌168中的trpC2基因突變進(jìn)行了修復(fù)。Westbrook等[8]建立了一套綜合改造枯草芽孢桿菌的CRISPR/Cas9工具包。因此，我們有理由相信，隨著更多先進(jìn)的基因編輯技術(shù)的應(yīng)用，將大大推動(dòng)枯草芽孢桿菌工廠的構(gòu)建進(jìn)程。

2.5 基因組工程在乳酸菌細(xì)胞工廠中的應(yīng)用

乳酸菌具有良好的生物安全性，是公認(rèn)的安全級微生物。人們已經(jīng)完成了多種乳酸菌基因組的測序，發(fā)現(xiàn)同其他微生物一樣，其基因組內(nèi)含有大量的非必需基因。目前，大部分乳酸菌基因組簡化研究尚不成熟，基因敲除技術(shù)還依賴于傳統(tǒng)的同源重組技術(shù)，其敲除策略大致可分為3類：位點(diǎn)特異性重組、同源單交換基因敲除和線形DNA重組基因敲除[27]。

位點(diǎn)特異性重組體系由重組酶和特異性識別位點(diǎn)組成，該系統(tǒng)具有高度的專一性和保守性。Cre/ loxP系統(tǒng)和TP901-1/att系統(tǒng)常用于乳酸菌的位點(diǎn)特異性重組。如Qiao等[28]把質(zhì)粒pNZ5319轉(zhuǎn)化入乳酸乳球菌進(jìn)行同源重組，隨后引入Cre/loxP系統(tǒng)消除篩選標(biāo)記，成功敲除了胸腺嘧啶合成酶基因thyA。由于乳酸菌含有一層較厚的細(xì)胞壁，導(dǎo)致對其進(jìn)行遺傳操作較困難，重組效率一般較低，但仍然可以通過優(yōu)化相關(guān)因素（如引入反向篩選標(biāo)記和利用溫敏復(fù)制子）提高敲除效率。Langa等[29]利用敲除載體pORI28（repA-）和溫敏質(zhì)粒pVE6007（repA+）共同敲除短乳桿菌pdh30基因，發(fā)現(xiàn)該基因參與3-羥基丙酸的生物合成。

CRISPR/Cas技術(shù)未來極有可能在乳酸菌中得以廣泛應(yīng)用。van Pijkeren等[9]已嘗試把CRISPR/Cas系統(tǒng)和單鏈重組系統(tǒng)結(jié)合后應(yīng)用于乳酸菌中。Millen等[30]從遺傳水平對CRISPR/Cas系統(tǒng)在乳酸菌細(xì)胞內(nèi)的有效性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明CRISPR/Cas系統(tǒng)在乳酸菌內(nèi)部有效且應(yīng)用前景廣闊。此外，ZFNs和 TALENs等高效靶向基因修飾技術(shù)都有待應(yīng)用于乳酸菌中，這將極大地提高基因敲除效率，為乳酸菌細(xì)胞工廠的構(gòu)建提供強(qiáng)有力的工具。

3 總結(jié)與展望

利用微生物細(xì)胞工廠生產(chǎn)化工和醫(yī)藥產(chǎn)品具有高效、清潔、附加值高等優(yōu)點(diǎn)，已成為綠色工業(yè)發(fā)展的核心部分。特定環(huán)境下，維持細(xì)胞正常代謝所需的最小基因群構(gòu)成了該細(xì)菌的最小基因組。Masaomi等[31]對缺失了不同贅余基因組序列大小的大腸桿菌突變株的生長情況進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)它們的指數(shù)增長率和飽和細(xì)胞密度按照與缺失長度成正比的方式下降，并且該現(xiàn)象與培養(yǎng)基無關(guān)。因此，如何在保證微生物基本正常生長的條件下，利用最小基因組作為底盤構(gòu)建相應(yīng)的微生物細(xì)胞工廠，是需要進(jìn)一步研究的問題。在對不同微生物基因組的精簡過程中，CRISPR/Cas9系統(tǒng)因其獨(dú)特的優(yōu)勢成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。

目前，雖然有很多活性化合物及其衍生物在微生物細(xì)胞工廠中成功進(jìn)行了異源表達(dá)，但同時(shí)也發(fā)現(xiàn)了一些令人費(fèi)解的現(xiàn)象[32]。如Smanski等[33]曾嘗試在S. lividans K4-114、S. coelicolor（CH999、M1146、M1154）和S. albus J1074中對平板霉素基因簇進(jìn)行異源表達(dá)，但只在S. lividans中獲得成功，且是在敲除了途徑特異性調(diào)控基因ptnR1之后，導(dǎo)致這一結(jié)果的原因尚不清楚。因此，一方面需要對合成代謝途徑的調(diào)控系統(tǒng)及其底盤適配性的問題進(jìn)行深入研究，另一方面，由于任何一種微生物包含的代謝途徑不能夠滿足所有天然產(chǎn)物異源表達(dá)的需求，故開發(fā)性能優(yōu)良且各具專長的底盤細(xì)胞尤為緊迫。

隨著基因組工程技術(shù)的日新月異，將誕生更多優(yōu)良的超級微生物細(xì)胞工廠，它們遺傳操作快速高效、本底代謝競爭途徑少、培養(yǎng)條件簡單、標(biāo)準(zhǔn)化元件充足、異源化合物提取分離方便、穩(wěn)定且高產(chǎn)，將為新藥研發(fā)和天然化合物產(chǎn)業(yè)化提供更強(qiáng)大的支持。

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Application progress of genome engineering for construction of microbial cell factories

HE Qing1，WANG Qian1，ZHU Qinghua1，F(xiàn)ANG Hongqing2

1. College of Life Science, Dezhou University, Dezhou 253023, China
2. Institute of Health Science, Anhui University, Hefei 230601, China

Microbial cell factories（MCFs）apply microbial cells to transform renewable resources to produce energy, medicines, f ne chemicals and so on, or to remedy for the environment. To modify the microorganisms by genome engineering can further improve the MCFs’application potentiality and resolve the healthy, energy and environmental issues faced by the society. This paper describes the main genome modif cation technology and its application in construction advnced MCFs based on Escherichia coli, yeast, Streptomyces, Bacillus subtilis and Lactobacilli.

genome engineering; microbial cell factories; synthetic biology

10.3969/j.issn.1674-0319.2017.01.005

方宏清，博士，安徽大學(xué)兼職講席教授。研究方向：微生物基因工程藥物、微生物基因組工程及合成生物學(xué)。E-mail：fanghongqing@vip.sina.com

國家“973”計(jì)劃項(xiàng)目（2011CBA00800），國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（課題編號81373286）