藏藥仁青芒覺和幫間久埃對金黃色葡萄球菌的增殖抑制作用

賀 平 旦增群培 王世華 袁東亞*

1.西藏民族大學(xué)醫(yī)學(xué)院，陜西 咸陽 712082；2.西藏自治區(qū)達(dá)孜縣章多鄉(xiāng)衛(wèi)生院，西藏 達(dá)孜 850100

藏藥仁青芒覺和幫間久埃對金黃色葡萄球菌的增殖抑制作用

賀 平1旦增群培2王世華1袁東亞1*

1.西藏民族大學(xué)醫(yī)學(xué)院，陜西 咸陽 712082；2.西藏自治區(qū)達(dá)孜縣章多鄉(xiāng)衛(wèi)生院，西藏 達(dá)孜 850100

目的：觀察分析藏藥仁青芒覺和幫間久埃對金黃色葡萄球菌的抑菌作用，為臨床科學(xué)用藥提供依據(jù)。方法：采用瓊脂打孔法研究兩種藥物對6株金黃色葡萄球菌的抑菌作用，連續(xù)記錄藥物作用36h的菌液吸光度A600nm，繪制細(xì)菌生長曲線。結(jié)果：仁青芒覺、幫間久埃能夠明顯抑制金黃色葡萄球菌增殖，耐藥菌株的抑菌圈直徑與標(biāo)準(zhǔn)菌株基本一致。結(jié)論：二者對耐藥性金黃色葡萄球菌均具有顯著的抑菌作用，提示其較好的臨床應(yīng)用前景。

藏藥；仁青芒覺；幫間久埃；金黃色葡萄球菌；抑菌作用

由于抗生素的不合理使用，導(dǎo)致耐藥菌株不斷出現(xiàn)并廣泛傳播，使藥物對耐藥菌株的臨床療效降低或無效，目前耐藥菌株感染已經(jīng)成為臨床治療的棘手問題。金黃色葡萄球菌廣泛存在于自然界，是影響食品安全和化膿性感染中最常見的病原菌[1]。其中，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)自1961年在英國發(fā)現(xiàn)以來，現(xiàn)已遍及世界各地，成為全球重要的致病菌和研究熱點[2]。

藏藥是我國傳統(tǒng)醫(yī)藥寶庫的重要組成部分，在治療感染性疾病方面有悠久的歷史，而且藥材資源非常豐富，故開發(fā)新型抗菌藥物成為國內(nèi)外研究的焦點。仁青芒覺系名貴藏藥方劑，藏醫(yī)巨著《四部醫(yī)典》中記載：“中毒者特效芒覺也”，被譽為“解毒仙丹”[3]。仁青芒覺治療食物中毒、腹瀉、急慢性胃炎等消化系統(tǒng)疾病已有上千年的歷史[4]。幫間久埃為藏醫(yī)經(jīng)典方劑，始載于藏醫(yī)巨著《四部醫(yī)典》，氣微香，味甘、辛、苦，具有清熱利肺、止咳化痰、平喘之功效[5]。兩種藥物臨床療效確切，但是藥理機制研究甚少，本文探討了二者對金黃色葡萄球菌的增殖抑制作用。

1 儀器與材料

1.1 儀器 酶標(biāo)儀(TECAN Sunrise)；BHC-1300Ⅱ超凈工作臺(蘇凈集團(tuán))；Dade AutoScan-4細(xì)菌鑒定系統(tǒng)；低溫高速離心機(Thermo)、PH140A培養(yǎng)箱(上海一恒)；DENVER T-214電子天平；GZX-9070 MBE干燥箱、游標(biāo)卡尺；YXQ-LS-75S壓力蒸汽滅菌器(上海博訊)；ZH-2渦旋器。

1.2 藥物 幫間久埃購于拉薩市雪域大藥房(批號：2014206)；仁青芒覺購于西藏民族大學(xué)附屬醫(yī)院(批號：12479A)。標(biāo)準(zhǔn)藥敏紙片：青霉素、卡那霉素、紅霉素(康泰生物有限公司)。M-H瓊脂和M-H肉湯(杭州微生物試劑有限公司)，內(nèi)毒素檢測用水(湛江博康海洋生物有限公司)。

1.3 受試菌株 金黃色葡萄球菌ATCC25923 (Staphylococcus aureus)由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院提供。5株耐甲氧西林金黃色葡萄球菌由咸陽市某醫(yī)院檢驗科提供，菌株耐藥情況由微生物自動分析儀鑒定。

2 方法

2.1 藥物準(zhǔn)備 用電子天平準(zhǔn)確稱量藥物，在100mL純水中浸泡30min，文火煮沸30min，冷卻后4000轉(zhuǎn)/分離心10min，取用上清液，然后用少量純水沖洗沉渣兩次并煮沸15min，沖洗液離心后取用上清液，最后將三次上清液混合并濃縮至1000mg/mL，用除菌濾器過濾后放置4℃?zhèn)溆谩?/p>

2.2 抑菌圈測定 參照文獻(xiàn)[6]用打孔器在瓊脂平板上等距離打6個孔(孔徑6.5mm)，將新鮮菌落配制的0.5～1.0比濁度的菌液均勻涂布于瓊脂平板，每孔加100μL藥液。設(shè)置600、200、60mg/mL三個濃度水平，卡那霉素與青霉素藥敏紙片作為對照。37℃孵育24h，用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑。每株菌做三個平行，求取抑菌圈平均值。

2.3 對細(xì)菌生長曲線的影響 參考文獻(xiàn)[7]略作修改，將受試菌株復(fù)蘇活化，培養(yǎng)至對數(shù)生長期，按照1%接種至液體培養(yǎng)基，37℃250 轉(zhuǎn)/分增菌培養(yǎng)30min；根據(jù)前期MIC結(jié)果[6,8]加入適量藥液，使終濃度分別為0mg/mL、6.25mg/mL(0.5 MIC)、12.5mg/mL(1 MIC)、25mg/mL(2MIC)。以加入藥物的時間為0h，間隔一定時間檢測菌液吸光度A600nm。以時間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制金黃色葡萄球菌36h的生長曲線。

3 結(jié)果

3.1 藥物抑菌作用 仁青芒覺和幫間久埃在3個濃度水平對6株金黃色葡萄球菌均有一定的抑菌作用。抑菌圈直徑大小與藥物濃度呈正相關(guān)，同種藥物不同劑量組之間的抑菌圈直徑具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)；兩種方劑在相同濃度水平對金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株和耐藥菌株的抑菌圈直徑基本一致，無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。對于金黃色葡萄球菌耐藥菌株，兩種方劑的抑菌圈直徑與青霉素組相比均具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。具體見表1。

表1 仁青芒覺對受試菌株的抑菌作用

注：“-”表示未形成抑菌圈；幫時間久埃抑菌數(shù)據(jù)自引于文獻(xiàn)[6]。

3.2 仁青芒覺對細(xì)菌生長曲線的影響 圖1直觀地反映了仁青芒覺對金黃色葡萄球菌生長曲線的影響。與對照組相比，在6.25mg/mL時，仁青芒覺對金黃色葡萄球菌進(jìn)入對數(shù)生長期(2h)和平臺期的延續(xù)時間(8～24h)均沒有顯著改變；在12.5mg/mL時，延遲了細(xì)菌生長進(jìn)入平臺期的時間(12h)。當(dāng)濃度提高至25mg/mL時，藥物能夠顯著抑制細(xì)菌生長，未能形成對數(shù)期生長高峰。

3.3 幫間久埃對細(xì)菌生長曲線的影響 由圖2可知，幫間久埃對金黃色葡萄球菌生長曲線的影響與仁青芒覺相似。與對照組相比，幫間久埃在6.25mg/mL與12.5mg/mL時，對金黃色葡萄球菌進(jìn)入對數(shù)生長期和平臺期的延續(xù)時間并沒有顯著改變，其中12.5mg/mL組對細(xì)菌增殖略有抑制作用。當(dāng)濃度提高至25mg/mL時，該藥物能夠顯著抑制細(xì)菌生長，未形成對數(shù)期生長高峰。

4 討論

藏醫(yī)藥是中國傳統(tǒng)醫(yī)藥寶庫中的璀璨明珠，在漫長的醫(yī)藥實踐過程中形成了其獨特的理論體系和濃厚的民族特色，具有悠久的歷史和豐富的內(nèi)涵[9]。藏藥方劑仁青芒覺和幫間久埃對金黃色葡萄球菌的抑菌作用表明，兩種藥物的抑菌作用具有劑量依賴性，而且對標(biāo)準(zhǔn)菌株和耐藥菌株均具有顯著的抑菌效果，提示了較好的臨床應(yīng)用前景。與單一成分的抗生素不同，藏藥方劑成分比較復(fù)雜，而且作用靶點較多，不易產(chǎn)生耐藥性，為解決耐藥性金黃色葡萄球菌感染問題提供了新的思路。細(xì)菌生長曲線顯示仁青芒覺和幫間久埃能夠顯著抑制細(xì)菌生長繁殖，該結(jié)果與相關(guān)研究相似[7]，推測其增殖抑制作用與細(xì)菌結(jié)構(gòu)破壞引起的核酸、蛋白質(zhì)等重要成分有關(guān)，相關(guān)機制尚需進(jìn)一步驗證。

仁青芒覺由毛訶子、蒲桃、金腰草、檀香、西紅花、珊瑚、珍珠、牛黃、麝香、熊膽、松石等加工制成[3]。幫間久埃由白花龍膽、檀香、訶子(去核)、余甘子、石灰華、廣棗、丁香、肉豆蔻、沉香、巴夏嘎、無莖芥、甘草、毛訶子、木香、寬筋藤等藥材組成[5]。在諸多組分中，訶子為獨特的珍稀藏藥材，具有廣譜抗菌作用，研究證實訶子提取物對金黃色葡萄球菌具有顯著抑菌作用[10]。此外，紅花[11]、丁香[7,12]、甘草[13]等藥材的提取物均對金黃色葡萄球菌具有一定的抑菌作用。本文抑菌實驗結(jié)果與上述方劑組分的報道相一致，為仁青芒覺和幫間久埃的深入研究提供了理論基礎(chǔ)。藏醫(yī)藥是一個巨大的寶庫，具有廣闊的開發(fā)前景，仍需在深度和廣度上不斷進(jìn)行研發(fā)。

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Antibacterial Activity of Tibet Medicine Renqingmangjue and Bangjianjiuai Pills Against Staphylococcus Aureus

HE Ping1Ten Zin Choe Phel2WANG Shihua1YUAN Dongya1*

1.Medical School, Xizang Minzu University, Xianyang 712082, China；2.Zhangduo Health-center of Dazi County, Dazi 850100,China

Objective To investigate the antibacterial activity of Tibetan medicine Medicine Renqing mangjue and Bangjianjiuai pills against Staphylococcus aureus and provide theoretical basis for clinical application.Methods M-Hagar-punching method was adopted to research the antibacterial activity of two drugs against 6 strains of S.Aureus.Furthermore, the absorbance of culture medium mixed with drug was continuously recorded for 36h and growth curve of S.aureus was drawn.Results Renqingmangjue and Bangjianjiuaipills had obvious inhibitory activity on bacterial proliferation.The diameters of inhibition zone weresimilar between standardS.Aureus and multidrug-resistant strains.Conclusion Two drugs had significant antibacterial effect on multidrug-resistantS.aureusin vitro,which indicated potential prospects in clinical application.

Tibetan Medicine; Renqingmangjue; Bangjianjiuai; Staphylococcus Aureus; Antibacterial Activity

西藏自治區(qū)自然科學(xué)基金項目(2015ZR-13-23；2015ZR-14-13)；西藏民族大學(xué)校級科研項目(14myQ14)。

賀平(1982-)，男，漢族，碩士，講師，研究方向為藏藥抑菌作用。E-mail:hepingyixue@126.com

袁東亞(1962-)，男，漢族，本科，教授，研究方向為藏藥臨床應(yīng)用。E-mail: dy62@163.com

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1007-8517(2017)03-0033-03

2016-11-16 編輯：穆麗華)