細胞核移植技術(shù)簡介

于彥軍

(新疆烏蘇市第一中學 833000)

自1997年首次報道Wilmut以成年綿羊乳腺上皮細胞為核供體的克隆羊“Dolly”誕生以來，研究人員相繼以牛、豬、猴、兔、鼠、山羊和貓等哺乳動物為研究對象，進行多種體細胞克隆的研究。目前，標準的細胞核移植方法包括3個基本步驟：卵母細胞去核、供體核 (或者細胞)植入、重構(gòu)胚的激活。然后將克隆胚胎體外培養(yǎng)后移植入代孕母體。

1 卵母細胞的去核技術(shù)

建立一種損傷小、可重復性高、效率高的去核方法是核移植成功的重要保障。準確而快速地去除卵母細胞的核是實驗的關(guān)鍵。目前，有多種去核方法成功應(yīng)用于哺乳動物的核移植中。

1.1 盲吸法 將卵母細胞放在含一定濃度的細胞松弛素B(CB)顯微操作液中，孵育一定時間后，固定住卵母細胞，吸出第一極體及其附近的適量胞質(zhì)(約1/4～1/3)。缺點是由于該法去除的細胞質(zhì)較多，降低了核移植后重構(gòu)胚的發(fā)育能力。也有通過激活卵母細胞，再去除末期卵母細胞染色體的方法。

1.2 半卵法 在顯微操作儀下，切開透明帶，將吸出的一半細胞質(zhì)送入另一個空透明帶內(nèi)，然后再用熒光染料Hoeehest33342染色，以確定哪一半胞質(zhì)有核物質(zhì)。在標準體細胞核移植中，透明帶是保存的，因為透明帶被認為在支持胚胎的發(fā)育中起重要作用。

1.3 功能性去核法 將受體卵母細胞放置在Hoeehest染液中，用激光或紫外線照射，使卵母細胞核喪失功能，從而實現(xiàn)去核目的。

1.4 蔗糖輔助去核法 在含一定濃度的蔗糖和一定濃度的CB顯微操作液中，預處理卵母細胞10 min，待卵母細胞邊緣有突起時，在此區(qū)上方將透明帶切開1/4～1/5的周長，然后一并吸出突起部位以及附近的少量胞質(zhì)和第一極體。蔗糖輔助去核法能確定卵母細胞減數(shù)分裂II期(MII)核的位置，可避免熒光染色的不利因素。但蔗糖的滲透壓對卵母細胞形態(tài)發(fā)育有影響，通常很難達到較好的去核效果。

1.5 化學去核法 在卵母細胞減數(shù)分裂的過程中，添加化學誘導劑，以破壞紡錘體微管的功能，使得極體不與核染色體發(fā)生分離，極體與核染色體一起被排到卵周隙，以達到去核目的。例如，將卵母細胞依次移入含脫羰秋水仙堿(DC)和DC+放線菌酮(CHX)的KSOM 培養(yǎng)液中培養(yǎng)，直到第一極體排出。其整個去核過程不需顯微操作儀。該方法易于操作、簡單。但研究發(fā)現(xiàn)，在利用不同的化學誘導劑誘導去核后，胞質(zhì)中重構(gòu)胚發(fā)育的能力不同，且發(fā)育率較低，因而限制了該方法的廣泛應(yīng)用。

1.6 化學輔助去核法 在化學誘導法基礎(chǔ)上對其進行改進，例如，用脫羰秋水仙堿處理排出第一極體的卵母細胞，使卵胞質(zhì)中含染色體的部分形成一個胞質(zhì)突起，用以確定核所在位置，然后通過顯微操作，一并去除核及第一極體，達到去核目的，此法稱為化學輔助去核法。由于該法化學誘導劑作用時間短，可減少對胞質(zhì)的毒副作用，胞質(zhì)去除量也少。

1.7 熒光染色去核法 將卵母細胞置于含CB(7.5mg/L)和Hoechest33342(5 mg/L)的FHM 中一定時間[1]。在紫外光下，卵母細胞的紡錘體呈淡紫色。先刺破透明帶，挑出第一極體，再一并吸出紡錘體復合體及周圍少量細胞質(zhì)。去核完成后，再置于Hoechest33342(5 mg/L)的FHM 中，紫外光下鑒定去核的卵母細胞是否殘留染色質(zhì)以判定去核率。結(jié)合DNA 染色熒光檢測技術(shù)，可以明確細胞核的位置，以確保高的去核率，但也產(chǎn)生紫外光照射的不利影響。

2 供體核 (或者細胞)植入的技術(shù)

2.1 “Honolulu”法 借助Piezo裝置，向胞質(zhì)內(nèi)直接注射的方法稱為“Honolulu”法。該方法是利用瞬間高電壓，在卵母細胞的透明帶上打出小孔，從而將供體細胞核直接注入去核的卵母細胞質(zhì)中。該方法可降低對卵母細胞的機械損傷，提高操作效率，但需要昂貴的Piezo設(shè)備。

2.2 電融合法 動物細胞融合技術(shù)的出現(xiàn)，給核移植一個新的啟示，隨之產(chǎn)生了電融合法。電融合法是指把整個供核細胞注射到透明帶和卵胞質(zhì)膜之間，再利用一定強度的直流脈沖刺激，使供體細胞與去核卵母細胞融合，進而使供體核進入受體卵母細胞中。

2.3 去透明帶法 2005年，Ribas等先用鏈蛋白酶或泰洛乳酸[1]去除卵母細胞透明帶后，再去核，接著用植物血凝素做黏合劑，將去除透明帶的卵母細胞和供體細胞粘在一起，再進行電融合。此方法經(jīng)歷去透明帶、去核、黏合、融合4個步驟。其優(yōu)點是無需昂貴的Piezo設(shè)備，同時減少了去核和注核過程中對卵母細胞的損傷。缺點：①增加了化學試劑對重構(gòu)胚的損傷；②在融合時，卵胞質(zhì)膜和電極直接接觸，加大細胞損傷的可能性。

2.4 連續(xù)核移植法 連續(xù)核移植法是先將供體核移入第一受體細胞，再移入第二受體細胞。 通常以去核的MⅡ期卵母細胞為第一受體細胞， 以去核的單細胞胚胎為第二受體細胞。研究表明，連續(xù)核移植法可延長母系胞質(zhì)因子和染色質(zhì)間的接觸時間，有利于促進核的重編程，從而利于提高核的發(fā)育潛力。但更多的體外操作很容易對胚胎造成亞細胞水平的傷害。

2.5 反向核移植法 反向核移植法是將供體細胞注入未去核的卵母細胞中，經(jīng)適當處理讓第二極體排出。用注核針再吸去第二極體及其附近的少量胞質(zhì)。也就是說，反向核移植法就是先注核，待胚胎激活后再去核。多項研究表明，反向核移植法在提高核移植胚胎的存活率上較傳統(tǒng)的核移植方法好[2]。

3 重構(gòu)胚的激活技術(shù)

重構(gòu)胚激活的終極目標是要使處于MⅡ期的卵母細胞恢復分裂周期[3]。MⅡ期的卵母細胞由于持續(xù)高水平的成熟促進因子(MPF)和細胞靜止因子(CSF)的存在，導致其不能進入到末期。因此，卵母細胞中的MPF和CSF活性的下降或消失才能恢復分裂周期。自然受精過程中，胚的激活是在精子的穿透作用下，胞質(zhì)中鈣離子水平升高，從而導致MPF減少而實現(xiàn)的[2]。任何能夠讓胞質(zhì)中鈣離子水平增高的機制都可以激活重構(gòu)胚，包括電激活、機械激活和化學激活。常用的激活方法是化學法、電脈沖法。

3.1 物理激活 在物理激活方法中，溫度刺激和機械刺激因其操作繁瑣，重復性和穩(wěn)定性差，且孤雌激活率偏低而較少采用。反之，電刺激激活法因簡便易行、重復性和穩(wěn)定性較好，且將激活和融合成為一體而被廣泛應(yīng)用。電激活的原理是利用短暫高壓的直流電脈沖使細胞膜出現(xiàn)穿孔，造成細胞內(nèi)外的離子和大分子發(fā)生短暫流動，引起Ca2+內(nèi)流，使細胞內(nèi)Ca2+脈沖升高而激活細胞[4]。

3.2 化學激活 近年來，人們開始用結(jié)果較穩(wěn)定、重復性高的化學激活方法來激活卵母細胞。在大多數(shù)哺乳動物中，排出的卵母細胞都停留在MⅡ期不再分裂。卵母細胞直至被精子受精激活或人工誘導激活，才完成第二次分裂。常用乙醇、離子霉素(Ion)、CHX和二甲氨基嘌呤(6-DMAP)等中的一種或若干種聯(lián)合激活：①乙醇對卵母細胞的激活。乙醇是發(fā)現(xiàn)較早的一種化學激活劑，乙醇能水解細胞膜上4，5-二磷酸磷脂酰肌醇，產(chǎn)生1，4，5-三磷酸肌醇，從而使細胞內(nèi)源鈣釋放到細胞質(zhì)，造成胞內(nèi)的鈣離子濃度升高。②Ion是近年來發(fā)現(xiàn)的一種高效Ca2+載體，已在哺乳動物卵母細胞的激活中廣泛應(yīng)用。Ion并不直接造成Ca2+的跨膜轉(zhuǎn)運，而是動員細胞內(nèi)的Ca2+，依次觸發(fā)Ca2+的內(nèi)流，導致細胞內(nèi)Ca2+升高，從而激活卵母細胞。③6-DAMP和CHX對卵母細胞的激活。6-DMAP是一種蛋白質(zhì)磷酸化抑制劑，它既能阻止蛋白質(zhì)磷酸化，又能抑制CSF和MPF的活性。CHX是一種蛋白質(zhì)合成抑制劑，主要抑制維持卵母細胞在MⅡ期所需的CSF和MPF的合成，從而使卵母細胞中MPF活性迅速降低而脫離MⅡ期，完成減數(shù)第二次分裂。

3.3 聯(lián)合激活 通常采用的聯(lián)合激活法有以下幾種：①電激活+6-DMAP，實驗表明該種激活方法具有更多的細胞數(shù)和更高的囊胚形成率，電激活后用5 mmol/L的6-DMAP作用3 h，有34.3%的孤雌激活卵細胞發(fā)育到囊胚期；②電激活+CHX，電激活后用CHX處理可使激活率達97%，有90.6%的激活胚胎形成了核[3]；③電激活+ CB+6-DMAP，對牛的實驗表明，電激活+CB+6-DMAP聯(lián)合激活下卵裂率、囊胚率和融合率最高，對重構(gòu)胚的發(fā)育十分有效[5]。