Inhibitory effect of low intensity ultrasound combined with HSV1-TK/GCV gene carried by cationic microbubbles on high-intensity focused ultrasound incompleted ablation of hepatocellular carcinoma cells

, *, , , ,

(1.Department of Radiology, the Second Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 400010,China; 2.Institute of Ultrasound Imaging, Chongqing Medical University, Chongqing 400010, China;3.Chongqing Key Laboratory of Ultrasound Medical Engineering, Chongqing 400010, China)

Inhibitory effect of low intensity ultrasound combined with HSV1-TK/GCV gene carried by cationic microbubbles on high-intensity focused ultrasound incompleted ablation of hepatocellular carcinoma cells

XIUYangyang1,ZENGYan1*,ZHAOJiannong1,GUODajing1,WANGZhigang2,LIFaqi3

(1.DepartmentofRadiology,theSecondAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400010,China; 2.InstituteofUltrasoundImaging,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400010,China;3.ChongqingKeyLaboratoryofUltrasoundMedicalEngineering,Chongqing400010,China)

Objective To investigate the inhibitory effect of cationic microbubbles loading herpes simplex virus type Ⅰ thymidine kinase/ganciclovir (HSV1-TK/GCV) suicide gene combine with low intensity ultrasound on the residual SMCC-7721 cancer cells after HIFU ablation. Methods SMCC-7721 cells were irradiated with HIFU to select the best residual hepatocellular carcinoma cell subline for stable preservation. Cationic liposomes microbubble loading TK gene were transfected by low intensity ultrasonic radiating. And then they were divided into control group (residual cancer), residual cancer+ultrasound (US)+TK/GCV group, residual cancer+microbubble+TK/GCV group and residual cancer+microbubbles+US+TK/GCV group. Transfection and expression were detected by Western Blot. Flow cytometry was used to observe and detect the gene transfection efficiency. The suitable concentration of GCV was selected, and the survival rate of cells in the same condition of each group was detected. Flow cytometry (FCM) experiments were used to detect cell viability. Results When the HIFU power was 5 W, the frequency was 10.20 MHz, irradiatied last for 40 s， the stable model of the residual cancer was obtained. The optimal concentration of GCV was 100 μg/ml. In the same conditions, the cell survival rate of residual cancer+microbubble+US+TK/GCV group was the lowest ([43.16±3.18]%), and the expression of TK protein was the hightest. The difference was statistically significant (allP<0.05). Conclusion HSV1-TK suicide gene carried by cationic microbubbles have significant inhibitory effect in residual cancer cells after HIFU ablation.

Ultrasonics； Microbubbles； Gene therapy； Carcinoma, hepatocellular

原發(fā)性肝癌是臨床最常見的惡性腫瘤之一[1]。目前，手術(shù)切除癌灶和肝移植是治療早期肝癌較為有效的方法，但多數(shù)患者就診時已屬中晚期，因此開辟新的治療途徑是當(dāng)前肝癌研究的熱點。HIFU可將低能超聲準(zhǔn)確聚焦于腫瘤靶區(qū)產(chǎn)生瞬時高溫、空化效應(yīng)，從而殺滅焦域內(nèi)的癌細(xì)胞。HIFU療效確切，但存在因消融不完全而術(shù)后易復(fù)發(fā)等問題[2]。探索新的輔助療法是近年來的研究方向。單純皰疹病毒Ⅰ型胸苷激酶/更昔洛韋(HSV1-TK/GCV)自殺基因?qū)绨┘?xì)胞具有良好效果[3]。本研究旨在探討載HSV1-TK/GCV自殺基因陽離子微泡聯(lián)合低強度超聲對HIFU不完全消融后殘余肝癌SMCC-7721細(xì)胞的抑制作用。

1 材料與方法

1.1材料與儀器 主要實驗材料及試劑：肝癌SMCC-7721細(xì)胞株(重慶醫(yī)科大學(xué)超聲影像學(xué)研究所贈送)，全氟丙烷，pIRES2-EGFP-TK質(zhì)粒(本實驗室構(gòu)建并保存),二棕桐酞磷脂酞膽堿(dipalmitoyl phosphatidylcholine， DPPC；Avanti公司)，碘化丙啶(Simga公司)，二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇2000(double solid phase epitaxy- polyethylene glycol 2000， DSPE-PEG2000；Avanti公司)，PBS緩沖液，無內(nèi)毒素質(zhì)粒大抽試劑盒(Omega公司)，甘油，DH5α感受態(tài)大腸桿菌(北京天恩澤生物技術(shù)公司),更昔洛韋(南京海辰藥業(yè)有限公司)，RPMI 1640培養(yǎng)液(Gibco公司)，TK1單克隆抗體(Abcam 公司)，澳洲小胎牛血清(Gibco公司)，胰蛋白酶(上海碧云天公司)，二甲基亞砜(dimethylsulfoxide， DMSO)，3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴[3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide， MTT]，Western Blot試劑提取盒(碧云天公司)，內(nèi)參照肌動蛋白(碧云天公司)，辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase， HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體(中衫金橋公司)。主要儀器：海扶CZF型超聲波治療儀，NANODROP 2000超微量分光光度計，Nikon A1R共聚焦顯微鏡，Malvern激光粒徑檢測儀,EXL800酶標(biāo)儀，CGZZ超聲基因轉(zhuǎn)染儀。

1.2 SMCC-7721細(xì)胞培養(yǎng)與處理 應(yīng)用含一定比例滅活胎牛血清、雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)液在37℃、含5%的CO2孵箱中常規(guī)培養(yǎng)SMCC-7721細(xì)胞，48 h更換培養(yǎng)液。待細(xì)胞生長至60%～80%時傾凈培養(yǎng)液，以PBS漂洗2次、0.25%胰蛋白酶消化至細(xì)胞皺縮變圓，加入少量培養(yǎng)液終止消化，經(jīng)離心后加入適量培養(yǎng)液吹打均勻后放入孵箱穩(wěn)定傳代培養(yǎng)。

1.3 建立HIFU輻照殘癌細(xì)胞模型 取對數(shù)期生長的細(xì)胞經(jīng)消化、吹打充分后調(diào)整濃度為1×106/ml的細(xì)胞懸液。每管2 ml分裝至無菌聚乙烯試管，低功率HIFU輻照前將試管置于37℃恒溫水浴箱預(yù)熱10 min。試管下緣與探頭接觸處涂抹少許耦合劑，固定HIFU功率為5 W，頻率10.20 Hz,分別輻照0、10、20、30、40、50、60、70、80 s，并采用熱電耦溫度計實時監(jiān)測其溫度變化，每組重復(fù)3次，輻照結(jié)束1 h后以臺盼藍(lán)染色計數(shù)，檢測急性殺傷率。依據(jù)時間-溫度-急性殺傷率曲線，選擇合適的殘存細(xì)胞作為殘余癌模型進行細(xì)胞生物學(xué)研究。

1.4質(zhì)粒DNA提取及陽離子微泡制取 將質(zhì)粒(pIRES2-EGFP-TK)在瓊脂培養(yǎng)基中振蕩、過夜。通過OMEGA試劑盒提取并擴增質(zhì)粒，以紫外微量分光光度計測其濃度>500 ng/μl、1.8

參照文獻(xiàn)[4]的方法，采用薄膜水化聯(lián)合機械振蕩法制備陽離子微泡。檢測平均粒徑及Zate電位。血球計數(shù)板光鏡下計數(shù)微泡濃度，將制作好的微泡于60Coγ射線滅菌后，-20℃保存、備用。微泡與質(zhì)粒按4∶1體積比混合于EP管中，常溫孵育15 min后低速離心5 min。上層即載基因微泡，下層是游離DNA。重復(fù)操作3次?；蚪Y(jié)合率=[(加入質(zhì)粒量-游離質(zhì)粒量)/加入質(zhì)粒量]×100%；載基因量=(加入質(zhì)粒量-游離質(zhì)粒量)/微泡數(shù)。將上層載基因陽離子微泡重懸于適量的PBS緩沖液中，加入碘化丙啶(propidium iodide， PI)，染液孵育20 min。低速離心、漂洗2次，以去除未結(jié)合的PI熒光，后于熒光及共聚焦顯微鏡下觀察熒光分布情況。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測微泡與質(zhì)粒結(jié)合比例，分析其結(jié)合率。

1.5不同濃度前藥GCV細(xì)胞毒性檢測 收集HIFU輻照后殘存細(xì)胞，行常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞生長穩(wěn)定后，獲得細(xì)胞懸液，并按照每孔5 000個接種于96孔板。24 h后加入終濃度為0、10、100、1 000、10 000、100 000 μg/ml的前藥GCV，每種濃度6復(fù)孔。放入孵箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h后加入MTT 50 μl(工作濃度5 mg/ml),4 h后吸凈培養(yǎng)基并加入DMSO 150 μl，輕微振蕩10 min后于自動酶標(biāo)儀490 nm波長處測定各孔的吸光值，并評估不同濃度前藥GCV對細(xì)胞生存率的影響，確定最適GCV濃度。

1.6 超聲介導(dǎo)載基因陽離子微泡轉(zhuǎn)染細(xì)胞及殺傷效應(yīng)觀察 設(shè)置4個實驗分組，分別為A組(殘余癌)、B組(殘余癌+超聲+TK/GCV)、C組(殘余癌+微泡+TK/GCV)、D組(殘余癌+微泡+超聲+TK/GCV)，其中A組為對照組。將轉(zhuǎn)染前所提取的質(zhì)粒按1∶4的體積比與微泡混合，于4℃冰箱靜置30 min。使其相互吸附后加入適量不完全培養(yǎng)基。調(diào)整殘余癌細(xì)胞2×105/ml接種于24孔板，每組6復(fù)孔(n=3)，微泡濃度1×108/ml。超聲輻照強度0.5 W/cm2，輻照30 s，微泡與TK體積比為4∶1，其余條件各組間均保持一致。通過低頻超聲擊破載基因的陽離子微泡使目的基因定向釋放入細(xì)胞，轉(zhuǎn)染孵育4～6 h后更換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染24 h后加入適宜濃度的前藥GCV，共孵育48 h后，MTT法檢測吸光值，觀察細(xì)胞抑制率。以流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期變化。

1.7Western Blot檢測各組TK蛋白表達(dá) 基因轉(zhuǎn)染72 h后收集各組細(xì)胞總蛋白，-20℃暫時保存，行Western Blot檢測，經(jīng)電泳-轉(zhuǎn)膜-封閉等步驟后，加入抗TK1單抗，4℃下?lián)u床搖動，封閉、過夜，Tris緩沖鹽溶液沖洗4次、每次沖洗10 min。而后加入二抗(1∶5000，辣根過氧化物酶標(biāo)記)室溫?fù)u動，孵育2 h,再經(jīng)室溫洗膜、顯影、曝光等步驟，采用灰度分析軟件Quantity One對目的條帶和內(nèi)參照β-肌動蛋白的灰度值進行分析。

2 結(jié)果

2.1 HIFU輻照細(xì)胞懸液的時間與溫度、急性殺傷率 在HIFU輻照強度一定的條件下，SMCC-7721細(xì)胞懸液隨著輻照時間延長，溫度升高，對細(xì)胞的急性殺傷作用增強，其時間-溫度-急性殺傷率曲線見圖1。輻照時間為40 s時細(xì)胞出現(xiàn)明顯的生存界限。

圖1 肝癌SMCC-7721細(xì)胞HIFU輻照時間-溫度-急性殺傷率曲線

2.2載基因微泡 制備的微泡粒徑較為均一，形態(tài)、分散度良好。微泡粒徑(542.80±24.00)nm，電荷(40.13±1.50)mV。制備的納米級陽離子微泡可與帶微弱負(fù)電荷的質(zhì)粒相結(jié)合(圖2)。載基因量為3.6 μg/108微泡，基因結(jié)合率為(32.18±4.26)%。

2.3 不同濃度前藥GCV的細(xì)胞毒性 濃度為10、100、1 000、10 000、100 000 μg/ml時細(xì)胞抑制率分別為(3.23±0.13)%、(8.42±1.57)%、(11.80±0.58)%、(43.10±1.38)%、(72.10±1.08)%。前藥GCV濃度≥1 000 μg/ml時對癌細(xì)胞具有明顯毒性作用(圖3)，當(dāng)濃度≤100 μg/ml時細(xì)胞生存率大于90%對細(xì)胞無明顯影響。為發(fā)揮GCV最大生物學(xué)效應(yīng)同時對細(xì)胞生存率無明顯影響，擇取最適濃度為100 μg/ml。

2.4 低強度超聲聯(lián)合載HSV1-TK/GCV陽離子微泡對殘癌細(xì)胞的殺傷效應(yīng) MTT法檢測各組細(xì)胞的存活率結(jié)果為：A組細(xì)胞存活率100%，B組存活率為(93.38±1.32)%，C組細(xì)胞存活率(82.03±1.40)%，D組細(xì)胞存活率僅為(43.16±3.18)%，且細(xì)胞被抑制于S期。4組細(xì)胞存活率總體差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=245.5，P<0.05)，組間兩兩比較D組細(xì)胞存活率顯著低于其他3組(P<0.05)；C組與A組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，B組與A組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

圖2 共聚焦顯微鏡下的質(zhì)粒與微泡的連接情況 A.紅光顯示； B.紅白光顯示 圖3 不同濃度前藥GCV孵育48 h后細(xì)胞抑制率 (對照組、濃度1、濃度2、濃度3、濃度4、濃度5分別表示濃度為0、10、100、1 000、10 000、100 000 μg/ml) 圖4 各組TK蛋白的表達(dá)情況

2.5TK蛋白表達(dá) 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染72 h后，各組TK蛋白的表達(dá)情況見圖4。各處理組TK蛋白與β-肌動蛋白灰度值的相對比值分別為：A組0.18±0.12，B組0.38±0.16，C組0.54±0.06，D組0.84±0.10。4組間TK蛋白表達(dá)的總體差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=5.954，P<0.05)，D組TK蛋白表達(dá)量顯著高于其他3組，差異有統(tǒng)計意義(P<0.05)。C組與A組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，B組與A組間無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。

3 討論

HIFU輻照對癌細(xì)胞的殺傷作用應(yīng)得到廣泛認(rèn)同[5-6]，但因存在治療盲區(qū)、呼吸運動影響導(dǎo)致消融不完全等問題[7-8]。有研究[5]報道，熱處理后肝癌細(xì)胞可表現(xiàn)出更強的增殖能力及熱耐受能力，可能是促進HIFU術(shù)后惡性進展或復(fù)發(fā)因素之一。HSV1-TK/GCV自殺基因系統(tǒng)通過被轉(zhuǎn)染該基因的細(xì)胞表達(dá)胸苷激酶，催化胸苷的磷酸化，并將無毒性的丙氧鳥苷轉(zhuǎn)化為具有細(xì)胞毒性的三磷酸丙氧鳥苷，從而阻斷DNA復(fù)制，達(dá)到治療腫瘤的目的[9]。即使腫瘤組織中僅有少量TK基因成功轉(zhuǎn)染，亦可使多數(shù)瘤組織消退?；蜣D(zhuǎn)染載體種類繁多，生物安全性和轉(zhuǎn)染效率是其能否應(yīng)用于臨床的首要慮因素。陽離子脂質(zhì)體表面被修飾后帶有微弱正電荷，通過靜電吸附于帶有負(fù)電荷的質(zhì)粒DNA，因無免疫原性、易制備且轉(zhuǎn)染效率較高[10]被認(rèn)為是一種安全高效的基因載體，但其靶向性欠佳。為解決這一難題，超聲靶向微泡破裂(ultrasound targeted microbubble destruction， UTMD)法應(yīng)運而生。UTMD是利用低強度超聲定向破壞攜帶基因或藥物的脂質(zhì)微泡，使被攜帶的治療基因或藥物可以定位釋放于低強度超聲輻照范圍內(nèi)，實現(xiàn)靶區(qū)的高效基因轉(zhuǎn)染或釋藥[11-12]，因其靶向性強且安全性高而備受青睞[13]。

本研究成功將納米級陽離子微泡與帶熒光標(biāo)簽的TK基因通過靜電吸附作用相結(jié)合，以低強度超聲定向破碎載基因微泡，達(dá)到釋放基因的目的，輔助前藥GCV作用于HIFU后不完全消融的SMCC-7721細(xì)胞，實現(xiàn)治療作用，基因轉(zhuǎn)染效率較高，對細(xì)胞無毒副作用。本研究顯示，殘余癌+微泡+超聲+TK/GCV組TK蛋白的表達(dá)明顯高于其他各組(P<0.05)，且腫瘤殘余細(xì)胞被大量殺傷，被明顯抑制于S期，提示單獨超聲及微泡處理均可稍提高TK蛋白表達(dá)量，而超聲與微泡的聯(lián)合則可進一步增加TK蛋白表達(dá)量。且陽離子微泡載HSV1-TK/GCV聯(lián)合低強度超聲較單獨超聲處理組和單獨微泡處理組均有更強的殺傷力，兩者存在一定的協(xié)同效應(yīng)。采用低強度超聲輻照載HSV1-TK基因納米級陽離子微泡，定向釋放TK基因聯(lián)合HIFU技術(shù)，既可提高基因轉(zhuǎn)染效率，又可通過微泡的空化效應(yīng)增敏HIFU治療[14]。此外，整個治療過程微創(chuàng)，安全性高、可行性強。

本實驗初步證實低強度超聲聯(lián)合載HSV1-TK/GCV基因的納米級陽離子微泡對HIFU不完全消融SMCC-7721細(xì)胞后殘余癌有良好的殺傷作用。在后續(xù)的動物模型實驗中，本課題組將在陽離子微泡表面連接特異性抗體，對載基因微泡主動識別腫瘤組織進一步研究。

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重慶市衛(wèi)生局重點項目(20131021)。

修陽陽(1990—)，女，河南平頂山人，在讀碩士。研究方向：影像醫(yī)學(xué)與核醫(yī)學(xué)。E-mail: 1083602799@qq.com

曾燕，重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院放射科，400010。E-mail: 1294583212@qq.com

2016-06-30

2016-08-15

低強度超聲聯(lián)合載HSV1-TK/GCV自殺基因陽離子微泡對高強度聚焦超聲不完全消融后殘余肝癌細(xì)胞的抑制作用

修陽陽1，曾 燕1*，趙建農(nóng)1，郭大靜1，王志剛2，李發(fā)琪3

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院放射科，重慶 400010；2.重慶醫(yī)科大學(xué)超聲分子影像學(xué)研究所，重慶 400010；3.超聲醫(yī)學(xué)工程重慶市市級重點實驗室，重慶 400010)

超聲學(xué)；微泡；基因治療；癌，肝細(xì)胞

R735; R445.1

A

1672-8475(2017)01-0045-05

目的 探討載單純皰疹病毒Ⅰ型胸苷激酶/更昔洛韋(HSV1-TK/GCV)自殺基因的陽離子微泡聯(lián)合低強度超聲對高強度聚焦超聲(HIFU)輻照后殘留肝癌SMCC-7721細(xì)胞的抑制作用。方法 以低功率HIFU輻照肝癌SMCC-7721細(xì)胞，選取最佳殘存細(xì)胞亞系并穩(wěn)定培養(yǎng)。通過低強度超聲輻照載TK基因的陽離子微泡轉(zhuǎn)染細(xì)胞。分為對照組(殘余癌)、殘余癌+超聲+TK/GCV組、殘余癌+微泡+TK/GCV組及殘余癌+微泡+超聲+TK/GCV組。以Western Blot法檢測TK基因是否成功轉(zhuǎn)入并穩(wěn)定表達(dá)。采用流式細(xì)胞儀觀察并檢測基因轉(zhuǎn)染效率。篩選適宜前藥GCV濃度，并檢測各組別相同條件下細(xì)胞存活率。以流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期及凋亡率。結(jié)果 HIFU功率為5 W，頻率為10.20 MHz，持續(xù)輻照40 s，可獲得殘癌穩(wěn)定模型。前藥GCV的最適濃度為100 μg/ml。相同條件下殘余癌+微泡+超聲+TK/GCV組癌細(xì)胞存活率最低(P<0.05)，僅為(43.16±3.18)%，且TK蛋白的表達(dá)明顯高于其他各組(P均<0.05)。結(jié)論 低強度超聲聯(lián)合載HSV1-TK/GCV自殺基因陽離子微泡對高強度聚焦超聲不完全消融肝癌細(xì)胞有明顯抑制作用。

10.13929/j.1672-8475.201606030