丹江口水庫(kù)枯水期浮游細(xì)菌群落組成及影響因素研究

陳兆進(jìn),丁傳雨,朱靜亞,李 冰,黃 進(jìn),杜宗明,王 亞,李玉英*

(1.南陽(yáng)師范學(xué)院農(nóng)業(yè)工程學(xué)院,河南省南水北調(diào)中線水源區(qū)生態(tài)安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南 南陽(yáng) 473061；2.南水北調(diào)中線水源區(qū)水安全河南省協(xié)同創(chuàng)新中心,河南 南陽(yáng) 473061；3.南水北調(diào)中線渠首環(huán)境監(jiān)測(cè)應(yīng)急中心,河南 淅川 474475)

丹江口水庫(kù)枯水期浮游細(xì)菌群落組成及影響因素研究

陳兆進(jìn)1,2,丁傳雨1,2,朱靜亞1,2,李 冰2,3,黃 進(jìn)2,3,杜宗明2,3,王 亞2,3,李玉英1,2*

(1.南陽(yáng)師范學(xué)院農(nóng)業(yè)工程學(xué)院,河南省南水北調(diào)中線水源區(qū)生態(tài)安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南 南陽(yáng) 473061；2.南水北調(diào)中線水源區(qū)水安全河南省協(xié)同創(chuàng)新中心,河南 南陽(yáng) 473061；3.南水北調(diào)中線渠首環(huán)境監(jiān)測(cè)應(yīng)急中心,河南 淅川 474475)

為了解丹江口庫(kù)區(qū)南水北調(diào)中線工程通水后浮游細(xì)菌群落組成及影響因素,于2016枯水期(1月)對(duì)丹江庫(kù)區(qū)內(nèi)5個(gè)典型生態(tài)點(diǎn)位表層水樣進(jìn)行采集.水質(zhì)監(jiān)測(cè)結(jié)果表明庫(kù)區(qū)水質(zhì)總體較好,除總氮和高錳酸鹽指數(shù)外,其他各項(xiàng)指標(biāo)符合I類水標(biāo)準(zhǔn)要求.總氮(TN)和高錳酸鹽指數(shù)(CODMn)為庫(kù)區(qū)的主要污染因子,水體整體處于中營(yíng)養(yǎng)狀態(tài).采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)浮游細(xì)菌群落組成進(jìn)行研究,結(jié)果表明主要由放線菌門(mén)(Actinobacteria)、變形菌門(mén)(Proteobacteria)、藍(lán)藻門(mén)(Cyanobacteria)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)、疣微菌門(mén)(Verrucomicrobia)、壁厚菌門(mén)(Firmicutes)、酸桿菌門(mén)(Acidobacteria)等22個(gè)門(mén)和323個(gè)屬組成.5位點(diǎn)樣品具有豐富的群落組成,浮游細(xì)菌群落多樣性排序?yàn)?黑雞嘴＞臺(tái)子山＞庫(kù)心＞宋崗＞渠首.對(duì)浮游細(xì)菌群落組成與環(huán)境因子的關(guān)系進(jìn)行典范對(duì)應(yīng)分析(CCA),結(jié)果表明: T、pH值、NH4+-N、SD顯著影響浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu).

丹江口庫(kù)區(qū)；浮游細(xì)菌；群落結(jié)構(gòu)；高通量測(cè)序；環(huán)境因子

湖泊微生物中,浮游細(xì)菌數(shù)量巨大,在有機(jī)物降解及營(yíng)養(yǎng)物循環(huán)過(guò)程中具有重要作用,是水生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分.全面了解湖泊生態(tài)系統(tǒng)中浮游細(xì)菌群落多樣性、分布特征及其在生態(tài)系統(tǒng)中的功能和作用,對(duì)于管理和維護(hù)湖泊生態(tài)環(huán)境具有深遠(yuǎn)的意義[1-2].

由于只有不到 1%的微生物可以純培養(yǎng),限制了自然界中絕大部分微生物的認(rèn)識(shí).基于免培養(yǎng)的變性梯度凝膠電泳、分子克隆文庫(kù)等技術(shù)被應(yīng)用到對(duì)海洋、湖泊水體浮游細(xì)菌的研究之中,增加了人們對(duì)這一微生物群體多樣性及動(dòng)態(tài)規(guī)律的認(rèn)識(shí)[3].近年來(lái),高通量測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn),大大加速了宏基因組學(xué)的發(fā)展.該技術(shù)操作簡(jiǎn)單、成本低廉,能快速高通量得到特定的DNA 片段,較之前的分子生物多樣性研究能更全面地展示生物群落結(jié)構(gòu),極大地推動(dòng)了生物多樣性研究[4,5].采用高通量測(cè)序和變性梯度凝膠電泳相結(jié)合的方法研究廈門(mén)外海微型浮游生物群落,結(jié)果表明MiSeq測(cè)序能得到更豐富的浮游生物群落信息,表現(xiàn)出技術(shù)上的優(yōu)勢(shì)[6].

丹江口水庫(kù)作為南水北調(diào)中線工程核心水源區(qū),其水質(zhì)狀況直接關(guān)系到受水區(qū)居民的飲水安全.根據(jù)流域內(nèi)降水特征及水文節(jié)律,每年 12月至次年4月為枯水期,此階段徑流量較小,不利庫(kù)區(qū)水體污染物稀釋、擴(kuò)散、降解,水生態(tài)系統(tǒng)承受著巨大的污染壓力[7].有關(guān)丹江口庫(kù)區(qū)浮游細(xì)菌群落研究開(kāi)展較少,本研究選取通水后第 2年枯水期(2016年1月)丹江庫(kù)區(qū)5個(gè)典型站位,采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)浮游細(xì)菌群落16S rDNA多樣性進(jìn)行分析,研究其群落組成和分布特征.結(jié)合典范對(duì)應(yīng)分析(CCA)進(jìn)一步探討細(xì)菌豐度、群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子間的關(guān)系,以期為丹江口水庫(kù)水環(huán)境保護(hù)提供參考依據(jù).

1 材料與方法

1.1 樣品采集與水質(zhì)理化指標(biāo)測(cè)定

圖1 采樣點(diǎn)分布Fig.1 Location map of the sample sites of Danjiangkou reservoir

根據(jù)丹江口水庫(kù)的地理位置特征和人類活動(dòng)影響程度,選取屬于河南省南陽(yáng)市的丹江庫(kù)區(qū)庫(kù)心(樣品編號(hào)為K,無(wú)人為干擾)、渠首(樣品編號(hào)為 Q,重度人為干擾,陶岔渠首大壩取水口上游 100m)、黑雞嘴(樣品編號(hào)為 H,中度人為干擾,有居民點(diǎn),上游支流匯入)、宋崗(樣品編號(hào)為S,重度人為干擾,有居民點(diǎn)、輪渡碼頭)和臺(tái)子山(樣品編號(hào)為 T,輕度人為干擾,為丹江庫(kù)區(qū)與漢江庫(kù)區(qū)分界線)5個(gè)位點(diǎn)為采樣點(diǎn),具體位置如圖 1所示.根據(jù)庫(kù)區(qū)降水特征及水文節(jié)律,于2016年1月(枯水期)月初進(jìn)行水樣的采集工作.參照《水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法》(第四版)[8]用柱狀采水器采集表層(深度 50cm)水樣 2L,所有點(diǎn)位均取平行樣3組. 500mL水樣用于提取細(xì)菌總 DNA,置于預(yù)先滅菌容器中存于冰盒,4h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)分析,剩余水樣用于水質(zhì)指標(biāo)測(cè)定.參照《水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法》(第四版)[8]測(cè)定水樣pH、水溫(T)、總氮(TN)、銨氮(NH4+-N)、總磷(TP)、透明度(SD)、電導(dǎo)率(Cond)、化學(xué)需氧量(COD)、生化需氧量(BOD)、溶解氧(DO)、高錳酸鹽指數(shù)(CODMn)以及葉綠素a含量(Chl a)理化指標(biāo).

1.2 樣品總 DNA提取

500mL表層新鮮水樣經(jīng)0.22μm無(wú)菌微孔濾膜過(guò)濾,用以收集浮游細(xì)菌,將濾膜剪碎置于50mL無(wú)菌離心管中.按照 Omega Water DNA Kit (Omega, USA)的說(shuō)明,提取水體中的DNA.將提取得到的細(xì)菌總DNA通過(guò)微量紫外分光光度計(jì)(NanoDrop?ND-1000, Wilmington, DE, USA)測(cè)定DNA濃度和純度.

1.3 高通量測(cè)序

采用通用引物(338F/806R)對(duì)浮游細(xì)菌 16S rRNA基因的V3～V4區(qū)擴(kuò)增,修飾后的通用引物含有不同的 Tag標(biāo)簽用以區(qū)分不同樣品[5].PCR擴(kuò)增體系為20μL,其中含5×FastPfu Buffer 4μL、2.5mmol/L dNTPs 2μL、Forward Primer (5μmol/L 0.8μL、Reverse Primer(5μmol/L) 0.8μL、FastPfu Polymerase 0.4μL、DNA模板 10ng.補(bǔ)ddH2O至20μL.PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為: 94℃,5min;30× (94℃,30s;54℃,30s;72℃.45s);72℃.10min.每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù),將不同樣品的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物均一化至10nmol/L后等體積混合,利用上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司的MiSeq PE300測(cè)序儀(Illumina Inc..San Diego.CA.USA)完成序列測(cè)定.

1.4 數(shù)據(jù)分析

1.4.1 高通量數(shù)據(jù)分析 高通量數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)分析采用Qiime進(jìn)行,根據(jù)序列的相似度,將序列歸為多個(gè)OTU,OTU產(chǎn)出后,統(tǒng)計(jì)各個(gè)樣品含有OTU情況及每個(gè)OTU中含有序列的數(shù)目,得到每個(gè) OTU的分類學(xué)信息[9].選取相似度在97%條件下的OTU生成預(yù)期的稀釋曲線,并利用軟件mothur計(jì)算豐富度指數(shù)Chao1和ACE,覆蓋度指數(shù)(good's coverage)以及多樣性指數(shù)Simpson和Shannon指數(shù)進(jìn)行Alpha 多樣性分析[10].利用 PCoA、Correlation聚類法分別進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、細(xì)菌群落分布、主成分分析和聚類分析.采用 Linear Discriminant Analysis(LDA) coupled with effect size measurements(LEfSe)在線工具尋找組與組之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的生物標(biāo)志物[11].

1.4.2 典范對(duì)應(yīng)分析 典范對(duì)應(yīng)分析(CCA)能將可能相關(guān)的多個(gè)環(huán)境因子一起進(jìn)行分析,可以很好地反映種群或群落與環(huán)境的關(guān)系.本文采用CANOCO軟件(版本 4.5) 進(jìn)行浮游細(xì)菌和環(huán)境因子的CCA分析,排序結(jié)果用物種-環(huán)境因子關(guān)系的雙序圖表示[12].在主軸1和主軸2構(gòu)成的平面中,箭頭表示環(huán)境因子,向量長(zhǎng)短代表著相應(yīng)環(huán)境因子在主軸中的作用,箭頭所處象限表示環(huán)境因子與排序軸間相關(guān)性的正負(fù)[13].

1.4.3 方差分析 浮游細(xì)菌群落多樣性與環(huán)境因子之間的相關(guān)性采用 SPSS19.0軟件進(jìn)行分析.不同采樣點(diǎn)位間的環(huán)境因子比較采用單因素方差分析,顯著性水平設(shè)定為P＜0.05,相關(guān)圖表制作在 Excel中完成.

表1 各采樣點(diǎn)水體主要理化參數(shù)Table 1 The main physical and chemical properties of water samples

2 結(jié)果與分析

2.1 水質(zhì)營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)評(píng)價(jià)

2016年1月對(duì)丹江口水庫(kù)庫(kù)心、渠首等5位點(diǎn)水質(zhì)的理化監(jiān)測(cè)結(jié)果表明各水體的水質(zhì)總體較好,除總氮(均超過(guò) 1.00mg/L,為 IV類地表水標(biāo)準(zhǔn))和高錳酸鹽指數(shù)外(均超過(guò)3.00mg/L,為II類地表水標(biāo)準(zhǔn)),其他各項(xiàng)指標(biāo)符合《地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(GB38382-2002)I類水標(biāo)準(zhǔn)要求(表 1)[14].其中黑雞嘴總氮含量最高,其次為庫(kù)心和宋崗.從圖1可知黑雞嘴、庫(kù)心和宋崗集中分布于丹江庫(kù)區(qū)靠近丹江入水口,研究表明丹江流域存在農(nóng)業(yè)面源污染,其中總氮明顯超標(biāo),是超標(biāo)的原因[7,15-16].按照《地表水資源質(zhì)量評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)程》(SL395-2007)[17]進(jìn)行水庫(kù)營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)的評(píng)價(jià),以總氮、總磷、高錳酸鹽指數(shù)、葉綠素a和透明度5個(gè)參數(shù)作為水質(zhì)營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)參數(shù),丹江庫(kù)區(qū)庫(kù)心、渠首等5位點(diǎn)總氮賦分值均為60,總磷、高錳酸鹽指數(shù)、葉綠素a和透明度的賦分值介于30～40之間.庫(kù)心、渠首等5位點(diǎn)營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)指數(shù)EI均為38.綜合評(píng)價(jià),丹江庫(kù)區(qū)水體處于中營(yíng)養(yǎng)狀態(tài).

2.2 浮游細(xì)菌稀釋性曲線

丹江庫(kù)區(qū)浮游細(xì)菌稀釋性曲線隨測(cè)序條數(shù)的增加物種豐富度呈現(xiàn)前期增加后期趨向平緩(圖2).由圖2可知,庫(kù)心、渠首等5位點(diǎn)每個(gè)樣本的測(cè)序曲線在測(cè)序條數(shù)達(dá)到 20000條以上時(shí)物種數(shù)都基本趨向平穩(wěn),說(shuō)明此時(shí)測(cè)序數(shù)據(jù)量合理,足夠代表物種的豐富度.

圖2 浮游細(xì)菌稀釋性曲線Fig.2 Rarefaction curve of bacterioplankton community

2.3 浮游細(xì)菌群落多樣性的評(píng)估

高通量測(cè)序表明丹江口水庫(kù)庫(kù)心、渠首等5位點(diǎn)樣品具有豐富的群落組成,其群落多樣性均較高(表2).5組樣品文庫(kù)覆蓋率均在99.80%以上,完全能夠反映該區(qū)域浮游細(xì)菌群落的種類和結(jié)構(gòu).渠首樣品OTU數(shù)、豐富度指數(shù)Chao1和ACE、Shannon指數(shù)低于其他組樣品,其中 OTU數(shù)、Chao1和ACE差異達(dá)到顯著水平(P＜0.05),表明其浮游細(xì)菌群落多樣性低于其他樣品(表2).綜合OTU數(shù)、豐富度指數(shù)Chao1和ACE以及多樣性指數(shù)Simpson和Shannon指數(shù),5組樣品浮游細(xì)菌群落多樣性排序?yàn)?黑雞嘴＞臺(tái)子山＞庫(kù)心＞宋崗＞渠首.

表2 浮游細(xì)菌群落多樣性評(píng)估表Table 2 Estimation of bacterioplankton community diversity

2.4 浮游生細(xì)菌多樣性的主成分分析

圖3 浮游細(xì)菌多樣性的主成分分析Fig.3 PCA analysis of bacterioplankton community diversity

圖4 不同樣品相似性聚類樹(shù)(A)和門(mén)水平上物種相對(duì)豐度分布(B)Fig.4 Similarity tree (A) and relative read abundance (B) of different bacterioplankton community structures at phylum levels in different treatments

利用Qiime 軟件對(duì)庫(kù)心、渠首等5位點(diǎn)樣品相關(guān)群落進(jìn)行了主成分分析.如圖3所示,橫坐標(biāo) PC1貢獻(xiàn)度為33.35%,縱坐標(biāo) PC2貢獻(xiàn)度為26.83%,5位點(diǎn)中無(wú)人為干擾的庫(kù)心樣品聚集在PCA 分析圖上側(cè).人為干擾較輕的臺(tái)子山樣品、黑雞嘴樣品與庫(kù)心樣品在PCA 分析圖中距離較近.人為干擾較重的宋崗樣品聚集于圖3下側(cè),渠首樣品聚集于圖3右側(cè),渠首和宋崗樣品與其他3組樣品浮游細(xì)菌群落差異較大.綜合以上分析表明不同樣品來(lái)源浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)有所差異,其中人為干擾對(duì)浮游細(xì)菌群落影響較大.后續(xù)使用基于Unweighted UniFrac的UPGMA方法對(duì)庫(kù)心、渠首等5位點(diǎn)樣品浮游細(xì)菌群落構(gòu)成的相似性進(jìn)行聚類分析,通過(guò)樣品加權(quán)的聚類分析,同樣可以有效的將不同人為干擾程度樣品實(shí)現(xiàn)組間聚類(圖4A).

2.5 浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

高通量測(cè)序結(jié)果表明,15組實(shí)驗(yàn)樣品平均序列條數(shù)為41916,OTUs平均數(shù)561(表2),經(jīng)過(guò)分析主要為細(xì)菌的 22個(gè)門(mén),包括放線菌門(mén)(Actinobacteria)、變形菌門(mén) (Proteobacteria)、藍(lán)藻門(mén) (Cyanobacteria)、擬桿菌門(mén) (Bacteroidetes)、疣 微 菌 門(mén) (Verrucomicrobia)、 壁 厚 菌 門(mén)(Firmicutes)、酸桿菌門(mén) (Acidobacteria)等(圖4B).其中黑雞嘴、臺(tái)子山樣品包含19門(mén),宋崗樣品包括18門(mén),庫(kù)心樣品包括17門(mén),渠首樣品包括16門(mén).浮游細(xì)菌主要分布于323個(gè)屬,其中宋崗樣品包括245屬,黑雞嘴樣品包括239屬,臺(tái)子山樣品包含237屬,庫(kù)心樣品包括218屬,渠首樣品包括194屬.屬于放線菌門(mén)、變形菌門(mén)、藍(lán)藻門(mén)、擬桿菌門(mén)的序列總和占全部序列的 71.56%～ 83.53%,這些細(xì)菌為優(yōu)勢(shì)種群.其中,放線菌門(mén)為庫(kù)心、黑雞嘴樣品最優(yōu)勢(shì)種群和臺(tái)子山樣品第二優(yōu)勢(shì)菌群,分別占總?cè)郝涞?7.86%、28.31%和23.68%;變形菌門(mén)為宋崗、臺(tái)子山樣品最優(yōu)勢(shì)種群和庫(kù)心、黑雞嘴樣品第二優(yōu)勢(shì)菌群,分別占總?cè)郝涞?9.72%、24.62%、20.49%和20.44%;藍(lán)藻門(mén)為渠首最優(yōu)勢(shì)種群和宋崗第二優(yōu)勢(shì)菌群,分別占總?cè)郝涞?27.48%和 20.58%;擬桿菌門(mén)為渠首第二優(yōu)勢(shì)菌群,占總?cè)郝涞?2.37%.

2.6 不同樣品差異細(xì)菌分析

為了進(jìn)一步確定各組細(xì)菌種屬的豐富度差異,我們采用在線統(tǒng)計(jì)工具LEfSe來(lái)尋找宏基因組生物標(biāo)志物.該方法是建立在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異、生物學(xué)一致性和相同檢驗(yàn)效能估計(jì)基礎(chǔ)之上的,通過(guò)分析高通量測(cè)序數(shù)據(jù)在每個(gè)樣品中的分類信息,在生物學(xué)上提供不同級(jí)別的可能的生物標(biāo)志物[11].LEfSe法計(jì)算出不同樣品中的差異菌屬,所有菌在門(mén)、綱、目、科、屬水平的差異信息用餅形圖表示,餅形圖紅色、綠色、藍(lán)色、紫紅色、青色分別代表在黑雞嘴、庫(kù)心、渠首、宋崗和臺(tái)子山組中達(dá)到 LEfSe程序生物標(biāo)志物篩選標(biāo)準(zhǔn)(圖5).

圖5 不同樣品差異細(xì)菌分布Fig.5 Taxon with statistical differences between different bacterioplankton communities

最內(nèi)圈表示門(mén)水平的差異,依次往外的圈表示綱、目、科、屬,不同顏色扇形面積表示在此范圍內(nèi)的菌均有差異(圖 5).在門(mén)的水平上,宋崗樣品中1個(gè)主要門(mén)(變形菌門(mén))的細(xì)菌存在顯著差異,渠首樣品中2個(gè)門(mén)(藍(lán)藻門(mén)、擬桿菌門(mén))的細(xì)菌存在顯著差異,臺(tái)子山和黑雞嘴樣品中各有2個(gè)門(mén)的細(xì)菌存在顯著差異,庫(kù)心樣品在門(mén)水平上無(wú)顯著差異.在屬的水平上,宋崗樣品中變形菌門(mén)的Brevundimonas、Sphingomonas、 Massilia、Deefgea、 Pseudomonas,壁 厚 菌 門(mén) 的Exiguobacterium、Planococcus、擬桿菌門(mén)的Pedobacter等共13屬的細(xì)菌存在顯著差異,渠首樣品中擬桿菌門(mén)的 Fluviicola、Owenweeksia、Flavobacterium,變形菌門(mén)的 Sphingopyxis、Albidiferax、Limnohabitans、Anaeromyxobacter、 Anaeromyxobacter,藍(lán)藻門(mén)的Synechococcus等共10個(gè)屬的細(xì)菌存在顯著差異,臺(tái)子山樣品中放線菌門(mén)的 Candidatus Aquiluna,擬桿菌門(mén)的Pseudarcicella、 Terrimonas,壁 厚 菌 門(mén) 的Oceanobacillus、Paenibacillus,變形菌門(mén)的Hyphomicrobium、Paracocccus、Defluviicoccus Reyranella、Limnobacter、Methylotenera等共20個(gè)屬細(xì)菌存在顯著差異,庫(kù)心樣品中放線菌門(mén)的CL500-29marine group 和 變 形 菌 門(mén) 的Bradyrhizobium、Roseovarius共3個(gè)屬細(xì)菌存在顯著差異,黑雞嘴樣品中放線菌門(mén)的Arthrobacter和變形菌門(mén)的 Methylobacterium、Gemmobacter、Candidatus Defluviella共4個(gè)屬細(xì)菌存在顯著差異.

2.7 浮游細(xì)菌群落組成與環(huán)境因子的相關(guān)分析

采用CCA分析水體環(huán)境因子與LEfSe分析篩選出的主要細(xì)菌之間的關(guān)系.由圖6可知,所分析的環(huán)境因子中T、TN、SD、Cond與第一排序軸 (AX1)正相關(guān),其中SD相關(guān)系數(shù)最大,為0.881,呈極顯著正相關(guān)(P＜0.01). pH、CODMn、BOD等與AX1負(fù)相關(guān),均未達(dá)顯著水平. T、pH、NH4+-N與第二排序軸(AX2)正相關(guān),相關(guān)系數(shù)都較大,分別為0.780、0.945、0.850,呈顯著正相關(guān)(P＜0.05), Cond、DO、COD和CODMn與第二排序軸 (AX2)負(fù)相關(guān).從第一、第二排序軸的相關(guān)性分析可以看出, T、pH、NH4+-N、SD對(duì)浮游細(xì)菌群落有較大影響, TN、DO、Cond等對(duì)其也有一定影響.相關(guān)性分析結(jié)果表明 Candidatus Aquiluna、Crenothrix、Methylobacter、Sulfuricurvum等 8個(gè)屬的細(xì)菌與 T呈顯著正相關(guān), Anaeromyxobacter、Fluviicola與T呈顯著負(fù)相關(guān). Defluviicoccus、Legionella、Nitrosomonas等 8個(gè)屬的細(xì)菌與 COD 呈顯著負(fù)相關(guān), Synechococcus與 COD 呈 顯 著 正 相 關(guān). Methyloversatilis 與 pH 呈 顯 著 正 相 關(guān) , Methylomonas、Sulfuricurvum、Paracocccus與Cond呈顯著負(fù)相關(guān), Sphingomonas與SD呈顯著正相關(guān), Methylotenera、Pseudarcicella與DO呈顯著負(fù)相關(guān), Defluviicoccus與CODMn呈顯著負(fù)相關(guān), Aeromonas、Rheinheimera與NH4+-N呈顯著負(fù)相關(guān),CL500-29marine group與NH4+-N呈顯著正相關(guān), Candidatus Defluviella與TN呈顯著正相關(guān). NH4+-N、TN、T、pH與浮游細(xì)菌多樣性指數(shù)中OTU數(shù)、豐富度指數(shù)Ace、Chao1、Shannon指數(shù)均呈正相關(guān).

圖6 浮游細(xì)菌物種與環(huán)境因子的CCA排序Fig.6 CCA ordination biplot between bacterioplankton species and environmental factors

3 討論

3.1 南水北調(diào)通水后丹江口庫(kù)區(qū)枯水期水質(zhì)測(cè)定

為了解蓄水后丹江口庫(kù)區(qū)水質(zhì)狀況及影響庫(kù)區(qū)水質(zhì)的主要污染因子,本研究測(cè)定了通水后第二年枯水期(2016年1月)丹江庫(kù)區(qū)5個(gè)典型站位水質(zhì),結(jié)果表明總氮和高錳酸鹽指數(shù)為庫(kù)區(qū)主要污染因子,對(duì)水庫(kù)營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)進(jìn)行評(píng)價(jià),EI指數(shù)均為 38,處于中營(yíng)養(yǎng)狀態(tài),與朱媛媛等

[7]結(jié)果基本一致.5位點(diǎn)中總氮含量較高的黑雞嘴、庫(kù)心和宋崗集中分布于丹江庫(kù)區(qū)靠近丹江入水口,徐國(guó)策等[15]研究表明丹江流域存在農(nóng)業(yè)面源污染,其中總氮明顯超標(biāo),其可能是水體中總氮超標(biāo)的主要原因.蓄水新增淹沒(méi)的農(nóng)田面積近 26萬(wàn)畝,研究表明農(nóng)業(yè)面源污染已經(jīng)成為丹江口水庫(kù)的主要污染源,水庫(kù)新增淹沒(méi)區(qū)農(nóng)田養(yǎng)分物質(zhì)釋放的潛在風(fēng)險(xiǎn)不容忽視[18].蓄水同時(shí)導(dǎo)致庫(kù)容大幅增加,流速降低,各項(xiàng)水文要素均發(fā)生了很大變化,而這些水文要素的變化相應(yīng)地會(huì)帶來(lái)水環(huán)境要素的改變,從而影響庫(kù)區(qū)水質(zhì)[19].

3.2 高通量測(cè)序揭示丹江口庫(kù)區(qū)浮游細(xì)菌群落組成

丹江口水庫(kù)作為南水北調(diào)中線工程的水源區(qū),關(guān)于浮游細(xì)菌群落組成及其影響因素研究開(kāi)展很少,相關(guān)工作亟待開(kāi)展.本課題組曾于 2005年對(duì)水源區(qū)浮游微生物群落進(jìn)行測(cè)定,選用選擇性培養(yǎng)基對(duì)細(xì)菌、真菌、放線菌、霉菌、異養(yǎng)菌、大腸桿菌、糞大腸桿菌的豐度和分布進(jìn)行了調(diào)查研究,并分析了理化性質(zhì)與水域微生物豐度和水溫、Chla、COD、BOD、DO等諸多生態(tài)因子的關(guān)系[20].在此之后,關(guān)于丹江口庫(kù)區(qū)浮游細(xì)菌群落研究鮮見(jiàn)報(bào)道.為了解蓄水后丹江口庫(kù)區(qū)浮游細(xì)菌群落組成,本實(shí)驗(yàn)采用Illumina公司MiSeq測(cè)序平臺(tái)對(duì)丹江庫(kù)區(qū)庫(kù)心、渠首等5位點(diǎn)浮游細(xì)菌群落組成進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)其主要由放線菌門(mén)、變形菌門(mén)、藍(lán)藻門(mén)、擬桿菌門(mén)、疣微菌門(mén)、壁厚菌門(mén)、酸桿菌門(mén)等22個(gè)門(mén), CL500-29marine group、Limnohabitan、Bacillus、Synechococcus等323個(gè)屬組成,表現(xiàn)出群落組成的豐富性.丹江口庫(kù)區(qū)浮游細(xì)菌群落組成與之前研究的鄱陽(yáng)湖、太湖、滇池等淡水湖泊[2,21-24]以及長(zhǎng)江、南明河等河流[25-26]及其河口[3]等水體典型的細(xì)菌組成類群相似,這些典型的淡水細(xì)菌大都隸屬于變形菌門(mén)、藍(lán)細(xì)菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、放線菌門(mén)和疣微菌門(mén)等[2,26].本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果與 2005年研究[20]相比,更全面、更準(zhǔn)確了解丹江口庫(kù)區(qū)浮游細(xì)菌群落組成,揭示了丹江口庫(kù)區(qū)的細(xì)菌種群類別,為丹江口庫(kù)區(qū)水質(zhì)保護(hù)提供重要的依據(jù).

3.3 浮游細(xì)菌群落與環(huán)境因子的關(guān)系

研究表明,水體中的環(huán)境因子,包括湖泊的形態(tài)特征(例如:湖泊的大小和深度)、物理化學(xué)特征(例如:溫度、pH、鹽度、無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)鹽等)、有機(jī)質(zhì)的濃度和類型以及食物網(wǎng)的組成和物種間的相互作用等均能影響浮游細(xì)菌的群落組成

[2].本實(shí)驗(yàn)采用Illumina公司MiSeq測(cè)序平臺(tái)對(duì)丹江庫(kù)區(qū)庫(kù)心、渠首等5位點(diǎn)浮游細(xì)菌群落組成進(jìn)行了研究,采用在線統(tǒng)計(jì)工具LEfSe分析各組細(xì)菌種屬的豐富度差異,同時(shí)對(duì)差異浮游細(xì)菌群落與理化指標(biāo)進(jìn)行CCA分析.結(jié)果表明, T、pH、NH4+-N、SD對(duì)浮游細(xì)菌群落有較大影響, Candidatus Aquiluna、Crenothrix等8個(gè)屬的細(xì)菌與T呈顯著正相關(guān), Anaeromyxobacter、Fluviicola與 T呈顯著負(fù)相關(guān).擬桿菌門(mén)的CL500-29marine group屬是浮游細(xì)菌最為優(yōu)勢(shì)種群,占 5組樣品浮游細(xì)菌的 10.18%～16.74%,相關(guān)性分析表明與 NH4+-N呈顯著正相關(guān).另外,Aeromonas、Rheinheimera與NH4+-N呈顯著負(fù)相關(guān), Candidatus Defluviella與TN呈顯著正相關(guān).在各種水生態(tài)環(huán)境中,溶解無(wú)機(jī)氮是異養(yǎng)細(xì)菌重要的 N源,同時(shí)過(guò)量的氮可能導(dǎo)致水體富營(yíng)養(yǎng)化,造成水質(zhì)惡化.Haukka等[27]報(bào)道在淡水生態(tài)系統(tǒng)中添加總氮和磷酸鹽后,浮游細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,這種變化可能與生態(tài)系統(tǒng)中添加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)后引起的水體富營(yíng)養(yǎng)化有關(guān).丹江流域存在農(nóng)業(yè)面源污染,其中總氮明顯超標(biāo)[15,18],可能會(huì)影響丹江口水庫(kù)浮游細(xì)菌群落組成.

4 結(jié)論

4.1 2016年1月丹江口水庫(kù)庫(kù)心、渠首等5位點(diǎn)監(jiān)測(cè)結(jié)果表明水體的水質(zhì)總體較好,除總氮和高錳酸鹽指數(shù)外,其他各項(xiàng)指標(biāo)符合 I類水標(biāo)準(zhǔn)要求.以總氮、總磷、高錳酸鹽指數(shù)、葉綠素 a和透明度5個(gè)參數(shù)作為水質(zhì)營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)參數(shù),丹江口水庫(kù)水體處于中營(yíng)養(yǎng)狀態(tài).

4.2 高通量測(cè)序表明丹江口水庫(kù)具有豐富的浮游細(xì)菌群落組成,主要由放線菌門(mén)、變形菌門(mén)、藍(lán)藻門(mén)、擬桿菌門(mén)、疣微菌門(mén)、壁厚菌門(mén)、酸桿菌門(mén)等22個(gè)門(mén)和323個(gè)屬的細(xì)菌組成.浮游細(xì)菌群落多樣性排序?yàn)?黑雞嘴＞臺(tái)子山＞庫(kù)心＞宋崗＞渠首.

4.3 浮游細(xì)菌與環(huán)境因子 CCA分析表明,T、pH、NH4+-N、SD等對(duì)丹江口浮游細(xì)菌群落有較大影響,不同環(huán)境因子對(duì)于不同菌群具有不同影響.

[1] Brendan Logue J, Lindstr?m ES. Biogeography of Bacterioplankton in Inland Waters [J]. Freshwater Reviews, 2008,1(1):99-114.

[2] 任麗娟,何 聃,邢 鵬,等.湖泊水體細(xì)菌多樣性及其生態(tài)功能研究進(jìn)展 [J]. 生物多樣性, 2013,21(4):421-432.

[3] 闞金軍,孫 軍.河口細(xì)菌群落多樣性及其控制因素:以切薩皮克灣為例 [J]. 生物多樣性, 2011,19(6):770-778.

[4] van Dijk E L, Auger H, Jaszczyszyn Y, et al. Ten years of next-generation sequencing technology [J]. Trends in Genetics, 2014,30(9):418-426.

[5] 張軍毅,朱冰川,超 徐,等.基于分子標(biāo)記的宏基因組16S rRNA基因高變區(qū)選擇策略 [J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào), 2015,26(11):3545-3553.

[6] Yu L Y, Zhang W J, Liu L M, et al. Determining microeukaryotic plankton community around xiamen island, southeast china, using Illumina MiSeq and PCR-DGGE techniques [J]. PLoS ONE, 2015,10(5):e0127721.

[7] 朱媛媛,田進(jìn)軍,李紅亮,等.丹江口水庫(kù)水質(zhì)評(píng)價(jià)及水污染特征[J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào), 2016,35(1):139-147.

[8] 國(guó)家環(huán)境保護(hù)總局.水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法(第四版) [M]. 北京:中國(guó)環(huán)境科學(xué)出版社, 2002:239-284.

[9] Caporaso J G, Kuczynski J, Stombaugh J, et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data [J]. Nature Methods, 2010,7(5):335-336.

[10] Schloss P D, Westcott S L, Ryabin T, et al. Introducing mothur: Open-Source, Platform-Independent, Community-Supported software for Describing and comparing microbial communities [J]. Applied and Environmental Microbiology, 2009,75(23):7537-7541.

[11] Segata N, Izard J, Waldron L, et al. Metagenomic biomarker discovery and explanation [J]. Genome Biology, 2011,12(6):1-18.

[12] Ter Braak CJ, Smilauer P. CANOCO reference manual and CanoDraw for Windows user's guide: software for canonical community ordination (version 4.5) [M]. Microcomputer Power, Ithaca, NY, 2002.

[13] 任學(xué)敏,楊改河,朱 雅,等.環(huán)境因子對(duì)太白山高山植被物種組成和豐富度的影響 [J]. 生態(tài)學(xué)報(bào), 2014,34(23):6993-7003.

[14] GB/3838-2002 地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) [S].

[15] 徐國(guó)策,李占斌,李 鵬,等.丹江中游典型小流域土壤總氮的空間分布 [J]. 地理學(xué)報(bào), 2012,67(11):1547-1555.

[16] 肖春艷,俐 武,趙同謙,等.南水北調(diào)中線源頭區(qū)蓄水前土壤氮磷分布特征 [J]. 中國(guó)環(huán)境科學(xué), 2013,33(10):1814-1820.

[17] SL/395-2007 地表水資源質(zhì)量評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)程 [S].

[18] 王 劍,尹 煒,趙曉琳,等.丹江口水庫(kù)新增淹沒(méi)區(qū)農(nóng)田土壤潛在風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估 [J]. 中國(guó)環(huán)境科學(xué), 2015,35(1):157-164.

[19] 馮 靜,何太蓉,韋 杰.三峽工程蓄水前后庫(kù)區(qū)水質(zhì)變化及對(duì)策分析 [J]. 重慶師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2011,28(2):23-27.

[20] 李玉英,張乃群,胡蘭群,等.南水北調(diào)中線工程水源區(qū)微生物菌群研究 [J]. 水利漁業(yè), 2006,26(4):57-59.

[21] Niu Y, Shen H, Chen J, et al. Phytoplankton community succession shaping bacterioplankton community composition in Lake Taihu, China [J]. Water Research, 2011,45(14):4169-4182.

[22] 呂明姬,汪 杰,范 錚,等.滇池浮游細(xì)菌群落組成的空間分布特征及其與環(huán)境因子的關(guān)系 [J]. 環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào), 2011,31(2): 299-306.

[23] Dai Y, Yang Y, Wu Z, et al. Spatiotemporal variation of planktonic and sediment bacterial assemblages in two plateau freshwater lakes at different trophic status [J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2016,100(9):4161-4175.

[24] 寇文伯,黃正云,張 杰,等.鄱陽(yáng)湖湖泊細(xì)菌群落組成及結(jié)構(gòu)-以松門(mén)山為例 [J]. 生態(tài)學(xué)報(bào), 2015,35(23):7608-7614.

[25] 毛 莉,張 明,白 芳,等.三峽庫(kù)區(qū)支流藍(lán)藻水華對(duì)浮游細(xì)菌群落組成的影響 [J]. 水生生物學(xué)報(bào), 2016,40(3):609-614.

[26] 唐 婧,徐小蓉,商傳禹,等.南明河城區(qū)河段細(xì)菌多樣性與環(huán)境因子的關(guān)系 [J]. 微生物學(xué)報(bào), 2015,55(8):1050-1059.

[27] Haukka K, Kolmonen E, Hyder R, et al. Effect of nutrient loading on bacterioplankton community composition in lake Mesocosms [J]. Microbial Ecology, 2006,51(2):137-146.

Community structure and influencing factors of bacterioplankton during low water periods in Danjiangkou Reservoir.

CHEN Zhao-jin1,2, DING Chuan-yu1,2, ZHU Jing-ya1,2, LI Bing2,3, HUANG Jin2,3, DU Zong-ming2,3, WANG Ya2,3, LI Yu-ying1,2*
(1.Key Laboratory of Ecological Security for Water Source Region of Mid-line Project of South-to-North Diversion Project of Henan Province, College of Agricultural Engineering, Nanyang Normal University, Nanyang 473061, China；2.Henan Collaborative Innovation Center of Water Security for Water Source Region of Mid-line Project of South to North Diversion Project, Nanyang 473061, China；3.Emergency Centre for Environmental Monitoring of Mid- line Project of South to North Water Division, Xichuan 474475, China). China Environmental Science, 2017,37(1)：336～344

The Danjiangkou reservoir is the main source of water for the “middle-route” of the South to North Water Diversion Project in China. Its water quality directly affects the safety of drinking water for residents along this route. In this study, 15surface-water samples were collected from the reservoir at low-water period (January) in 2016, and 12 essential environmental factors were investigated. The results showed that the water quality in the reservoir was strongly influenced by total nitrogen (TN) and the permanganate index, with the water quality being ranked at IV or II for all locations. The water in this reservoir was in the mesotrophic state. The high-throughput sequencing approach was adopted to analyze the distribution characteristics of the community structure and diversity of bacterioplankton and their relationship to environmental factors. Phylogenetic analysis based on 16S rDNA sequences showed that bacterioplankton could be divided into 22 major phylogenetic groups. The dominant phylogenetic groups included Actinobacteria, Proteobacteria, Cyanobacteria, Bacteroidetes, Verrucomicrobia, Firmicutes, and Acidobacteria. At the genus level, the dominant phylogenetic groups included CL500-29 marine group, hgcI clade, Fluviicola, Sediminibacterium, Flavobacterium, LD28 freshwater group, Limnohabitans, Synechococcus, Bacillus, and Cyanobacteria norank. Diversity of the bacterioplankton community in the Danjiangkou reservoir can be ranked in the following order: Heijizui ＞Taizishan＞Kuxin＞Songgang＞Qushou. The results of canonical correspondence analysis (CCA) for the relationship between the22 phyla of bacterioplankton and 12environmental factors showed that the T, pH, NH4+-N, and SD were the main environmental factors affecting the distribution characteristics of the bacterioplankton community.

Danjiangkou Reservoir；bacterioplankton；community structure；high-throughput sequencing；environmental factor

X524

A

1000-6923(2017)01-0336-09

陳兆進(jìn)(1985-),男,安徽合肥人,講師,博士,主要從事土水污染控制、修復(fù)與資源化利用研究.發(fā)表論文10余篇.

2016-03-22

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(41601332);河南省教育廳高等學(xué)校重點(diǎn)科研項(xiàng)目(16A210012,14A180015);南陽(yáng)師范學(xué)院高層次人才科研啟動(dòng)費(fèi)資助項(xiàng)目(ZX2014069)

* 責(zé)任作者, 教授, lyying200508@163.com