IL-18對(duì)胰腺星狀細(xì)胞及其趨化因子CX3CL1表達(dá)的影響

王茜 陳浩宇 陳潔

·論著·

IL-18對(duì)胰腺星狀細(xì)胞及其趨化因子CX3CL1表達(dá)的影響

王茜 陳浩宇 陳潔

目的 觀察IL-18對(duì)胰腺星狀細(xì)胞E-鈣黏素(E-cadherin)、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)及趨化因子CX3CL1表達(dá)水平的影響。方法 人胰腺星狀細(xì)胞(PSCs)株HPaSteC常規(guī)培養(yǎng)、傳代，應(yīng)用5、25、50、100 μg/L IL-18干預(yù)72 h，以未干預(yù)細(xì)胞為對(duì)照組。收集各組細(xì)胞，采用RT-PCR和蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)細(xì)胞E-cadherin、α-SMA、CX3CL1 mRNA及蛋白表達(dá)量。結(jié)果 對(duì)照組及5、25、50、100 μg/L IL-18干預(yù)組PSCs的E-cadherin mRNA表達(dá)量分別為1.03±0.17、0.77±0.15、0.89±0.12、0.54±0.11、0.46±0.06；α-SMA mRNA表達(dá)量為1.03±0.19、0.85±0.14、1.33±0.22、1.60±0.14、1.94±0.09；CX3CL1 mRNA表達(dá)量為1.01±0.08、0.88±0.25、0.86±0.17、1.58±0.26、1.83±0.13。干預(yù)組E-cadherin mRNA的表達(dá)下調(diào)，α-SMA及CX3CL1mRNA表達(dá)上調(diào)，其中100 μg/L干預(yù)組與對(duì)照組的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或<0.01)。對(duì)照組及5、25、50、100 μg/L IL-18干預(yù)組PSCs的E-cadherin蛋白表達(dá)量分別為1.00±0.14、1.14±0.04、1.14±0.07、0.85±0.08、0.80±0.06；α-SMA蛋白表達(dá)量為1.00±0.02、0.77±0.07、1.29±0.02、1.59±0.07、1.70±0.02；CX3CL1蛋白表達(dá)量分別為1.00±0.05、1.03±0.05、1.37±0.06、1.46±0.18、1.45±0.12。干預(yù)組E-cadherin蛋白表達(dá)下調(diào)，但各組間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；α-SMA蛋白表達(dá)上調(diào)，25、50、100 μg/L IL-18干預(yù)組與對(duì)照組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.01)；CX3CL1蛋白表達(dá)上調(diào)，其中100 μg/L干預(yù)組與對(duì)照組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 IL-18能激活人PSCs并上調(diào)PSCs趨化因子CX3CL1的表達(dá)。

胰腺； 星形細(xì)胞； 胰腺炎，慢性； 趨化因子CX3CL1； 白細(xì)胞介素18

Fund program：Youth Science Foundation，National Natural Science Foundation of China(81300352)

胰腺星狀細(xì)胞(pancreatic stellate cells，PSCs)不僅能分泌多種炎性因子和趨化因子參與炎性過(guò)程，而且能分泌膠原，在組織再生和纖維化中發(fā)揮關(guān)鍵作用[1]。PSCs一般處于靜息狀態(tài)，不表達(dá)α-平滑肌肌蛋白(α-SMA)，但被激活后α-SMA表達(dá)增加[2]。PSCs的激活是胰腺發(fā)生纖維化的主要原因。趨化因子CX3CL1在急性胰腺炎(AP)及慢性胰腺炎(CP)中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，急性壞死性胰腺炎大鼠及CP患者的血清CX3CL1水平升高[3]。飲酒的CP患者血清CX3CL1水平升高更顯著，因酒精協(xié)同刺激PSCs分泌CX3CL1[4]，提示血清CX3CL1水平升高可能具有致病作用。IL-18是IL-1家族的細(xì)胞因子，有免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)作用[5]。IL-18作用于Th1細(xì)胞，刺激干擾素-γ和其他細(xì)胞因子的產(chǎn)生，可能通過(guò)激活PSCs和上調(diào)趨化因子CX3CL1表達(dá)參與CP的胰腺纖維化過(guò)程。本研究應(yīng)用不同濃度IL-18干預(yù)PSCs，觀察E-鈣黏素(E-cadherin)、α-SMA、CX3CL1 mRNA和蛋白表達(dá)量的變化，探討IL-18的作用機(jī)制。

材料與方法

一、IL-18干預(yù)人PSCs

人PSCs株HPaSteC購(gòu)自Science Cell公司，常規(guī)培養(yǎng)、傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于6孔板，每孔5×105個(gè)細(xì)胞。培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)80%后在各孔中分別加入終濃度為5、25、50、100 μg/L的IL-18(Biovision公司)，以未干預(yù)細(xì)胞作為對(duì)照組，孵育72 h后收集細(xì)胞。

二、E-cadherin、α-SMA、CX3CL1 mRNA表達(dá)量的檢測(cè)

收集IL-18干預(yù)72 h的細(xì)胞，用TRIzol(Invitrogen公司)提取細(xì)胞總RNA，采用RT試劑盒(Fermentas公司)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用實(shí)時(shí)PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞E-cadherin、α-SMA、CX3CL1 mRNA表達(dá)量，按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。E-cadherin正義序列5′-ATTTTTCCCTCGACACCCGAT-3′，反義序列5′-TCCCAGGCGTAGACCAAGA-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物109 bp；α-SMA正義序列5′-CTGCTGAGCGTGAGATTGTC-3′，反義序列5′-TCAAGGGAGGATGAGGATGC-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物103 bp；CX3CL1(FKN)正義序列5′-ACCACGGTGTGACGAAATG-3′，反義序列5′-TGTTGATAGTGGATGAGCAAAGC-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物82 bp；內(nèi)參GAPDH正義序列5′-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3′，反義序列5′-GCCATCACGCCACAGTTC-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物101 bp。引物由華大基因設(shè)計(jì)并合成。PCR反應(yīng)條件：94℃ 2 min；94℃ 30 s、50℃ 30 s、72℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)。用illumina eco實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀自帶軟件獲得Ct值，以對(duì)照組細(xì)胞的表達(dá)量為1，采用公式2-△△Ct計(jì)算IL-18干預(yù)組細(xì)胞 E-cadherin、α-SMA、CX3CL1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

三、E-cadherin、α-SMA、CX3CL1蛋白表達(dá)量的檢測(cè)

收集上述各組細(xì)胞，常規(guī)提取總蛋白，BCA 法定量蛋白后行蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)E-cadherin、α-SMA、CX3CL1蛋白表達(dá)量，以Tubulin為內(nèi)參。小鼠抗人E-cadherin一抗購(gòu)自Proteintech公司，工作濃度1∶8 000；小鼠抗人α-SMA一抗購(gòu)自Abcam公司，工作濃度1∶300；小鼠抗人CX3CL1一抗購(gòu)自Proteintech公司，工作濃度1∶500；小鼠抗人Tubulin購(gòu)自Sigma公司，工作濃度1∶5 000；HRP標(biāo)記羊抗小鼠二抗、HRP標(biāo)記兔抗羊二抗購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司，工作濃度1∶50 000。ECL底物液購(gòu)自Thermo公司。應(yīng)用Image J軟件進(jìn)行條帶掃描，以目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值比表示蛋白相對(duì)表達(dá)量。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、各組E-cadherin、α-SMA、CX3CL1 mRNA表達(dá)量

對(duì)照組及5、25、50、100 μg/L IL-18干預(yù)組PSCs的E-cadherin mRNA表達(dá)量分別為1.03±0.17、0.77±0.15、0.89±0.12、0.54±0.11、0.46±0.06，呈濃度依賴(lài)性下降趨勢(shì)，其中100 μg/L干預(yù)組與對(duì)照組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.08，P<0.05)。

對(duì)照組及5、25、50、100 μg/L IL-18干預(yù)組PSCs 的α-SMA mRNA表達(dá)量分別為1.03±0.19、0.85±0.14、1.33±0.22、1.60±0.14、1.94±0.09，呈濃度依賴(lài)性升高趨勢(shì)，其中100 μg/L干預(yù)組與對(duì)照組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.27，P<0.05)。

對(duì)照組及5、25、50、100 μg/L IL-18干預(yù)組PSCs 的CX3CL1 mRNA表達(dá)量分別為1.01±0.08、0.88±0.25、0.86±0.17、1.58±0.26、1.83±0.13，5、25 μg/L IL-18干預(yù)組表達(dá)量低于對(duì)照組，50、100 μg/L干預(yù)組表達(dá)量高于對(duì)照組，其中100 μg/L干預(yù)組與對(duì)照組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.32，P<0.01)。

二、各組E-cadherin、α-SMA、CX3CL1 蛋白表達(dá)量(圖1)

對(duì)照組及5、25、50、100 μg/L IL-18干預(yù)組PSCs 的E-cadherin 蛋白表達(dá)量分別為1.00±0.14、1.14±0.04、1.14±0.07、0.85±0.08、0.80±0.06，呈濃度依賴(lài)性下降趨勢(shì)，但各組間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 對(duì)照組(1)及5、25、50、100 μg/L IL-18干預(yù)組(2、3、4、5)PSCs的E-cadherin、α-SMA、CX3CL1蛋白表達(dá)

對(duì)照組及5、25、50、100 μg/L IL-18干預(yù)組PSCs的α-SMA蛋白表達(dá)量分別為1.00±0.02、0.77±0.07、1.29±0.02、1.59±0.07、1.70±0.02，呈濃度依賴(lài)性升高趨勢(shì)，25、50、100 μg/L IL-18干預(yù)組與對(duì)照間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為9.90、7.88、26.84，P值均<0.01)。

對(duì)照組及5、25、50、100 μg/L IL-18干預(yù)組PSCs的CX3CL1蛋白表達(dá)量分別為1.00±0.05、1.03±0.05，1.37±0.06、1.46±0.18、1.45±0.12，呈濃度依賴(lài)性升高趨勢(shì)，其中100 μg/L干預(yù)組與對(duì)照組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.40，P<0.05)。

討 論

目前為止，人們對(duì)于CP發(fā)病機(jī)制的了解還處于探索階段。趨化因子CX3CL1是CX3C家族獨(dú)特成員,是一種具有黏附功能的炎性趨化因子，它參與腎臟纖維化的病理生理過(guò)程[6]。本課題組曾報(bào)道[7]，CP大鼠的胰腺腺泡細(xì)胞、胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞、炎癥細(xì)胞、胰島細(xì)胞及α-SMA陽(yáng)性的活化PSCs均高表達(dá)IL-18和CX3CL1，提示IL-18和CX3CL1可能參與CP的纖維化進(jìn)程。田軼倫和姜德謙[8]應(yīng)用25、50、100 μg/L IL-18干預(yù)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，結(jié)果顯示IL-18能夠上調(diào)CX3CL1的表達(dá)并增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞的趨化作用。Schneider等[9]報(bào)道，CP患者血清IL-18水平顯著升高。王麗敏等[10]報(bào)道，IL-18可能通過(guò)上調(diào)CX3CL1的表達(dá)增強(qiáng)其趨化作用來(lái)參與炎性反應(yīng)。PSCs激活后CX3CL1表達(dá)增加，進(jìn)一步促進(jìn)胰腺纖維化形成。

本研究結(jié)果顯示，100 μg/L IL-18干預(yù)能夠促進(jìn)α-SMA mRNA和蛋白表達(dá)增加，刺激PSCs激活；同時(shí)上調(diào)PSCs的CX3CL1表達(dá)，參與胰腺纖維化進(jìn)程。關(guān)于CX3CL1表達(dá)上調(diào)機(jī)制的研究，目前相對(duì)較少。Uchida1等[5]報(bào)道，酒精通過(guò)激活PSCs的細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)和解聯(lián)蛋白-金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域17(a disintegrin and metalloprotease domain，ADAM17)，協(xié)同刺激PSCs釋放CX3CL1，ERK/ MAPK參與CX3CL1基因轉(zhuǎn)錄和產(chǎn)物分泌，但也存在其他因素參與的可能，如NF-κB或者干擾素調(diào)節(jié)因子[5]。關(guān)于PSCs激活后CX3CL1表達(dá)上調(diào)機(jī)制還有待更多研究。

[1] Apte MV, Haber PS, Applegate TL, et al. Periacinar stellate shaped cells in rat pancreas: identification, isolation, and culture[J]. Gut, 1998,43(1):128-133.

[2] Phillips PA, McCarroll JA, Park S, et al. Rat pancreatic stellate cells secrete matrix metalloproteinases: implications for extracellular matrix turnover[J]. Gut, 2003,52(2):275-282.

[3] Huang LY, Chen P, Xu LX, et al. Fractalkine as a marker for assessment of severe acute pancreatitis[J]. J Dig Dis, 2012,13(4):225-231.DOI: 10.1111/j.1751-2980.2012.00580.x.

[4] Uchida M, Ito T, Nakamura T, et al. ERK pathway and sheddases play an essential role in ethanol-induced CX3CL1 release in pancreatic stellate cells[J]. Lab Invest, 2013,93(1):41-53.DOI:10.1038/labinvest.2012.156.

[5] Dinarello CA. IL-18: A TH1-inducing, proinflammatory cytokine and new member of the IL-1 family[J]. J Allergy Clin Immunol, 1999,103(1pt1):11-24.

[6] Koziolek MJ, Muller GA, Zapf A, et al. Role of CX3C-chemokine CX3C-L/fractalkine expression in a model of slowly progressive renal failure[J]. Nephrol Dial Transplant, 2010,25(3):684-698.DOI:10.1093/ndt/gfp602.

[7] 陳浩宇, 王茜, 陳潔. IL-18及趨化因子CX3CL1在慢性胰腺炎大鼠胰腺纖維化中的表達(dá)及其意義[J]. 中華胰腺病雜志, 2016,16:115-118.DOI:10.3760/cma.j.issn.1647-1935.2016.02.009.

[8] 田軼倫, 姜德謙. 白細(xì)胞介素-18對(duì)Fractalkine表達(dá)和趨化作用的影響[J]. 實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué), 2009,16:672-675.

[9] Schneider A, Haas SL, Hildenbrand R, et al. Enhanced expression of interleukin-18 in serum and pancreas of patients with chronic pancreatitis[J]. World J Gastroenterol, 2006,12(40):6507-6514.

[10] 王麗敏, 李春玉, 張佳濱,等.分形素趨化因子在腎臟纖維化大鼠腎組織中的表達(dá)及IL-18結(jié)合蛋白對(duì)其表達(dá)的影響[J]. 中國(guó)當(dāng)代兒科雜志, 2013,15:1134-1138.DOI:10.7499/j.issn.1008-8830.2013.12.024.

(本文編輯：屠振興)

The influence of IL-18 on pancreatic stellate cells and CX3CL1 expression

WangQian,ChenHaoyu,ChenJie.

DepartmentofGastroenterology,ChanghaiHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China

Objective To evaluate the effect of IL-18 on the expression of E-cadherin, α-SMA and CX3CL1 in pancreatic stellate cells(PSCs). Methods The human PSC line HPaSteC was routinely cultured and passaged. Five, 25, 50 and 100 μg/L IL-18 was used to treat PSCs for 72 h and the untreated PSCs were used as control. Treated and untreated cells were both collected, and RT-PCR and Western blot were used to detect mRNA and protein expression of E-cadherin, α-SMA and CX3CL1 respectively. Results The mRNA expressions of E-cadherin in control group and 5, 25, 50 and 100 μg/L IL-18 treated group were 1.03±0.17, 0.77±0.15, 0.89±0.12, 0.54±0.11 and 0.46±0.06. The mRNA expression of α-SMA were 1.03±0.19, 0.85±0.14, 1.33±0.22, 1.60±0.14 and 1.94±0.09；The mRNA expression of CX3CL1 were 1.01±0.08, 0.88±0.25, 0.86±0.17, 1.58±0.26 and 1.83±0.13. The mRNA expression of E-cadherin in IL-18 treated group were down-regulated , while the mRNA expression of α-SMA and CX3CL1 were up-regulated, and the differences between control and IL-18 100 μg/L treated group were statistically significant (P<0.05 or <0.01). The protein expression of E-cadherin in control group and 5, 25, 50 and 100 μg/L IL-18 treated group were 1.00±0.14，1.14±0.04, 1.14±0.07, 0.85±0.08 and 0.80±0.06. The protein expression of α-SMA were 1.00±0.02, 0.77±0.07, 1.29±0.02, 1.59±0.07 and 1.70±0.02；The protein expression of CX3CL1 were 1.00±0.05, 1.03±0.05, 1.37±0.06, 1.46±0.18 and 1.45±0.12. The protein expression of E-cadherin was down-regulated but no significant differences were observed among different groups. The protein expression of α-SMA was up-regulated and the differences between control group and 25, 50 and 100 μg/L IL-18 treated groups were statistically significant (allP<0.01). The protein expression of CX3CL1 was up-regulated and the differences between control group and 100 ng/ml IL-18 treated group were statistically significant (P<0.05). Conclusions IL-18 can activate PSCs and up-regulate the expression of chemokine CX3CL1.

Pancreas; Astrocytes; Panceatitis, chronic; Chemokine CX3CL1; Interleukin-18

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2017.01.008

200433 上海，第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院消化內(nèi)科

陳潔，Email: jiechen0115@sohu.com

國(guó)家自然基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目(81300352)

2016-09-19)