乳腺癌干細(xì)胞BLM、RecQ4蛋白表達(dá)變化及意義

魯媛，葛章文，劉杰麟

(貴州醫(yī)科大學(xué)，貴陽550004)

乳腺癌干細(xì)胞BLM、RecQ4蛋白表達(dá)變化及意義

魯媛，葛章文，劉杰麟

(貴州醫(yī)科大學(xué)，貴陽550004)

目的 探討乳腺癌干細(xì)胞BLM、RecQ4蛋白表達(dá)變化及其臨床意義。方法 采用無血清培養(yǎng)法從乳腺癌MDA-MB-435細(xì)胞中分離乳腺癌干細(xì)胞(以下稱干細(xì)胞)，并鑒定。觀察MDA-MB-435細(xì)胞裸鼠及干細(xì)胞成瘤能力，RT-PCR法檢測二者ATP結(jié)合盒膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白G2(ABCG2)mRNA相對表達(dá)量，Western blotting法和免疫組化法檢測二者BLM、RecQ4蛋白表達(dá)。結(jié)果 干細(xì)胞膜表面CD44+CD24-/low比例明顯高于、CD44+CD24+比例明顯低于MDA-MA-435細(xì)胞(P均<0.05)；兩種細(xì)胞膜表面CD44-CD24+、CD44-CD24-比例比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與接種相同密度MDA-MB-435細(xì)胞比較，接種干細(xì)胞的裸鼠成瘤時(shí)間早、腫瘤體積大；干細(xì)胞ABCG2 mRNA相對表達(dá)量為0.753±0.025，MDA-MB-435細(xì)胞為0.563±0.112；兩者比較P<0.05。干細(xì)胞BLM蛋白表達(dá)低、RecQ4蛋白表達(dá)高于MDA-MB-435細(xì)胞(P均<0.05)。結(jié)論 乳腺癌干細(xì)胞成瘤能力強(qiáng)；細(xì)胞BLM蛋白表達(dá)降低、RecQ4蛋白表達(dá)升高可能為其機(jī)制。

乳腺癌；無血清培養(yǎng)；乳腺癌干細(xì)胞；RecQ家族解旋酶

腫瘤干細(xì)胞學(xué)說認(rèn)為乳腺癌干細(xì)胞是乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的根源[1,2]。RecQ解旋酶是一種DNA解旋酶，人體中存在RecQL、BLM、WRN、RecQ4和RecQ5五種RecQ解旋酶，BLM、RecQ4突變將會導(dǎo)致相應(yīng)疾病的發(fā)生，患者存在基因型不穩(wěn)定和癌癥易患性等共同特征[3]。2013年9月～2015年7月，本研究觀察了乳腺癌干細(xì)胞(以下稱干細(xì)胞)BLM、RecQ4蛋白表達(dá)變化，現(xiàn)分析結(jié)果并探討其意義。

1 材料與方法

1.1 材料 細(xì)胞：乳腺癌MDA-MB-435細(xì)胞由法國醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院陸核教授饋贈。動物：雌性BALB/c系裸鼠18只，SPF級，4～6周齡，體質(zhì)量16～20 g，合格證號為S1K(黔)2002-0001，購于貴州醫(yī)科大學(xué)動物房。試劑：recombinant Human EGF、Recombinant Human FGF-Basic、B27 Supplement(50×) 均購自美國Peprotech公司，鼠抗人CD24-FITC抗體、兔抗人CD44-PE抗體、同型對照均購自美國eBioscience公司，RecQ4抗體、BLM抗體、RecQ5抗體和β-actin抗體均購自美國Proteintech公司。

1.2 干細(xì)胞分離及鑒定

1.2.1 干細(xì)胞分離 采用無血清培養(yǎng)法。取對數(shù)生長期MDA-MB-435細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞2次，吸盡PBS液，加入胰酶消化2～3 min。采用含10% FBS的DMEM/F12(1∶1)培養(yǎng)基中止消化，800～1 000 r/min離心5 min，棄上清。采用含10% FBS的DMEM/F12(1∶1)培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，臺盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)。將細(xì)胞以2×104個(gè)/mL接種至培養(yǎng)瓶，加入含生長因子的無血清DMEM/F12(1∶1)培養(yǎng)基至8～10 mL，放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中懸浮培養(yǎng)。采取半換液法進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)基顏色變黃時(shí)，進(jìn)行全換液法培養(yǎng)。懸浮培養(yǎng)3～4周，200倍光鏡下觀察其生長情況可見：存活下來的MDA-MB-435細(xì)胞(簡稱分離細(xì)胞)在完全培養(yǎng)基中貼壁生長，呈長梭形；轉(zhuǎn)入無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)后，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長，細(xì)胞由梭形變?yōu)閳A形，呈懸浮生長，并成串形成微球體，細(xì)胞數(shù)量逐漸增多。

1.2.2 干細(xì)胞鑒定 將MDA-MB-435細(xì)胞去掉培養(yǎng)基后PBS沖洗2次，胰酶消化細(xì)胞。將懸浮細(xì)胞移入離心管中，800～1 000 r/min離心5 min，棄上清。將其與1.2.1中的分離細(xì)胞采用PBS沖洗2遍，重懸成密度為2×107個(gè)/mL的單細(xì)胞懸液。各取50 μL單細(xì)胞懸液于離心管中，分別加入50 μL PBS混勻，同時(shí)設(shè)實(shí)驗(yàn)管、空白管、同型對照管。實(shí)驗(yàn)管中加入5 μL CD44-FITC、0.625 μL CD24-PE，4 ℃避光孵育30 min。PBS沖洗2遍，加入500 μL PBS重懸細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液。空白管不加入抗體，同型對照管加入同型對照抗體，其余步驟同實(shí)驗(yàn)管。采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞膜表面CD44 CD24各表型細(xì)胞比例，包括CD44-CD24+、CD44-CD24-、CD44 + CD24-/low、CD44+CD24+(其中CD44+CD24-/low為干細(xì)胞表面標(biāo)志物)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。結(jié)果顯示，分離細(xì)胞膜表面CD44+CD24-/low比例明顯高于、CD44+CD24+比例明顯低于乳腺癌MDA-MB-435細(xì)胞(P均<0.05)；兩種細(xì)胞膜表面CD44-CD24+、CD44-CD24-比例比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；見表1。證實(shí)分離細(xì)胞為干細(xì)胞。

表1 MDA-MB-435及分離細(xì)胞膜表面CD44CD24各表型細(xì)胞比例比較±s)

注：與MDA-MB-435細(xì)胞比較，*P<0.05。

1.3 相關(guān)指標(biāo)觀察

1.3.1 成瘤能力 參照上述方法將MDA-MB-435細(xì)胞和干細(xì)胞分別制成單細(xì)胞懸液，臺盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，分別將其密度調(diào)整為1×105、1×104、1×103個(gè)/mL，4 ℃條件下保存。將18只雌性裸鼠隨機(jī)分為6組，每組3只。各組均于兩側(cè)腋窩分別皮下注射上述密度的MDA-MB-435細(xì)胞和干細(xì)胞懸液100 μL。接種后將裸鼠送回SPF級飼養(yǎng)室飼養(yǎng)，每天定時(shí)觀察腫瘤生長情況，記錄成瘤時(shí)間。每周固定時(shí)間采用游標(biāo)卡尺測量腫瘤結(jié)節(jié)的最長徑(a)和垂直方向最短徑(b)，計(jì)算腫瘤體積(V)，V=0.5ab2，共12周。

1.3.2 ATP結(jié)合盒膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白G2(ABCG2)mRNA表達(dá) 采用RT-PCR法檢測。取MDA-MB-435細(xì)胞和干細(xì)胞分別加入裂解液，用加樣器吹打數(shù)次，15～30 ℃放置5 min。按照總RNA提取試劑盒說明書提取總RNA，采用M-MLV第一鏈合成系統(tǒng)試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。ABCG2上游引物：5′-TTAGGATTGAAGCCAAAGG-3′，下游引物：5′-TAGGCAATTGTGAGGCAATGAG-3′，擴(kuò)增長度446 bp；以β-actin為內(nèi)參，上游引物：5′-GTCATCACCATTGGCAATGAG-3′，下游引物：5′-CGTCACACTTCATGATGGAGTT-3′，擴(kuò)增長度121 bp。PCR反應(yīng)體系25 μL：上游引物(10 μmol/L)1 μL，下游引物(10 μmol/L)1 μL，2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，cDNA 2 μL(0. 2 μg)，去離子水補(bǔ)足至25 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)；70 ℃延伸10 min。采用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，120 V電泳30 min。凝膠成像儀進(jìn)行拍照，Image-Pro Plus 6.0軟件分析灰度值。以目的基因與β-actin基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶灰度值的比值計(jì)算ABCG2 mRNA相對表達(dá)量。

1.3.3 BLM、RecQ4蛋白表達(dá) ①Western blotting法：采用蛋白抽提試劑盒提取MDA-MB-435細(xì)胞和干細(xì)胞總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量。配制8% SDS-PAGE、12% SDS-PAGE分離膠和5%濃縮膠，濃縮膠電泳80 V，分離膠電泳120 V，當(dāng)溴酚藍(lán)剛跑出即可終止電泳。PVDF轉(zhuǎn)膜，室溫下脫色搖床上搖動封閉1 h。加入一抗(1∶1 000)4 ℃孵育過夜，次日在室溫下脫色搖床上搖動孵育1 h，TBST沖洗3次。加入HRP標(biāo)記羊抗兔IgG(1∶2 000)，室溫下孵育1 h，TBST沖洗3次，進(jìn)行電泳蛋白條帶顯影。以Histone H3.1為內(nèi)參，采用掃描儀將膠片結(jié)果進(jìn)行掃描，凝膠圖象處理系統(tǒng)分析灰度值。以目的蛋白和內(nèi)參蛋白灰度值的比值計(jì)算BLM、RecQ4蛋白相對表達(dá)量。②免疫組化法：將MDA-MB-43細(xì)胞和干細(xì)胞用預(yù)溫的PBS沖洗3次，每次10 min。加入4%多聚甲醛室溫固定20～30 min，PBS沖洗3次，每次10 min。采用0.2% TritonX-100透化10 min，加入5%羊血清室溫封閉30 min。加入BLM、RecQ5抗體(用1%羊血清稀釋)，4 ℃過夜。PBS沖洗3次后加入Cy3標(biāo)記的山羊抗兔IgG(用1%羊血清稀釋)，室溫避光孵育30 min。采用PBS沖洗3次，加入1% Hoechst33342(用PBS稀釋)，室溫避光孵育5 min，PBS沖洗3次，每次10 min。加入抗熒光衰減劑，95%甘油封片。熒光顯微鏡下拍照，采用Image J軟件分析光密度值。

2 結(jié)果

2.1 成瘤能力 接種1×105個(gè)/mL MDA-MB-435細(xì)胞的裸鼠于接種后第36天出現(xiàn)結(jié)節(jié)，接種1×105、1×104個(gè)/mL干細(xì)胞的裸鼠分別于接種后第23、30天出現(xiàn)結(jié)節(jié)，并逐漸增大。接種1×104、1×103個(gè)/mL MDA-MB-435細(xì)胞和接種1×103個(gè)/mL干細(xì)胞的裸鼠均未成瘤。與接種相同密度MDA-MB-435細(xì)胞比較，接種干細(xì)胞的裸鼠成瘤時(shí)間早、腫瘤體積大。裸鼠接種不同密度MDA-MB-435細(xì)胞和干細(xì)胞后1～3周均未成瘤，裸鼠接種MDA-MB-435細(xì)胞和干細(xì)胞后4～12周成瘤體積比較見表2。

表2 裸鼠接種MDA-MB-435細(xì)胞和干細(xì)胞后4～12周成瘤體積比較

注：與MDA-MB-435細(xì)胞同濃度、同時(shí)間比較，*P<0.01。

2.2 ABCG2 mRNA表達(dá) 干細(xì)胞及MDA-MB-435細(xì)胞ABCG2 mRNA相對表達(dá)量分別為0.753±0.025、0.563±0.112；兩者比較P<0.05。

2.3 BLM、RecQ4蛋白表達(dá) Western blotting法：干細(xì)胞及MDA-MB-435細(xì)胞BLM蛋白相對表達(dá)量分別為0.92±0.01、0.77±0.03，RecQ4蛋白相對表達(dá)量分別為0.78±0.01、0.95±0.03，兩者比較P均<0.05。免疫組化法：干細(xì)胞及MDA-MB-435細(xì)胞BLM蛋白表達(dá)(光密度值)分別為0.042±0.002、0.032±0.001，RecQ4蛋白表達(dá)分別為0.056±0.002、0.076±0.001，兩者比較P均<0.05。

3 討論

朱敬之等[4]在無血清培養(yǎng)基中添加了bFGF、EGF、B27等只維持細(xì)胞生存的必需營養(yǎng)物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)可使腫瘤干細(xì)胞增殖而形成微球體，維持不分化的狀態(tài)；而非腫瘤干細(xì)胞則貼壁生長，最后死亡。本研究采用無血清培養(yǎng)法富集MDA-MB-435細(xì)胞中的干細(xì)胞，研究結(jié)果顯示，干細(xì)胞CD44+/CD24-/low比例明顯高于MDA-MB-435細(xì)胞，說明成功從MDA-MB-435細(xì)胞中篩選出干細(xì)胞。

研究證實(shí)，腫瘤干細(xì)胞能在裸鼠體內(nèi)形成完整的惡性腫瘤，并且有與原發(fā)腫瘤相似的組織學(xué)特性；體內(nèi)高致瘤性是腫瘤干細(xì)胞重要的特性之一。郭崇勇等[5]研究表明，富集的腫瘤干細(xì)胞體內(nèi)成瘤性明顯高于乳腺癌MCF-7細(xì)胞。本研究裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與MDA-MB-435細(xì)胞比較，接種同樣密度干細(xì)胞的裸鼠成瘤時(shí)間早、腫瘤體積較大。ABCG2是一種多藥耐藥基因，均可以作為各種來源干細(xì)胞的重要標(biāo)志物，在腫瘤干細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移中扮演重要角色[6]。Hiraga等[7]研究發(fā)現(xiàn)，MDA-MB-231細(xì)胞中ABCG2 mRNA在側(cè)群細(xì)胞的表達(dá)明顯高于非側(cè)群細(xì)胞。本研究結(jié)果顯示，干細(xì)胞ABCG2 mRNA相對表達(dá)量明顯高于MDA-MB-435細(xì)胞。以上說明乳腺癌干細(xì)胞具有高成瘤能力和高耐藥性。

RecQ解旋酶是一個(gè)高度保守的蛋白質(zhì)家族，在保持基因組的完整性上具有關(guān)鍵作用。Sassi等[8]研究發(fā)現(xiàn)，BLM基因突變可能與乳腺癌的發(fā)生有關(guān)。RecQ4與p53可阻止mtDNA的不穩(wěn)定性，從而抑制腫瘤的發(fā)生[9]。RecQ4被認(rèn)為與血液惡性腫瘤的發(fā)生相關(guān)，還可通過與生存素結(jié)合而避免乳腺癌細(xì)胞凋亡[10]。但不僅RecQ4的突變會導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，其過量表達(dá)也會引骨肉瘤、前列腺癌、乳腺癌和宮頸癌等腫瘤的發(fā)生[11,12]。研究表明，RecQ4在乳腺癌細(xì)胞中呈高表達(dá)，其與生存素結(jié)合而抑制乳腺癌細(xì)胞的凋亡[13]。Lao等[14]研究表明，在直腸癌組織中BLM和RecQ4表達(dá)均增加。本研究Western blotting法和免疫組化法檢測結(jié)果均顯示，干細(xì)胞BLM蛋白表達(dá)低于MDA-MB-435細(xì)胞，RecQ4蛋白表達(dá)高于MDA-MB-435細(xì)胞。

綜上所述，乳腺癌干細(xì)胞BLM蛋白表達(dá)降低、RecQ4蛋白表達(dá)升高，可能與其耐藥性和成瘤能力強(qiáng)有關(guān)。

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Expression changes and significance of BLM and RecQ4 helicases in breast cancer stem cells

LUYuan,GEZhangwen,LIUJielin

(GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,China)

Objective To investigate the expression changes of BLM and RecQ4 helicases in breast cancer stem cells. Methods Breast cancer stem cells were screened from breast cancer MDA-MB-435 cells and were cultured in serum-free medium. The tumorigenicity of breast cancer stem cells and MDA-MB-435 cells was observed by tumor formation in nude mice. The drug resistance gene ATP-binding cassette transporter G2(ABCG2)mRNA of stem cells was detected by RT-PCR. The protein expression of BLM and RecQ4 was detected in breast cancer MDA-MB-435 cells and their stem cells by Western Blotting and fluorescent staining. Results The proportion of surface markers CD44+CD24-/lowin cancer stem cells was significantly higher, but the proportion of membrane surface CD44+CD24+was significantly lower than that of MDA-MB-435 cells (allP<0.05). No statistical significance was found in the proportions of cell membrane surface CD44-CD24+and CD44-CD24-between these two kinds of cells (allP<0.05). The mRNA expression of ABCG2 was 0.753±0.025 in stem cells, and it was 0.563±0.112 in the breast cancer MDA-MB-435 cells (P<0.05). Compared with the nude mice inoculated with the same density of MDA-MB-435 cells, the nude mice inoculated with stem cells had an early tumor formation time and a large tumor volume. The BLM protein expression of stem cells was lower and RecQ4 protein expression was higher than that of MDA-MB-435 cells (allP<0.05). Conclusion The tumorigenicity is high in breast cancer stem cells, which may be associated with low expression of BLM and high expression of RecQ4 in breast cancer stem cells.

breast carcinoma; serum-free culture; breast cancer stem cells; RecQ family helicases

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81360349)；貴州省優(yōu)秀科技教育人才省長專項(xiàng)基金資助項(xiàng)目[黔科合字(2006)57號]。

魯媛(1987-)，女，碩士，研究方向?yàn)槟[瘤免疫學(xué)。E-mail: luyuanuse@163.com

劉杰麟(1963-)，男，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)榕R床免疫學(xué)。E-mail： liujlin63@yahoo.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.04.003

R392.9

A

1002-266X(2017)04-0017-04

2015-02-03)