納米零價(jià)鐵對(duì)耐四環(huán)素菌耐藥特性的影響

陸 賢,郭美婷*,張偉賢(1.同濟(jì)大學(xué)污染控制與資源化研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200092；2.同濟(jì)大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,上海 200092)

納米零價(jià)鐵對(duì)耐四環(huán)素菌耐藥特性的影響

陸 賢1,2,郭美婷1,2*,張偉賢1,2(1.同濟(jì)大學(xué)污染控制與資源化研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200092；2.同濟(jì)大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,上海 200092)

研究了納米零價(jià)鐵對(duì)污水中耐四環(huán)素菌的影響.在不同濃度、反應(yīng)時(shí)間和含氧條件下用納米零價(jià)鐵對(duì)耐藥細(xì)菌進(jìn)行處理.結(jié)果表明,當(dāng)納米零價(jià)鐵終濃度為5000mg/L,反應(yīng)時(shí)間為12h,厭氧條件下,納米零價(jià)鐵對(duì)耐四環(huán)素菌有較好的抑制效果.納米零價(jià)鐵對(duì)細(xì)菌的耐藥能力有消極作用,因而引起耐藥性的減弱.50mg/L濃度的納米零價(jià)鐵較大提高了基因轉(zhuǎn)移效率,為原來的2.15倍,因此需綜合評(píng)估納米零價(jià)鐵對(duì)耐藥性的影響.

納米零價(jià)鐵；耐四環(huán)素菌；耐藥特性；基因轉(zhuǎn)移

醫(yī)療和養(yǎng)殖等行業(yè)抗生素的過量使用極大加劇了細(xì)菌的耐藥性風(fēng)險(xiǎn),對(duì)公共健康和疾病預(yù)防治療帶來極大威脅.耐藥細(xì)菌的環(huán)境行為是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)問題之一,城市污水廠由于匯集多種抗生素及濃度較高的細(xì)菌,成為環(huán)境中耐藥污染物的重要儲(chǔ)存庫,已在污水中檢出多種類型的耐藥細(xì)菌及耐藥基因[1-2].

納米材料由于具有突出的理化特性近年來得到廣泛應(yīng)用.納米材料的環(huán)境影響,特別是生物效應(yīng)也引起廣泛關(guān)注.研究表明,納米材料對(duì)細(xì)菌具有明顯的生態(tài)毒性.Li等[3]發(fā)現(xiàn)新鮮合成的未負(fù)載的納米零價(jià)鐵在較低濃度下有毒性.納米材料對(duì)微生物的毒性可能受多種因素影響[4]. Cristian等[5]發(fā)現(xiàn)納米材料能使耐藥細(xì)菌光鈍化.納米材料可能導(dǎo)致細(xì)菌發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)破壞細(xì)胞[6].

污水是納米顆粒排放到環(huán)境的重要匯集地.已有多種納米顆粒在污水中被檢出,其濃度可達(dá)μg/L～mg/L[7-8].耐藥細(xì)菌作為特殊的微生物,毋庸置疑將受到納米材料的影響,可能對(duì)其后續(xù)生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)產(chǎn)生顯著變化.然而至今,納米顆粒對(duì)耐藥細(xì)菌歸趨的研究仍較少.本研究以納米零價(jià)鐵作為代表,考察其對(duì)耐四環(huán)素大腸桿菌歸趨特性的影響,從其生態(tài)毒性、耐藥特性和基因轉(zhuǎn)移特性影響等 3個(gè)方面評(píng)價(jià),以期為評(píng)價(jià)納米顆粒對(duì)耐藥細(xì)菌環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)的影響提供理論依據(jù).

1 材料和方法

1.1 納米零價(jià)鐵懸濁液的制備

納米零價(jià)鐵按照文獻(xiàn)[9]描述的方法進(jìn)行制備,即使用NaBH4和Fe(NO3)3?9H2O通過化學(xué)反應(yīng)制備.合成后的納米零價(jià)鐵顆粒用去離子水沖洗2次(4000r/min離心5min).制備的納米零價(jià)鐵儲(chǔ)存液濃度為1g/L.

1.2 污水中耐四環(huán)素大腸桿菌的篩選

取污水廠活性污泥混合液稀釋一系列梯度后取1mL分別加入至含四環(huán)素(36mg/L)或紅霉素(32mg/L)的大腸桿菌或糞腸球菌選擇性培養(yǎng)基中,充分振蕩混合,冷卻凝固后置于培養(yǎng)箱 37℃培養(yǎng)24h;從各含有抗生素的平板中分別挑4～5株菌落接種至液體 LB培養(yǎng)基中,于搖床中恒溫培養(yǎng) 24h;將培養(yǎng)后的菌液于含相應(yīng)抗生素的斜面LB培養(yǎng)基進(jìn)行劃線分離,培養(yǎng)24h后挑取3株單菌落于液體LB培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)24h;以1%量將上述菌液擴(kuò)培后分裝于 2mL離心管,加入 20%甘油-80℃保存;另各取一管上述純菌液送出測(cè)序,將測(cè)序結(jié)果輸入genbank經(jīng)blast比對(duì),發(fā)現(xiàn)符合大腸桿菌K12的序列.

1.3 耐四環(huán)素菌落數(shù)統(tǒng)計(jì)

采用改進(jìn)的傳統(tǒng)平板法進(jìn)行.取經(jīng)納米零價(jià)鐵處理后的菌液 1mL,10倍梯度稀釋,之后加入到滴有四環(huán)素的LB培養(yǎng)基上混合均勻.四環(huán)素的濃度為 36mg/L.平板冷卻凝固后在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h.每個(gè)梯度設(shè)置3個(gè)平行樣本.統(tǒng)計(jì)細(xì)菌數(shù)量在20～300CFU的平板中菌落數(shù)目.將不經(jīng)過納米零價(jià)鐵處理的樣品同樣進(jìn)行上述操作作為空白.

1.4 納米零價(jià)鐵毒性影響因素研究

將各不同終濃度(2,10,50,100,200,500,1000, 2000,5000mg/L)的納米零價(jià)鐵加入到一定體積的耐藥細(xì)菌純菌液中,混合液在 5mL離心管中,150r/min下與常溫?fù)u床反應(yīng)15min.為考察反應(yīng)時(shí)間的影響,設(shè)定時(shí)間分別為5、15、30、45、60min、12、24、48h,反應(yīng)的納米零價(jià)鐵終濃度為 2mg/L;為考察氧氣含量影響,參考了 Diao等[4]的方法,將2mL離心管作為缺氧條件,10mL離心管作為有氧組進(jìn)行反應(yīng).所有的反應(yīng)在室溫下進(jìn)行的.

1.5 耐四環(huán)素大腸桿菌的耐藥特性實(shí)驗(yàn)

測(cè)定納米零價(jià)鐵處理后耐藥細(xì)菌的耐藥特性變化.簡(jiǎn)要地,將處理后的耐藥細(xì)菌分別加入至含不同濃度的四環(huán)素(36,100,200,300,400,500, 800mg/L)的LB平板,在37℃下培養(yǎng)24h,記錄存活細(xì)菌的數(shù)目.將未經(jīng)納米零價(jià)鐵處理的細(xì)菌作為空白樣品同樣進(jìn)行測(cè)定.

1.6 納米零價(jià)鐵對(duì)耐藥基因轉(zhuǎn)移的影響

本實(shí)驗(yàn)中,納米零價(jià)鐵終濃度分別為 2,10,50, 200mg/L.采用培養(yǎng)接合法進(jìn)行耐藥基因的轉(zhuǎn)移,將篩選的耐四環(huán)素大腸桿菌 K12作為供體菌,將大腸桿菌NK5449(中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心購(gòu)買,對(duì)利福平(＞160mg/L)和萘啶酮酸(＞50mg/L)有很高的抗性)作為受體菌,反應(yīng)后考察.將供體菌和受體菌分別接種到LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期,將菌液離心棄上清液后用污水廠二沉池過膜的過膜污水重新懸浮使OD600在1.0左右;將等量供體菌和受體菌混合后置于搖床培養(yǎng)18h;用同時(shí)含四環(huán)素(濃度為36mg/L)和利福平(濃度為40mg/L)的LB平板篩選轉(zhuǎn)移接合子,用含利福平的LB平板篩選受體菌,對(duì)接合子和受體菌分別計(jì)數(shù)后將二者的比值作為接合頻率.

1.7 數(shù)據(jù)分析

1.7.1 耐四環(huán)素細(xì)菌的劑量-反應(yīng)曲線 反應(yīng)混合液樣品總的細(xì)菌抗生素抗性水平是用以下方法估算的.對(duì)四環(huán)素有抗性的細(xì)菌的劑量反應(yīng)曲線數(shù)學(xué)上與含有四個(gè)參數(shù)的邏輯方程相吻合

[10].方程如下:

式中:存活率表示為平板上加入四環(huán)素與不加入四環(huán)素的細(xì)菌數(shù)量的比值;a表示不加入抗生素的數(shù)值,初始值為 100;b表示無窮大,初始值為0;y表示半抑制濃度,mg/L;x表示抗生素,mg/L;p表示決定曲線陡峭程度的坡度因子.

邏輯劑量反應(yīng)曲線用origin軟件進(jìn)行擬合.

1.7.2 抗生素濃度區(qū)間耐藥細(xì)菌階段存活率的估算 細(xì)菌的存活率用來估計(jì)在每一個(gè)抗生素濃度區(qū)間的細(xì)菌耐藥水平.濃度區(qū)間的細(xì)菌存活率用以下公式表示:

式中:存活率(%)a表示抗生素濃度為a mg/L時(shí)的細(xì)菌存活率;存活率(%)b表示抗生素濃度為 b mg/L時(shí)的細(xì)菌存活率.

1.7.3 抗生素對(duì)耐藥細(xì)菌抑制率的計(jì)算方法

1.7.4 轉(zhuǎn)移效率的計(jì)算方法

1.7.5 統(tǒng)計(jì)分析 使用卡方檢驗(yàn)法檢驗(yàn)數(shù)據(jù)的顯著差異性(P≤0.05).

2 結(jié)果與討論

2.1 納米零價(jià)鐵對(duì)耐藥細(xì)菌生態(tài)毒性及相關(guān)因素影響

如圖 1a,當(dāng)納米零價(jià)鐵濃度較低時(shí)(＜200mg/ L),抑制率較低,在 200mg/L為 21.2%.此結(jié)果和Chen等[11]報(bào)道類似;當(dāng)納米零價(jià)鐵濃度大于500mg/L時(shí),抑制率顯著提高,當(dāng)納米零價(jià)鐵濃度為5000mg/L時(shí),抑制率達(dá)45.5%. Bahareh等[12]用納米氧化鈣處理細(xì)菌,證實(shí)了最好的抑制效果出現(xiàn)在高濃度納米顆粒的實(shí)驗(yàn)條件下.另外,Wang等[13]發(fā)現(xiàn)隨著納米二氧化鈦濃度的增加,存活的細(xì)菌數(shù)量顯著減小.因此,作為一種納米材料,高濃度的納米零價(jià)鐵懸濁液對(duì)耐四環(huán)素菌大腸桿菌有較顯著的抑制效果.

納米零價(jià)鐵和耐藥細(xì)菌反應(yīng)時(shí)間對(duì)耐四環(huán)素菌的影響見圖1b.當(dāng)反應(yīng)時(shí)間從5min至30min時(shí),納米零價(jià)鐵對(duì)耐藥細(xì)菌的抑制率沒有很明顯的區(qū)別.而當(dāng)反應(yīng)時(shí)間繼續(xù)增加,抑制率增加的速率明顯加快,從45min時(shí)的24%到12h的80%.當(dāng)反應(yīng)時(shí)間進(jìn)一步增加,納米零價(jià)鐵對(duì)耐藥細(xì)菌反而具有促進(jìn)作用而非抑制作用.24h和 48h反應(yīng)時(shí)間下的促進(jìn)率分別為 47%和 103%.當(dāng)反應(yīng)時(shí)間增加時(shí),納米零價(jià)鐵和細(xì)菌的反應(yīng)變得越來越穩(wěn)定,最大的抑制率在反應(yīng)時(shí)間 12h處得到.Raphael等[14]指出,納米材料表面的死細(xì)菌會(huì)阻止納米材料與活細(xì)菌的直接表面接觸進(jìn)而導(dǎo)致納米顆?？咕芰Φ南?這也可能是因?yàn)?隨著接觸反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng),納米零價(jià)鐵被氧化,失去其抑制耐藥菌的能力.而此時(shí)氧化的納米零價(jià)鐵作為載體,提供了耐藥菌繁殖的條件,促使其數(shù)量增加.具體原因還有待于進(jìn)一步研究.

圖1 a.納米零價(jià)鐵濃度對(duì)耐四環(huán)素菌抑制的影響;b.反應(yīng)時(shí)間對(duì)耐四環(huán)素菌抑制的影響;c.氧氣含量對(duì)耐四環(huán)素菌抑制的影響Fig.1 a.influence of nZVI concentration on tetracycline resistant bacteria inactivation; b.influence of reaction time on tetracycline resistant bacteria inactivation; c.influence of redox state on tetracycline resistant bacteria inactivation

2.2 氧含量的影響

反應(yīng)條件是否有氧對(duì)納米零價(jià)鐵對(duì)耐藥菌的滅活率有明顯影響.如圖 1c所示,有氧條件下,當(dāng)納米零價(jià)鐵濃度增加,細(xì)菌存活率增加.而厭氧條件下耐藥菌的存活率相比要低.這可能是因?yàn)榧{米零價(jià)鐵在有氧條件下更容易被氧化,從而失去其抑制耐藥菌的能力.因此,反應(yīng)中低的氧氣含量能保證較高的耐藥菌抑制率.

2.3 納米零價(jià)鐵對(duì)細(xì)菌耐藥圖譜的影響

加入一定濃度納米零價(jià)鐵對(duì)耐藥菌的耐藥圖譜有一定影響.相比于對(duì)照樣,投加納米零價(jià)鐵的耐藥菌圖譜向左偏移;但隨著納米零價(jià)鐵濃度升高,存活曲線趨近于空白樣.如圖2所示,從半抑制濃度結(jié)果看,當(dāng)納米零價(jià)鐵濃度分別 0,2, 10mg/L時(shí),四環(huán)素的半抑制濃度分別為 335.3, 210.7,307.2mg/L.這表明,加入的納米零價(jià)鐵協(xié)同四環(huán)素增加了對(duì)耐四環(huán)素菌的滅活.但隨著納米零價(jià)鐵濃度的增加,其協(xié)同效果有所降低.這可能是因?yàn)闈舛容^高的納米零價(jià)鐵反而限制了耐藥菌與納米零價(jià)鐵的接觸,從而導(dǎo)致其抑制效果降低.

圖2 不同納米零價(jià)鐵濃度反應(yīng)后耐藥細(xì)菌的抗生素濃度-存活率曲線Fig.2 Tetracycline concentration-survival rate curve of tetracycline resistant bacteria under different nZVI concentration

圖 3表示了四環(huán)素各濃度范圍內(nèi)的耐四環(huán)素菌的階段耐藥率.對(duì)于階段存活率,將四環(huán)素濃度分為36～200, 200～400和400～800mg/L,分別代表低、中和高抗生素濃度.對(duì)于低四環(huán)素濃度,加入納米零價(jià)鐵后,存活率要大于空白.即在低抗生素濃度范圍內(nèi),加入納米零價(jià)鐵可促進(jìn)耐藥菌生長(zhǎng),這種促進(jìn)作用的原因還不明確.然而,對(duì)于中濃度的四環(huán)素,加入納米零價(jià)鐵意味著更低的存活率.而對(duì)于高濃度四環(huán)素,不同納米零價(jià)鐵濃度下的階段存活率互為接近,這是因?yàn)樗沫h(huán)素濃度足夠高,以至85%細(xì)菌被殺滅;而此時(shí)的納米零價(jià)鐵作用已不凸顯.階段存活率結(jié)果表明,納米零價(jià)鐵對(duì)耐藥菌階段耐藥率的影響與抗生素濃度有關(guān);兩者在不同濃度下的協(xié)同作用有待進(jìn)一步深入研究.

圖3 四環(huán)素各濃度范圍內(nèi)的耐四環(huán)素菌的階段耐藥率Fig.3 Stage survival under different tetracycline concentration

圖4 不同納米零價(jià)鐵反應(yīng)后耐藥基因的轉(zhuǎn)移頻率Fig.4 Influence of nZVI concentration on bacteria transfer efficiency

圖 4表示了不同納米零價(jià)鐵反應(yīng)后耐藥基因的轉(zhuǎn)移頻率.可以看到,較低濃度下,納米零價(jià)鐵對(duì)轉(zhuǎn)移效率有積極影響.轉(zhuǎn)移效率相對(duì)于空白分別提高了19.2%(納米零價(jià)鐵濃度為2mg/L)和115%(納米零價(jià)鐵濃度為50mg/L).轉(zhuǎn)移效率在納米零價(jià)鐵濃度為 50mg/L時(shí)達(dá)到了峰值,此時(shí)轉(zhuǎn)移效率為 5.6×10-6.然而,當(dāng)納米零價(jià)鐵濃度增加到200mg/L時(shí),轉(zhuǎn)移效率的增加反而有所降低,轉(zhuǎn)移效率為 2.8×10-6.這與 Qiu等[15]的研究結(jié)果相似.他們研究發(fā)現(xiàn),納米氧化鋁、納米二氧化鈦、納米二氧化硅和納米氧化鐵都能促進(jìn)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移.對(duì)于納米氧化鋁,對(duì) RP4的轉(zhuǎn)移效率在5mmol/L時(shí)達(dá)到頂峰,而在50mmol/L減小.

3 結(jié)論

3.1 納米零價(jià)鐵濃度為5000mg/L時(shí),其對(duì)耐四環(huán)素菌有較好的抑制效果,抑制率為 45.5%.當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為12h時(shí),抑制率達(dá)80%;3.2當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為48h時(shí),納米零價(jià)鐵對(duì)耐四環(huán)素菌具有促進(jìn)作用. 3.3納米零價(jià)鐵削弱細(xì)菌耐藥程度并促進(jìn)基因轉(zhuǎn)移.轉(zhuǎn)移效率在納米零價(jià)鐵濃度為 50mg/L時(shí)達(dá)到最大,為5.7×10-6.目前,納米零價(jià)鐵對(duì)細(xì)菌影響的報(bào)道較有限.本研究可對(duì)該方面提供一些重要信息.需要進(jìn)一步研究納米零價(jià)鐵抑菌特性和機(jī)理.未來的研究重點(diǎn)應(yīng)該聚焦更多的納米材料對(duì)耐藥細(xì)菌去除和基因轉(zhuǎn)移的影響,以期獲得更全面的了解.

[1] Szczepanowski R, Linke B, Krahn I, et al. Detection of 140clinically relevant antibiotic-resistance genes in the plasmid metagenome of wastewater treatment plant bacteria showing reduced susceptibility to selected antibiotics [J]. Microbiology, 2009,155(7):2306-2319.

[2] Castiglioni S, Pomati F., Miller K, et al. Novel homologs of the multiple resistance regulator marA in antibiotic-contaminated environments [J]. Water Res, 2008 42(16):4271-4280.

[3] Li Zhiqiang, Karl G, Pedro J J A, et al. Adsorbed polymer and NOM limits adhesion and toxicity of nano scale zerovalent iron to E. coli [J]. Environ. Sci. Technol., 2010,44:3462–3467.

[4] Diao Minghui, Yao Maosheng. Use of zero-valent iron nanoparticles in inactivating microbes [J]. Water Research, 2009, 43:5243-5251.

[5] Cristian A S, Matthias O, Rodrigo Q A et al. Photoactive hybrid anomaterial for targeting, labeling, and killing antibiotic-resistant bacteria [J]. Angew. Chem. Int. Ed. 2009,48:7928 –7931.

[6] Maria L S, Carmen F, Mar N, et al. Effects of nano zero-valent iron on Klebsiella oxytoca and stress response [J]. Microb Ecol, 2013,66:806–812.

[7] Bojeong K, Chee-sung P, Mitsuhiro M, et al. Discovery and Characterization of Silver Sulfide Nanoparticles in Final Sewage Sludge Products [J]. Environ. Sci. Technol., 2010,44(19):7509–7514.

[8] Bojeong K, Mitsuhiro M, Benjamin P C, et al. Characterization and environmental implications of nano- and larger TiO2particles in sewage sludge, and soils amended with sewage sludge [J]. J. Environ. Monit., 2012,14:1128-1136.

[9] Wang Chuanbao, Zhang Weixian. Synthesizing nanoscale iron particles for rapid and complete dechlorination of TCE and PCBs [J]. Environ. Sci. Technol., 1997,31:2154–2156.

[10] Huang Jingjing, Hu Hongying, Lu Sunqin, et al. Monitoring and 372 evaluation of antibiotic-resistant bacteria at a municipal wastewater treatment 373plant in China [J]. Environ. Int., 2012, 42:31–36.

[11] Chen Qi, Li Jing, Wu Yan, et al. Biological responses of grampositive and gram-negative bacteria to nZVI (Fe0), Fe2+and Fe3+[J]. RSC Adv. 2013,3:13835–13842.

[12] Bahareh S, Sedigheh M, Mehdi A. Investigation of antibacterial effect of cadmium Oxide nanoparticles on Staphylococcus Aureus Bacteria [J]. Journal of Nanobiotechnology, 2014,12:26.

[13] Wang Shuang, Chang Li-Yan, Wang Yong-Jun, et al. Nanoparticles affect the survival of bacteria on leaf surfaces [J]. FEMS Microbiol Ecol, 2009,68:182–191.

[14] Raphael D H, Bruna A L, Ant?nio G S F, et al. Nanostructured silver vanadate as a promising antibacterial additive to waterbased paints [J]. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine, 2012,8:935–940.

[15] Qiu Zhigang, Yu Yunmei, Chen Zhaoli, et al. Nanoalumina promotes the horizontal transfer of multiresistance genes mediated by plasmids across genera [J]. PNAS, 2012,109:4944-4949.

致謝：作者感謝污水處理廠提供的污水樣品.

Influence of nanoscale zero-valent iron (nZVI) on resistance character of tetracycline resistant bacteria.

LU Xian1,2, GUO Mei-ting1,2*, ZHANG Wei-xian1,2
(1.State Key Laboratory of Pollution Control and Resources Reuse, Tongji University, Shanghai 200092, China；2.College of Environmental Science and Engineering, Tongji University, Shanghai 200092, China). China Environmental Science, 2017,37(1)：381～385

Effect of nanoscale zero-valent iron (nZVI) on tetracycline resistant bacteria in wastewater was investigated. Specifically drug resistance, gene transfer, microbial growth and separation in municipal wastewater were examined. Tetracycline resistant bacteria were treated with nZVI particles under a verity of experimental conditions such as concentration, reaction time, availability to dissolved oxygen and redox state. Experimental results suggest that nZVI was effective for the inactivation of tetracycline resistant bacteria when nZVI concentration is over 5,000mg/L, or reaction time was over 12hours under anaerobic condition. nZVI could also trigger rapid decrease on the antibiotic resistance. Furthermore, addition of 50mg/L nZVI could enhance the transfer efficiency by 215%. Results demonstrate that nZVI was highly reactive in wastewater and there was an urgent need to understand the influence of nZVI on microbial drug resistance.

nZVI；tetracycline resistant bacteria；resistance character；gene transfer

X172

A

1000-6923(2017)01-0381-05

陸 賢(1990-),男,上海崇明人,同濟(jì)大學(xué)碩士研究生,研究方向?yàn)榧{米零價(jià)鐵的應(yīng)用研究.

2016-05-20

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(51308399) * 責(zé)任作者, 副教授, guomeiting@#edu.cn