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    紫檀芪對C6膠質(zhì)瘤細胞凋亡及Caspase—3活性的影響

    2017-02-23 14:18:46阮升顧志成張世華
    中國醫(yī)學創(chuàng)新 2017年1期
    關鍵詞:膠質(zhì)瘤途徑熒光

    阮升 顧志成 張世華

    【摘要】 目的:研究紫檀芪(pterostilbene,PTE)體外抑制C6膠質(zhì)瘤細胞增殖并誘導其凋亡的作用,探討其可能的作用機制。方法:運用MTT法測定細胞存活率,吖啶橙/溴化乙錠(AO/EB)雙熒光染色觀察C6細胞凋亡形態(tài)學變化,酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定Caspase-3活性變化,并用Western blot法檢測Fas、FasL蛋白的表達水平。結果:由MTT結果知紫檀芪可以顯著抑制C6細胞的增殖(P<0.01),呈現(xiàn)藥物濃度與時間依賴性;AO/EB熒光染色(24 h)可見典型的凋亡形態(tài)學特征;酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)檢測表現(xiàn)為隨PTE濃度升高,Caspase-3活性逐步升高(P<0.01);Western blot檢測顯示PTE可以使Fas、FasL蛋白表達顯著增加(P<0.01)。結論:PTE可誘導膠質(zhì)瘤細胞系C6細胞凋亡,其作用機制可能與激活Fas/FasL通路、上調(diào)Caspase-3活性有關。

    【關鍵詞】 紫檀芪; 膠質(zhì)瘤細胞; 細胞凋亡; Fas/FasL; Caspase-3

    【Abstract】 Objective:To investigate the effect of pterostilbene(PTE) on the proliferation and apoptosis of glioma cell C6 in vitro,to probe into its mechanism.Method:MTT method was used to detect the survival rate of cells,using AO/EB fluorescent staining methods to observe apoptotic morphological changes of C6 cells.The enzymatic acitivity of Csapase-3 was measured by ELISA.The protein levels of Fas and FasL were detected by Western blot.Result:MTT result showed that PTE can effectively inhibit the proliferation of C6(P<0.01),these effects were showed to be time-and dose-dependent.The result of AO/EB fluorescent staining(24 h) showed that C6 treated by PTE was seen typical apoptotic morphological features.Besides,the enzymatic activity of Csapase-3 was promoted obviously after the effect of PTE on C6 cells by ELISA(P<0.01).The result of Western blot showed that the protein levels of Fas and FasL in the C6 were upgraded significantly(P<0.01). Conclusion:PTE can induce apoptosis of glioma cell C6,which is concerned with upgrading Fas and FasL,thereby affecting activation of apoptotic factor Caspase-3 protein.

    【Key words】 Pterostilbene; Glioma cells; Apoptosis; Fas/FasL; Caspase-3

    First-authors address:The First Affiliated Hospital of Jiamusi University,Jiamusi 154003,China

    doi:10.3969/j.issn.1674-4985.2017.01.005

    腦膠質(zhì)瘤作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤,發(fā)病率及死亡率居顱內(nèi)腫瘤之首,具有無控增殖、侵潤生長、易復發(fā)等特點[1-2]。目前腦膠質(zhì)瘤的治療方案主要是以手術切除為主,化療及放療為輔,盡管綜合以上各種治療手段,但膠質(zhì)瘤患者的中位生存期并無明顯改善,患者大多于明確診斷后1年內(nèi)死亡[3]。近年來,一些天然物質(zhì)( 青蒿琥酯、白藜蘆醇、雷公藤內(nèi)酯醇等)被逐漸應用于腫瘤的防治,其優(yōu)異的效果使人們越來越重視天然藥物在抗腫瘤方面的研究與應用[4-7]。目前關于白藜蘆醇抗腫瘤的研究很多,其可抑制多種惡性腫瘤細胞的生長[8-9]。紫檀芪(pterostilbene,PTE)作為白藜蘆醇的甲基化衍生物,與白藜蘆醇相比,具有更高的的生物活性[10],更好的安全性[11]。關于PTE治療腦膠質(zhì)瘤的研究國內(nèi)外目前尚無報道,本研究將以體外培養(yǎng)的腦膠質(zhì)瘤C6細胞系作為研究對象,觀察PTE對其增殖及凋亡的影響,從而為臨床藥物治療腦膠質(zhì)瘤提供新的思路與方法。現(xiàn)報道如下。

    1 材料與方法

    1.1 主要試劑與儀器 大鼠腦膠質(zhì)瘤C6細胞株(上海拜力生物科技有限公);PTE(南京世洲生物科技有限公司,純度>99%),用DMSO溶解。DMEM培養(yǎng)基,0.25%胰酶和胎牛血清(Hyclone公司);四甲基偶氮唑藍(methylthiazolyl tetrazolium,MTT)(上海碧云天生物技術有限公司);Fas、FasL抗體(北京中杉公司);β-actin 抗體(北京中杉公司);大鼠Caspase-3 Elisa試劑盒(上海恒遠生物科技有限公司)。Allegra 64R超低溫高速離心機(Beckman公司);Synergy HT全自動酶標儀(Bio-Tek公司);Tanon 5200圖像分析管理系統(tǒng)(上海天能科技有限公司);激光共聚焦顯微鏡(OLYMPUS)。

    1.2 方法

    1.2.1 細胞培養(yǎng) 將C6細胞用完全培養(yǎng)基(DMEM培養(yǎng)基、10%胎牛血清及1%雙抗)置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對數(shù)期備用。

    1.2.2 MTT法檢測PTE對C6細胞增殖的抑制作用 調(diào)整細胞濃度為5×107/L,96孔培養(yǎng)板中每孔加入100 μL,待其貼壁后,再加入PTE溶液100 μL,使PTE終濃度為10、20、40 μmol/L,對照組加入同體積含0.01%DMSO的完全培養(yǎng)基,分別培養(yǎng)24、48、72 h,加20 μL的MTT,4 h后棄上清,每孔加入DMSO 150 μL,在37 ℃恒溫搖床上震蕩10 min,酶標儀570/630 nm處測定各組OD值。

    1.2.3 AO/EB熒光染色法檢測細胞凋亡 C6細胞以3×107/L的濃度鋪100 μL于激光共聚焦培養(yǎng)皿,4 h后棄掉舊培養(yǎng)液,加入不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)4 h后,加入PTE(分組同1.2.2)繼續(xù)培養(yǎng)24 h。吸棄原培養(yǎng)液,用PBS洗滌3遍,加入AO/EB 雙熒光染色液100 μL(AO、EB的終濃度為5 μg/mL)。染色8 min后,吸棄染液,加PBS洗滌3遍,于激光共聚焦顯微鏡下觀察并記錄。

    1.2.4 Caspase-3活化程度的測定 取實驗組和對照組細胞(分組同1.2.2):用PBS洗滌2遍,離心(1200 r/min,3 min)收集的沉淀后加入裂解液,在冰上超聲裂解細胞后,于4 ℃,12 000 r/min離心10 min,吸取上清液備用。按BCA試劑盒說明書操作,計算各組中的蛋白濃度,取100 μL含150 μg蛋白的樣品,加入反應緩沖液100 μL,再加入10 μL Caspase-3熒光底物于恒溫箱中培養(yǎng)4 h,在405 nm波長測定其OD值。

    1.2.5 Western blot檢測Fas、FasL蛋白表達 以細胞密度為5×107/L, 接種于培養(yǎng)皿中,加入PTE(分組同1.2.2),培養(yǎng)24 h后,裂解細胞,按BCA試劑盒檢測樣品蛋白的濃度后,按30 μg體系加樣,垂直電泳,270 mA電轉膜70 min,封閉50 min,一抗孵育過夜,二抗孵育60 min,加入ECL發(fā)光液,Tanon 5200采集圖像,并對Western blot結果進行灰度掃描。

    1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 22.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,計量資料用(x±s)表示,比較采用t檢驗;計數(shù)資料以率(%)表示,比較采用 字2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結果

    2.1 MTT法測定PTE對C6細胞增殖的影響 不同濃度PTE( 10、20、40 μmol/L) 培養(yǎng)24、48、72 h后細胞存活率結果,見表1。由10、20、

    40 μmol/L的PTE對C6細胞作用48 h的抑制率分別為(45.88±0.74)%、(52.37±1.59)%、(63.97±1.47)%,可見隨著藥物濃度的升高,抑制作用逐漸增強,同時24、48、72 h半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為75.2、14.6、4.8 μmol/L,顯示隨著作用時間延長,抑制作用逐漸增強。上述結果表明PTE可以有效抑制C6細胞的增殖,結果呈濃度時間依賴性。

    2.2 激光共聚焦觀察C6細胞核形態(tài)改變 經(jīng)AO/EB

    熒光染色后,對照組的細胞核染色質(zhì)均被染成綠色,深淺不一致,同時細胞核仍呈正常形態(tài);經(jīng)10、20 μmol/L PTE處理24 h后細胞大多核染色質(zhì)染成綠色,染色增強,熒光更為明亮,呈固縮狀或圓珠狀,體積也較對照組的細胞大,為早期凋亡細胞;經(jīng)40 μmol/L PTE處理24 h后,有些細胞核染色質(zhì)被染成橘紅色,碎裂散布于胞漿中,細胞膜完整性遭到破壞,這些為晚期凋亡細胞。見圖1。隨著藥物濃度的增加,橘紅色熒光增強,被染細胞核的比例也隨之增高,同時細胞數(shù)目隨著減少,呈典型的凋亡特征。

    2.3 PTE對C6 細胞中Caspase-3活性影響 各濃度PTE組C6 細胞Caspase-3蛋白含量較對照組明顯升高,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01),見表2。

    2.4 Western blot檢測Fas、FasL的表達 Fas和FasL表達的蛋白水平隨著PTE濃度增加而增加,同時各指標在各組間表達水平比較,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01),見圖2,即PTE誘導 Fas和FasL蛋白的表達呈現(xiàn)劑量依賴性。

    3 討論

    腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生演化與細胞調(diào)控增殖、分化、凋亡三者的平衡失調(diào)相關聯(lián),是由多個基因、多個步驟、多個階段的共同作用[12],其中細胞增殖與凋亡的平衡失調(diào)在腦膠質(zhì)瘤發(fā)生過程中可能起著十分重要的作用[13]。有學者提出啟動腫瘤細胞自身凋亡機制,誘導腫瘤細胞凋亡對腫瘤治愈有重要的意義[14-15]。目前在哺乳動物中存在著內(nèi)源性線粒體途徑和外源性死亡受體途徑這兩條細胞凋亡途徑[16]。而Caspase-3是這2條信號途徑的關鍵通道,它的表達增加及活化標志著細胞啟動了凋亡機制[17]。Fas/FasL是腫瘤細胞中廣泛存在且極為重要的受體[18],作為體內(nèi)介導細胞凋亡的一對糖蛋白分子,在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要作用[19],F(xiàn)as與FasL配體結合后可通過 Fas分子啟動膜受體途徑信號,激活Caspase-3,最終啟動細胞凋亡信號途徑[20]。

    PTE作為一種天然物質(zhì),具有明確的抗腫瘤效應,與傳統(tǒng)的抗腫瘤藥物相比,其安全范圍很大,基本無不良反應[10-11],同時具有較好的脂溶性,極易通過血腦屏障[21]。有研究顯示PTE能通過線粒體途徑和死亡受體途徑傳遞凋亡信號,多靶點誘導細胞凋亡,最終發(fā)揮其抗腫瘤效應[22]。但是在不同的腫瘤細胞中,其具體作用方式及作用靶點仍不甚清楚。有學者指出PTE能通過促使線粒體膜電位去極化及上調(diào)Caspase-3活性來誘導人乳腺癌細胞凋亡[23]。

    本實驗經(jīng)AO/EB熒光染色法觀察到C6細胞核中可見典型的凋亡形態(tài)學特征。MTT的結果呈現(xiàn)出PTE對于C6膠質(zhì)瘤細胞的增殖抑制具有時間及濃度依賴性。為了進一步探討PTE誘導C6細胞凋亡的具體作用方式,對Caspase-3酶活性及Fas、FasL蛋白的表達進行了檢測:PTE作用于C6細胞24 h后Caspase-3活性顯著上升(P<0.01),F(xiàn)as、FasL蛋白表達明顯增加(P<0.01)。由此推斷,PTE誘導C6細胞凋亡的作用與調(diào)控死亡受體途徑的相關蛋白的表達存在一定的聯(lián)系。同時,可進一步提出猜想PTE能否干擾線粒體膜的穩(wěn)定性,并圍繞線粒體凋亡途徑是否也參與了PTE誘導C6膠質(zhì)瘤細胞凋亡進程,開展進一步的深入研究。

    綜上所述,PTE可能通過激活Fas/FasL通路,活化Caspase-3,從而抑制膠質(zhì)瘤細胞增殖并誘導其凋亡?;诒緦嶒炑芯砍晒?,PTE在腦膠質(zhì)瘤藥物治療領域中有很高的研究價值及開拓前景。

    參考文獻

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    (收稿日期:2016-09-01) (本文編輯:程旭然)

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