HPLC法測定蒙藥復方五味清濁散中鞣花酸含量

蘇都娜 策力木格 侯彥宏 圖 雅 聶 波

1.內蒙古民族大學蒙醫(yī)藥學院，內蒙古 通遼 028000；2.內蒙古醫(yī)科大學蒙醫(yī)藥學院，內蒙古 呼和浩特 010110；3.北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院，北京 100027；4.中國中醫(yī)科學院中醫(yī)藥發(fā)展研究中心，北京 100700；5.北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院，中醫(yī)內科學教育部和北京重點實驗室，北京 100700

HPLC法測定蒙藥復方五味清濁散中鞣花酸含量

蘇都娜1策力木格2侯彥宏3圖 雅4*聶 波5*

1.內蒙古民族大學蒙醫(yī)藥學院，內蒙古 通遼 028000；2.內蒙古醫(yī)科大學蒙醫(yī)藥學院，內蒙古 呼和浩特 010110；3.北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院，北京 100027；4.中國中醫(yī)科學院中醫(yī)藥發(fā)展研究中心，北京 100700；5.北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院，中醫(yī)內科學教育部和北京重點實驗室，北京 100700

目的：建立蒙藥復方五味清濁散中的鞣花酸含量測定方法。方法：采用HPLC方法，色譜柱為依利特BETASIL (250mm × 4.6mm，5μm)，柱溫40℃；流動相為乙腈-0.2%磷酸溶液(21∶79)；流速1mL/min；檢測波長為254nm。結果：蒙藥復方五味清濁散中鞣花酸在3.1625～202.4μg/mL范圍內與峰面積程良好線性關系。回歸方程為：Y=67818X-253716，R=0.9997。平均加樣回收率為99.61%，RSD=2.37%。結論：該方法簡單、準確、重復性好，可用于測定蒙藥復方五味清濁散中鞣質的含量。

蒙藥復方五味清濁散；鞣花酸；HPLC；含量測定

五味清濁散為蒙醫(yī)臨床常用藥之一，由全石榴、紅花、豆蔻、肉桂、蓽茇五味藥等藥物組成，具有開郁消食、暖胃的作用，臨床用于治療食欲不振、消化不良、胃脘冷痛、滿悶噯氣、腹脹泄瀉等病癥。該復方收載于2015版《中華人民共和國藥典》(一部)，但《藥典》只有性狀鑒別和薄層色譜法檢查方法等，無含量測定方法[1]。五味清濁散中熊果酸、胡椒堿、沒食子酸、蓽茇明寧堿、紅花羥基黃色素A、蓽茇寧等的含量測定方法已有報道[2-8]，但其復方中主要藥全石榴的有效成分鞣花酸的含量測定未見有報道。石榴含有多酚類、黃酮類、生物堿和有機酸及其他多種成分，其中具有代表性的化學成分有沒食子酸、石榴皮鞣質、鞣花酸、安石榴苷、兒茶素、原花青素B1、原花青素B2、石榴皮素A、石榴皮素B等[9-12]。因此，研究五味清濁散中鞣花酸的HPLC測定方法，為完善其質量標準提供參考數(shù)據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 LC-10Avp高效液相色譜儀(SPD-M10Avp紫外-可見二極管陣列檢測器、Rheodyne 7725i手動進樣閥、CTO-10ASvp柱溫箱、2個LC-10ATvp輸送泵，日本島津)；超聲波清洗器(新芝SB-5200)；超純水機(美國ADVANTAGE 007NL0048)；電子天平(島津AEG-40SM)。

1.2 材料 鞣花酸標準品(批號：R-004-151216，含量以98%為計，成都瑞芬恩生物科技有限公司)；五味清濁散(批號：20150140，阜新蒙藥有限責任公司)。磷酸、乙腈為色譜純；水為超純水；其他試劑為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑依利特BETASIL C18(250mm×4.6mm，5μm)，柱溫40℃；流動相為乙腈-0.2%磷酸溶液(21∶79)，流速1mL/min；檢測波長254nm。

2.2 溶液制備

2.2.1 標準品溶液制備 取鞣花酸標準品精密稱定，加入甲醇，超聲溶解，補足甲醇至定量刻度，制成每1mL含鞣花酸202.4μg的標準品溶液，備用。

2.2.2 供試品溶液制備 取五味清濁散0.375g(約相當全石榴0.2g)，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50mL，精密稱定，超聲40min，放冷至室溫，精密稱定，補足減失的溶劑，搖勻，用0.45μm濾膜過濾取續(xù)濾液，備用。

2.2.3 陰性供試品溶液制備 根據(jù)五味清濁散的處方和制法，制備成不含有全石榴的五味清濁散，當做鞣花酸標準品的陰性樣品。取陰性樣品適量(約相當于全石榴0.2g)，按供試品溶液制備的方法制備陰性供試品溶液。

2.3 線性關系 按2.2.1的制備方法制備并稀釋成3.1625、6.325、12.65、25.3、50.6、101.2、202.4μg/mL的標準品溶液，分別各取5μL進樣，以進樣濃度(X)對峰面積(Y)的線性回歸，回歸方程為：Y=67818X-253716，R=0.9997，顯示鞣花酸在3.1625～202.4μg/mL范圍內與峰面積程良好線性關系。

2.4 精密度試驗 按2.2.1的制備方法制備鞣花酸標準溶液，連續(xù)重復進樣5次，記錄鞣花酸的峰面積為精密度，RSD=1.84%。

2.5 干擾試驗 在上述色譜條件下，取鞣花酸標準品溶液、陰性供試品溶液和五味清濁散供試品溶液各5μL，注入液相色譜儀中，記錄圖譜，結果如圖A、圖B、圖C所示。證明五味清濁散中的其他成分不會對鞣花酸的測定造成干擾。

2.6 重復性試驗 按2.2.2的制備方法制備6份五味清濁散溶液，通過鞣花酸峰面積計算出質量濃度分別為88.52、87.82、87.16、90.48、87.16、87.48mg/mL，RSD=1.44%，計算得五味清濁散中鞣花酸的平均含量為11.75mg/g。

2.7 穩(wěn)定性試驗 按2.2.2的制備方法制備五味清濁散溶液，分別于0、0.5、1、2、4、9h內重復進樣6次，按鞣花酸峰面積計算的RSD=1.94%，表明五味清濁散供試品溶液在9h內穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗 精密稱取9份五味清濁散0.15g，置具塞錐形瓶中，每3份分別精密加入鞣花酸溶液9.4mg、11.75mg、14.1mg，加入甲醇20mL，精密稱定，超聲40min，放冷至室溫，精密稱定，補足減失的溶劑，搖勻，用0.45μm濾膜過濾取續(xù)濾液，分別取5μL進樣，測定鞣花酸峰面積，并計算回收率，結果見表1。

表1 加樣回收率試驗結果 (n=9)

2.9 含量測定 按以上方法分別制備鞣花酸標準品溶液與五味清濁散供試品溶液，外標法計算得五味清濁散(批號：20150140)中鞣花酸的含量，見表2。

表2 五味清濁散中鞣花酸含量 (n=4)

3 討論

供試品溶液制備方法中五味清濁散的取樣量(0.375g約相當全石榴0.2g)、提取溶劑及其用量(甲醇50mL)、促溶條件(超聲40min)和在254nm波長處測定是參考文獻[1、6]中的方法并經(jīng)本試驗驗證可行后確定，但《中國藥典》2015版中并沒有表明柱溫一項，本研究通過30℃、35℃、40℃、45℃的柱溫條件的篩選，發(fā)現(xiàn)40℃柱溫下出峰較好。

選用Agilent ZORBAX ODS(250mm×4.6 mm,5μm)和依利特BETASIL C18(250mm×4.6 mm，5μm)兩種色譜柱，比較所得圖譜后發(fā)現(xiàn)前者拖尾嚴重，因此選用后者。

五味清濁散是由全石榴400g，紅花200g，豆蔻50g，肉桂50g，蓽茇50g組成[1]，但其復方中主要藥全石榴的有效成分鞣花酸的含量測定未見有報道，通過該方法可測定蒙藥復方五味清濁散中鞣質的含量，并證明該方法簡單、準確、重復性好。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2015.

[2]高磊，旭紅，王曉慧.當瑪-5膠囊含量測定方法的研究[J].中國民族醫(yī)藥雜志，2002，8(4):44-44.

[3]包同力嘎，包桂花，阿拉騰花.HPLC法測定蒙藥五味清濁散中胡椒堿的含量[J].中華中醫(yī)藥學刊，2008，26(4):865-866.

[4]周凱，鞠愛華，田景民.五味清濁膠囊質量標準研究[J].中國民族醫(yī)藥雜志，2008,14(12):61-63.

[5]巴俊杰，荀雅書，聶春曉，等.五味清濁散質量標準研究[J].中成藥，2008,30(12):1864-1865.

[6]譚生建，賀業(yè)謙，王杰松，等.HPLC法測定五味清濁散中羥基紅花黃色素A的含量[J].中國藥師，2012,15(2):205-207.

[7]畢贏，劉軍輝，羅容，等.HPLC同時測定蓽茇中胡椒堿和蓽茇明寧堿含量[J].中國實驗方劑學雜志，2012,18(1):47-50.

[8]寶貴榮，孟和，胡長峰，等.HPLC法同時測定蒙藥通拉嘎-5中胡椒堿和蓽茇寧的含量[J].國際藥學研究雜志，2013,40(1):108-110.

[9]蔡霞，劉悅，張芳芳，等.石榴的化學成分與質量控制研究進展[J].世界科學技術-中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2014,16(1):123-129.

[10]胡正梅，馬清河.石榴的化學成分及藥理活性研究進展[J].新疆中醫(yī)藥，2015,33(1):74-77.

[11]李鳳華，王寅，盧艷敏，等.石榴化學成分及生理活性研究進展[J].中國果菜，2015,35(2):28-32.

[12]閆恒，張輝.石榴化學成分及其藥理作用研究進展[J].中國處方藥，2016,14(2):18-19.

Mongolian Medicine Wuwei Qingzhuo Powders in the HPLC Method for Determination of Ellagic Acid Content

SU Duna1CEli Muge2HOU Yanhong3TU Ya4NIE Bo5*

1.Mongolian Medicine College of Pharmacy,Inner MongoliaUniversity for Nationalities,Tongliao 028000,China;2.Mongolian Medicine College of Pharmacy,Inner Mongolia Medical University,Huhehaote 010110,China;3.Dongzhimen Hospital,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100027,China;4.Development Research Center of Traditional Chinese Medicine;China Academy of Chinese Medical Sciences,Beijing 100070,China;5.Key Laboratory of Chinese Internal Medicine of Ministry of Education and Beijing,Dongzhimen Hospital,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100070,China

Objective To establish an HPLC quantitative method for the Ellagic acid in Mongolian medicine Wuwei Qingzhuo powders.Methods HPLC was used for Ellagic acid.The chromatography column was Elite BETASIL C18(250mm×4.6mm,5μm) and the column temperature was 40℃.The mobile phase was acetonitrile-0.2%phosphoric acid(21∶79).The flow rate was 1mL/minand the detection wavelength was at 254nm．Results The regress equation for Ellagic acid was as the following:Y=67818X-253716(R=0.9997),and the linear range was 3.1625～202.4μg/mL.Theaverage recovery of Ellagic acid was 99.61%，RSD=2.37%.Conclusion This method is simple and convenient operation,is suitable for the Mongolian medicine Wuwei Qingzhuo powdersEllagic acid content determination.

Mongolian Medicine Wuwei Qingzhuo Powders;Ellagicacid;HPLC;Content Determination

國家自然科學基金項目面上項目-基于草烏減毒效應的訶子化學成分及緩和藥性特征的相關研究(項目編號：81274192)。

蘇都娜(1989-)，女，蒙古族，碩士研究生，研究方向為中藥藥效物質基礎研究。E-mail：308381386@qq.com

聶波(1977-)，女，漢族，博士，副教授，研究方向為中藥藥理與中藥體內代謝研究。E-mail：nieboww_1977@163.com

圖雅(1966-)，蒙古族，博士，教授，研究方向為民族藥(中藥)藥效物質基礎研究及相關政策研究。E-mail：tuya126@126.com

R29

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1007-8517(2017)03-0040-03

2016-11-24 編輯：穆麗華)